鄧奕輝 李銀 譚琥 覃弘宇 李定祥

摘要：目的 比較解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對(duì)凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷蛋白酶活化受體（PAR）-1、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2表達(dá)的差異。方法 灌胃給藥制備大鼠藥物血清和藥物血漿。采用三氣培養(yǎng)箱和無糖DMEM培養(yǎng)液造成細(xì)胞缺氧模擬缺血，并同時(shí)加入150 U/mL凝血酶，建立體外缺氧合并凝血酶誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、藥物血清組及藥物血漿組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞PAR-1、ERK1/2 mRNA表達(dá)，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞PAR-1、ERK1/2蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）；與模型組比較，藥物血清組和藥物血漿組PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)下降（P<0.05，P<0.01）；藥物血漿組PAR-1、ERK1/2表達(dá)較藥物血清組下降（P<0.05）。結(jié)論 解毒化瘀方藥物血漿抗缺氧合并凝血酶誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷作用優(yōu)于其藥物血清。

關(guān)鍵詞：解毒化瘀方；藥物血漿；藥物血清；PC12細(xì)胞；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.019

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）06-0073-04

Abstract： Objective To compare the differences between Jiedu Huayu Prescription containing serum and plasma on PAR-1， ERK1/2 expression of the PC12 cell injury model. Methods Rat serum containing and plasma models was prepared through gavage. Three gas incubators and sugar-free DMEM medium simulated ischemia caused by hypoxia were used， and 150 U/mL of thrombin was added， with a purpose to establish the thrombin-induced hypoxic PC12 cell injury model. The experiment was divided as control group， model group， serum containing group and plasma containing group. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression levels of PAR-1 and ERK1/2 mRNA in each group； immunofluorescence was used to detect the protein expressions of PAR-1 and ERK1/2. Results Compared with the control group， the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in model group were enhanced （P<0.05）； compared with the model group， the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in serum containing group and plasma containing group decreased （P<0.05， P<0.01）； the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in plasma containing group decreased more significantly than serum containing group （P<0.05）. Conclusion Jiedu Huayu Prescription containing plasma was superior to its containing serum against the injury of PC12 cell induced by hypoxic and thrombin.

Key words： Jiedu Huayu Prescription； plasma containing medicine； serum containing medicine； PC12 cells； rats

中藥血清藥理學(xué)是指將中藥或中藥復(fù)方經(jīng)口給動(dòng)物灌服一定時(shí)間后采集動(dòng)物血液、分離血清，用此含有藥物成分血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)[1]。然而，近年來不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方或單味藥藥物血清與血漿在成分和作用上存在差異，且在大多數(shù)情況下，中藥藥物血漿較藥物血清具有優(yōu)勢(shì)。

近年來，急性缺血性中風(fēng)的中醫(yī)病機(jī)理論取得重大突破，其中王永炎院士提出的“毒損腦絡(luò)”病機(jī)假說得到了廣泛的研究[2-6]。本課題組認(rèn)為，缺血性中風(fēng)主要病機(jī)瘀血阻滯、毒損腦絡(luò)的形成與凝血酶毒性相關(guān)，化瘀解毒法是該病的有效治法。解毒化瘀方為基于“瘀毒”理論的中藥復(fù)方，由黃連、黃芩、黃柏、梔子等8味中藥組成。而凝血酶正是通過與蛋白酶活化受體（protease-activated receptor，PAR）結(jié)合發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，同時(shí)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2系統(tǒng)在凝血酶誘導(dǎo)的腦耐受中發(fā)揮重要作用。故基于本課題組前期體外缺氧合并凝血酶誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的建立，研究該方藥物血清與藥物血漿對(duì)上述模型PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)的差異，為血漿藥理學(xué)方法的提出提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠32只，5周齡，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)于室溫18～20 ℃、濕度65%～70%環(huán)境，自由飲水飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

PC12細(xì)胞，來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，高分化、永生性，長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司，編號(hào)2015032007。

1.3 藥物及制備

解毒化瘀方（黃連9 g，黃芩6 g，黃柏6 g，梔子9 g，紅花9 g，川芎12 g，赤芍12 g，地龍9 g）飲片購(gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房。第1次加4倍量蒸餾水，煎煮1 h，濾出煎液，第2次加2倍量蒸餾水，煎煮30 min，合并2次煎液，過濾濃縮至2 g/mL原藥材藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基，美國(guó)HyClone公司；胰蛋白酶，Sango公司；鏈霉素青霉素混合溶液（100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2），GIBICO公司；胎牛血清，美國(guó)HyClone公司。凝血酶，中國(guó)Solarbio試劑公司；Trizol，Invitrogen公司；SYBR Green PCR試劑盒，Thermo公司，批號(hào)#K0223；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas公司，批號(hào)#K1622；一抗-蛋白酶活化受體（PAR-1），sc-13503，Santa Cruz公司；二抗-TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，CW0152，康為世紀(jì)公司；一抗-p44/42MAPK（ERK1/2），#9102，Santa Cruz公司；二抗-TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG，CW0160，康為世紀(jì)公司。普通CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)賀利氏，Heracell），三氣培養(yǎng)箱（Thermo，3131），Real-time檢測(cè)儀（ABI公司，ABI-7300），低溫冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，TG-16M），電動(dòng)勻漿機(jī)（FLUKO，PRO200），旋渦振蕩器（青浦瀘西儀器廠，K30），激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯，CSC6F24407）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物血清與藥物血漿制備

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為空白血漿組、空白血清組、藥物血漿組、藥物血清組，每組8只，藥物血漿組和藥物血清組每日給予解毒化瘀方煎液36.4 g/kg灌胃（按動(dòng)物體表面積劑量換算，相當(dāng)于5倍臨床等效劑量），空白血漿組和空白血清組予等量蒸餾水灌胃。藥液濃度為2 g/mL，每只給藥體積按36.4 g/kg換算，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥前禁食12 h，末次給藥后1 h，腹腔注射10%水合氯醛（1 mL/250 g）麻醉，無菌條件下腹主動(dòng)脈采血。血清組所采血液置于普通采血管，37 ℃水浴30 min，置于4 ℃冰箱過夜，凝固后3000 r/min離心15 min，取上清液為血清。血漿組所采血液置于抗凝管內(nèi)（所含抗凝劑為1.5%EDTA-Na2，血液∶抗凝劑=9∶1），輕顛3次，使抗凝劑與血液充分混合，3000 r/min離心15 min，取上清液為血漿。將制備好的血清與血漿過濾除菌后分裝，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧缺血損傷模型的建立

PC12細(xì)胞用10%胎牛血清，1%100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素混合溶液，90%DMEM高糖培養(yǎng)基配成的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中，2 d換液1次，待細(xì)胞成長(zhǎng)融合后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.18 mL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁后再加終濃度為50 μg/L神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分化72 h[7]棄原培養(yǎng)液，加入含150 U/mL凝血酶的無血清低糖培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中（5%CO2、1%O2、94%N2）培養(yǎng)模擬缺氧缺血過程，12 h后取出。

2.3 分組

取誘導(dǎo)分化72 h后、融合80%以上PC12細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為空白組、模型組、藥物血漿組和藥物血清組。模型組、藥物血漿組和藥物血清組均需加入含150 U/mL凝血酶的無血清低糖培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，空白組加入完全培養(yǎng)液普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h后，棄原培養(yǎng)液，模型組、藥物血漿組和藥物血清組分別加入完全培養(yǎng)液、含10%藥物血漿完全培養(yǎng)液、含10%藥物血清完全培養(yǎng)液，空白組則加入等量完全培養(yǎng)液，均置于普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后備檢。 2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞蛋白酶活化受體-1、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 mRNA表達(dá) 引物合成：引物設(shè)計(jì)合成純化均由Invitrogen Biotechnology Co.，LTD中國(guó)公司完成，所用引物見表1。細(xì)胞總RNA的提?。喊凑赵噭┖姓f明提取細(xì)胞RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度，并進(jìn)行RNA定量。PCR條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性45 s，60 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物分析：取PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察條帶，數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析。各標(biāo)本重復(fù)3次，取其平均值。

2.4.2 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞蛋白酶活化受體-1、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后PBS洗3次×10 min，加4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次×10 min，加0.5%Triton穿孔10 min，PBS洗3次×10 min，加5%胎牛血清封閉30 min，加一抗（1∶200封閉液稀釋），4 ℃過夜，PBS洗3次×10 min，加TRITC標(biāo)記的抗小鼠熒光二抗（1∶50封閉液稀釋），室溫避光30 min，PBS洗3次×10 min，加Hoechst33258（1∶200）核染10 min，PBS洗3次×10 min后，加甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察，以平均熒光強(qiáng)度值反映蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以—x±s表示。組間比較用方差分析，組間兩兩比較，方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnet'T3檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對(duì)模型大鼠蛋白酶活化受體-1、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)增強(qiáng)（P<0.01）；與模型組比較，藥物血清組和藥物血漿組PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)下降（P<0.05，P<0.01）；藥物血漿組PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)較藥物血清組下降（P<0.05）。結(jié)果見表2。

4.2 解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對(duì)模型大鼠蛋白酶活化受體-1、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組PAR-1、ERK1/2蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P<0.01）；與模型組比較，藥物血清組和藥物血漿組PAR-1、ERK1/2蛋白表達(dá)下降（P<0.05，P<0.01）；其中，藥物血漿組PAR-1、ERK1/2蛋白表達(dá)較藥物血清組下降（P<0.05）。結(jié)果見表3、圖1、圖2。

5 討論

中藥血清藥理學(xué)不僅具有體外實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，如條件可控性強(qiáng)，可以進(jìn)行大量的藥理效應(yīng)實(shí)驗(yàn)觀察，較整體動(dòng)物容易控制，并可在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平進(jìn)行超微、生化、受體、基因等方面的研究，揭示藥物作用機(jī)理較為深入，重復(fù)性好，使用材料少等，而且避免了中藥粗制劑直接進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的缺陷，更加接近中藥經(jīng)消化吸收后在體內(nèi)產(chǎn)生的作用。然而，經(jīng)消化道吸收的中藥有效成分在體內(nèi)進(jìn)入的是血漿，而非血清。不同于血漿，血清是血液凝固后除去纖維蛋白與血細(xì)胞的液體成分，血液凝固過程及其激發(fā)的一系列生物學(xué)反應(yīng)不僅明顯改變了血液成分，而且對(duì)中藥成分與其派生物質(zhì)可能產(chǎn)生影響。2003年，有學(xué)者查閱我國(guó)大量發(fā)表的有關(guān)“血清藥理學(xué)”的論著，發(fā)現(xiàn)絕大部分其實(shí)是“血漿藥理學(xué)”，只有少部分是真正的血清藥理學(xué)[8]；同時(shí)也有學(xué)者從血液生理的角度通過實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，某些情況下血漿藥理學(xué)方法能更好地再現(xiàn)體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生的藥理效應(yīng)[9]。因此，賀氏等[10]提出了“血漿藥理學(xué)方法”。

近年來，凝血酶在急性缺血性中風(fēng)發(fā)生發(fā)展中的作用受到了學(xué)術(shù)界的重視，凝血酶不僅是血液凝固、血栓形成的關(guān)鍵水解酶，而且也通過與PAR結(jié)合發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。因此，以凝血酶為靶點(diǎn)來研究急性缺血性中風(fēng)具有重要價(jià)值。PAR介導(dǎo)的凝血酶反應(yīng)在腦損傷中具有雙重作用，凝血酶在低濃度時(shí)誘導(dǎo)腦耐受性，而在高濃度時(shí)對(duì)腦細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)而加重對(duì)腦組織的損害，以上過程是通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲/蘇氨蛋白激酶，可將胞外刺激信號(hào)傳遞給胞核，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)。ERK是MAPK家族的一員，屬絲/蘇氨酸蛋白激酶，正常定位于胞漿，當(dāng)激活后轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。ERK家族有5個(gè)亞族，包括ERK1～ERK5，其中ERK1/2系統(tǒng)在凝血酶誘導(dǎo)的腦耐受中發(fā)揮重要作用。ERK1/2磷酸化可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，但持續(xù)的磷酸化能導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫熒光法檢測(cè)解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對(duì)凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物血漿抗凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷作用強(qiáng)于藥物血清。這可能是因?yàn)檠和ㄟ^凝血形成血清的過程中，激活了許多酶類物質(zhì)以及血小板和白細(xì)胞，這些活性物質(zhì)可能會(huì)產(chǎn)生能降解中藥有效成分的作用。同時(shí)，凝血過程中形成的纖維蛋白及其網(wǎng)絡(luò)的血細(xì)胞很可能會(huì)吸附或結(jié)合一些中藥有效成分，從而減少中藥有效成分，造成效應(yīng)減弱。因此，對(duì)于使用藥物血漿和藥物血清均可的實(shí)驗(yàn)，藥物血漿能更真實(shí)地反映藥物療效。

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（收稿日期：2015-10-24）

（修回日期：2015-11-17；編輯：華強(qiáng)）