章寶燕 林擁華 林志強 張國偉 陳婷婷

摘要：目的 觀察黃芩苷對肝臟缺血再灌注損傷大鼠肝組織形態(tài)、肝細胞凋亡、誘生型一氧化氮合酶（iNOS）和核因子（NF）-κB mRNA表達及Caspase-3蛋白表達的影響，探討其作用機制。方法 采用Pringle's法建立大鼠肝臟缺血再灌注模型。實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組、黃芩苷組，假手術組、模型組給予生理鹽水灌胃，黃芩苷組給予黃芩苷灌胃。觀察大鼠肝臟組織病理形態(tài)，TUNEL法檢測肝細胞凋亡指數，RT-PCR檢測肝組織iNOS、NF-κB mRNA表達，Western blot檢測Caspase-3蛋白表達。結果 與假手術組比較，模型組iNOS和NF-κB mRNA表達、Caspase-3蛋白表達水平及肝細胞凋亡指數升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，黃芩苷組iNOS和NF-κB mRNA表達、Caspase-3蛋白表達水平及肝細胞凋亡指數下降（P<0.05），肝損害明顯改善。結論 黃芩苷通過下調肝組織iNOS和NF-κB的表達、抑制Caspase-3介導的細胞凋亡，對缺血再灌注損傷大鼠肝臟發(fā)揮保護作用。

關鍵詞：黃芩苷；保肝作用；缺血再灌注損傷；誘生型一氧化氮合酶；核因子-κB；Caspase-3蛋白；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.016

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）06-0060-04

Abstract： Objective To observe the effects of baicalin on forms of hepatic tissue， liver apoptosis， mRNA expressions of iNOS， NF-κB and protein expression of Caspase-3 in rats with ischemia reperfusion injury； To discuss its mechanism of action. Methods The rat models of liver ischemia reperfusion were performed according to the Pringle's method. Rats were randomly divided into sham-operation group， model group and baicalin group. Sham-operation group and model group were given normal saline for gavage， while baicalin group was given baicalin for gavage. Morphological characteristic was observed by HE staining. Hepatocyte apoptosis was determined by TUNEL. The mRNA expressions of iNOS and NF-κB were determined by RT-PCR. The protein expression of Caspase-3 was determined by Western blot. Results Compared with the sham-operation group， mRNA expressions of iNOS and NF-κB and the protein expression of Caspase-3 in the model group increased， as well as liver apoptosis rate （P<0.05， P<0.01）； compared with the model group， mRNA expressions of iNOS and NF-κB and the protein expression of Caspase-3 in the baicalin group decreased， as well as liver apoptosis rate （P<0.05）， and the hepatic lesion significantly improved in the baicalin group. Conclusion Baicalin can restrain Caspase-3 induced apoptosis by reducing the expressions of iNOS and NF-κB， with a purpose to realize the hepatoprotective effect for liver of rats with ischemia reperfusion injury.

Key words： baicalin； hepatoprotective effect； ischemia reperfusion injury； iNOS； NF-κB； Caspase-3 protein； rats

肝臟缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）臨床常見，可引起嚴重的肝臟和臨近器官衰竭。IRI后體內活性氧（ROS）增加，刺激肝臟枯否細胞合成核因子（NF）-κB，激發(fā)促炎因子“級聯(lián)反應”，引起肝細胞損傷。凋亡也是IRI引起細胞損傷的重要原因之一，其主要機制與Caspase-3介導的線粒體信號轉導途徑的抑制有關。研究表明，一氧化氮（NO）在IRI過程具有重要作用，其合成受酶的影響，由誘生型一氧化氮合酶（iNOS）催化產生的NO在IRI過程中發(fā)揮細胞損傷作用[1]。黃芩的主要有效成分黃芩苷具有抗炎、抗菌作用。本實驗建立大鼠肝臟IRI模型，觀察黃芩苷對肝臟IRI大鼠肝組織形態(tài)、肝細胞凋亡、iNOS及NF-κB mRNA表達、Caspase-3蛋白表達的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠60只，體質量200～250 g，中國科學院上海實驗動物中心，合格證號SCXK（滬）2012-0001。飼養(yǎng)于明暗交替12 h/12 h清潔環(huán)境，自由飲食飲水。

1.2 藥物

黃芩苷，Sigma公司，純度>95%，批號21967-41-9。

1.3 主要試劑與儀器

總RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒（Invitrogen，美國），dNTPs、Taq DNA聚合酶和一步法TUNEL試劑盒（美國Promega公司），兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體、辣根過氧化物酶標志羊抗兔多克隆抗體、GAPDH（Santa Cruz公司），總蛋白抽提試劑盒（南京凱基生物技術公司）。光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司），石蠟切片機（美國Beckman），基因擴增儀（BIO-RAD Myeyeler），臺式低溫高速離心機（Heraeus instrnnlents，德國），穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀、水平電泳槽、紫外分光光度計（BIO-RAD，美國），蛋白核酸分析儀（Beckman，德國）。

2 實驗方法

2.1 造模

采用Pringle's法建立肝臟缺血再灌注模型[2]。大鼠禁食12 h，自由飲水，并預先經大鼠尾靜脈注射0.5%肝素生理鹽水（2 mg/kg）行肝素化，術前用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，常規(guī)消毒術野，上腹部劍突下切口切開進腹，游離肝臟，分離門靜脈、肝動脈和膽總管，使用無損傷血管夾阻斷肝左、中葉的血流，直至肝葉變白，阻斷30 min，恢復血流為再灌注；假手術組打開腹腔、游離肝臟后即關腹。

2.2 分組及給藥

實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組、黃芩苷組，各組均于術前30 min經大鼠尾靜脈給藥。假手術組、模型組給予生理鹽水2 mL灌胃，黃芩苷組給予黃芩苷溶液200 mg/kg灌胃。各組均于再灌注后6 h留取肝組織標本。麻醉狀態(tài)下打開大鼠腹腔，留取大小約1 cm×1 cm×1 cm肝中葉組織2塊，一塊快速置于10%中性甲醛中固定24 h保存?zhèn)溆?；另一塊修剪成大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝組織3塊，標記后迅速放入液氮罐中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肝組織病理觀察

取出中性甲醛固定肝組織塊，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察肝組織形態(tài)。

2.4 肝細胞凋亡檢測

TUNEL法檢測肝臟凋亡細胞，按照試劑盒說明進行操作。鏡下觀察凋亡細胞，細胞核呈棕黃色為陽性細胞。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野觀察，計算細胞凋亡指數（AI）。AI（%）=凋亡細胞數÷總細胞數×100%。

2.5 RT-PCR檢測肝組織一氧化氮合酶、核因子-κB mRNA表達

采取Trizol一步法，按照試劑盒說明制備總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度儀鑒定后，將總RNA依據反轉錄試劑盒說明反轉錄成cDNA。引物序列見表1。iNOS反應條件：94 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；NF-κB反應條件：94 ℃變性15 s、60℃退火35 s、72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)。分別取8 ?L Marker、產物于2%瓊脂糖凝膠膜上電泳30 min，置于凝膠成像分析儀中，于254 nm處紫外燈下照相，分析電泳圖中條帶灰度得出數據，計算每個標本iNOS、NF-κB、β-actin的灰度比值，對其mRNA表達水平進行半定量分析。

2.6 Western-bolt檢測肝組織Caspase-3蛋白表達

按照試劑盒說明書提取各組總蛋白，BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。根據濃度上樣進行SDS-PAGE電泳后，轉膜到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉TBST液常溫封閉1 h后，分別加一抗（Caspase-3，1∶1000）4 ℃孵育過夜，次日TBST漂洗后，加二抗（1∶2000）常溫孵育1 h，再TBST漂洗，ECL化學發(fā)光液孵育后曝光。應用Quantity One軟件進行灰度掃描分析，結果以Caspase-3/GAPDH比值表示。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析，方差不齊者用秩和檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 肝組織病理觀察結果

假手術組肝小葉結構完整，界板排列整齊，匯管區(qū)無增寬、破壞，未見肝細胞變性及炎細胞浸潤；模型組肝小葉結構紊亂，肝血竇瘀血明顯，肝竇狹窄，肝索排列嚴重不規(guī)則，中央靜脈周圍肝細胞腫脹及空泡樣變性、有明顯點狀壞死，肝竇內大量炎性細胞聚集、浸潤；黃芩苷組肝小葉結構破壞和肝血竇瘀血程度較模型組輕，肝小葉結構基本正常，細胞變性不明顯，炎性細胞浸潤較少，肝細胞輕度腫脹，未見明顯肝細胞壞死。結果見圖1。

4.2 黃芩苷對模型大鼠肝細胞凋亡的影響

假手術組肝實質幾乎未見凋亡肝細胞；模型組肝實質內凋亡細胞明顯增多，主要集中于中央靜脈周圍，匯管區(qū)亦可見凋亡細胞；黃芩苷組肝實質凋亡細胞數量明顯減少，見圖2。模型組和黃芩苷組肝細胞AI均較假手術組明顯升高（P<0.01），見表1。

4.3 黃芩苷對模型大鼠肝組織一氧化氮合酶、核因子-κB mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組iNOS、NF-κB mRNA水平明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芩苷組iNOS、NF-κB mRNA表達水平明顯降低（P<0.05）。結果見圖3。

4.4 黃芩苷對模型大鼠Caspase-3蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組Caspase-3蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芩苷組Caspase-3蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。結果見圖4。

5 討論

研究表明，黃芩及其有效成分對心肌、腦組織及肝臟IRI具有保護作用[3-5]，其有效成分包括3種黃酮類化合物即漢黃芩素、黃芩素元和黃芩苷[6]。黃芩苷預處理的時機及濃度文獻報道不一。根據文獻報道及其藥代動力學資料，我們選擇造模前30 min進行預處理[7]。結果顯示，黃芩苷干預后大鼠受損肝臟病理學表現明顯改善。

肝臟IRI發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著顯著的炎癥反應，缺血后局部產生大量細胞因子、黏附分子、代謝產物、補體等。研究顯示，下調iNOS的表達可減少其產物NO的生產，在肝臟IRI過程中發(fā)揮保護作用。NOS是NO的合成限速酶，是調節(jié)NO合成的重要因素，由iNOS催化產生的NO在IRI過程中發(fā)揮細胞損傷作用。研究顯示，黃芩苷可在iNOS激活的后期階段發(fā)揮抑制作用，抑制NO的過量生產[10]，提示黃芩苷可能是iNOS合成的潛在抑制因子。本實驗結果顯示，黃芩苷干預后，大鼠IRI肝臟組織中性細胞浸潤減少，iNOS、NF-κB基因表達水平降低。有研究表明，NF-κB是許多編碼促炎癥介質的炎癥相關基因轉錄過程中的關鍵調節(jié)因子，黃芩苷可抑制NF-κB的激活[8]。

缺血性細胞死亡主要有2個途徑——細胞壞死和細胞凋亡，其中凋亡被認為在IRI的發(fā)展結局中具有重要的作用。本研究應用TUNEL法檢測發(fā)現，大鼠IRI 6 h后，肝細胞凋亡達到高峰期，凋亡肝細胞主要集中于肝小葉中央區(qū)，表現為核染色質和細胞質凝固、細胞核和細胞膜扭曲。黃芩苷干預后，末端標記陽性肝細胞數量明顯減少，提示黃芩苷可能通過抑制細胞凋亡限制肝細胞的延遲性死亡。Caspase-3是Caspase依賴細胞凋亡信號通路誘導細胞凋亡過程中的最終效應器。而且，有研究表明，Caspase-3在大鼠冷IRI的肝臟中表達、激活和降解[10]。本研究結果顯示，黃芩苷可顯著抑制Caspase-3在IRI 6 h后大鼠肝臟中的表達水平。

總之，黃芩苷在大鼠肝臟經歷IRI后發(fā)揮保護作用，其抗炎和抗凋亡作用可能與下調受損肝臟組織iNOS、NF-κB、Caspase-3的表達有關。

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（收稿日期：2015-08-03）

（修回日期：2015-09-08；編輯：華強）