肖新?lián)Q　闕萬(wàn)才　黃寧　劉峰　蘇煒華　吳期濱　蘇亞春

摘 要 為了解14-3-3基因在甘蔗黑穗病抗性中的作用，本研究以課題組前期構(gòu)建的甘蔗抗黑穗病抑制消減雜交文庫(kù)中篩選出的1個(gè)與14-3-3基因同源的EST序列作為探針，利用電子克隆和RT-PCR方法從甘蔗ROC22品種中分離到1個(gè)Sc14-3-3基因（GenBank Accession Number：KJ577592），并對(duì)其序列信息和基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該基因ORF長(zhǎng)771 bp，編碼256個(gè)氨基酸殘基；Sc14-3-3是定位于細(xì)胞質(zhì)的親水蛋白，無(wú)跨膜螺旋區(qū)及信號(hào)肽，有10個(gè)Ser、3個(gè)Thr和7個(gè)Tyr潛在的磷酸化位點(diǎn)，并在N-端有4個(gè)蛋白結(jié)合區(qū)和1個(gè)多核苷酸結(jié)合區(qū)，對(duì)翻譯和能量新陳代謝起著重要作用；該蛋白屬非ε類群，其N-端和中間區(qū)域在不同物種間相對(duì)保守，C-端差異相對(duì)較大?；虮磉_(dá)模式分析顯示，Sc14-3-3基因可能參與甘蔗對(duì)生物逆境的細(xì)胞免疫響應(yīng)，其對(duì)MeJA介導(dǎo)的信號(hào)途徑應(yīng)答較SA和ABA早；黑穗病菌脅迫下，Sc14-3-3基因在甘蔗抗感品種中的表達(dá)模式存在差異，其在抗黑穗病品種YC05-179中上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量變化明顯，揭示了該基因參與甘蔗對(duì)黑穗病的應(yīng)答反應(yīng)。以上結(jié)果為甘蔗Sc14-3-3基因的功能研究積累了一定的基礎(chǔ)資料，并為今后甘蔗的抗病分子育種提供后備基因資源。

關(guān)鍵詞 甘蔗；14-3-3基因；生物信息學(xué)；熒光定量PCR

中圖分類號(hào) S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to understand the function of 14-3-3 gene in sugarcane smut resistance， based on an EST highly similar to 14-3-3 gene selected from the suppression subtractive hybridization library corresponding to sugarcane smut resistance， we cloned a Sc14-3-3 gene（GenBank Accession Number： KJ577592）from sugarcane ROC22， by electronic cloning using this EST as the probe to search the dbEST couple with RT-PCR amplification method. Sequence information and expression patterns of Sc14-3-3 gene were analyzed. The results showed that the Sc14-3-3 gene contained a complete ORF（771 bp）encoding 256 amino acid residues. Sc14-3-3 was a hydrophilic protein without signal peptides and transmembrane helix localized in the cytoplasm. The protein contained 10 serine， 3 threonine and 7 tyrosine potential phosphorylation sites and had four protein binding regions and a polynucleotide binding domain in its N-end， which played an important role in the translation and energy metabolism. Amino acid homology analysis revealed that the protein belonged to non-ε groups， and its N-terminal and middle regions were relatively conservative in different species， C-terminal relatively larger difference. The expression analysis showed that the Sc14-3-3 gene might be involved in the immune response which was caused by biotic stress. The quantitative results suggested an earlier reply to MeJA signaling pathway than in SA and ABA stresses. Under the smut pathogen stress， the expression patterns of Sc14-3-3 were different between sugarcane susceptible cultivar ROC22 and resistant cultivar YC05-179. Compared with ROC22， Sc14-3-3 gene was up-regulated and had significant expression change in YC05-179. The phenomenon indicated that the Sc14-3-3 gene involved in the smut resistance of sugarcane cultivars. This study will accumulate the basic information for its functions to further identified， and provide back-up genetic resources for future molecular disease-resistant breeding in sugarcane.

Key words Sugarcane； 14-3-3 gene； Bioinformatics； Real-time PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.019

1967年，Mooore等[1]在牛腦細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)一種大小在25～32 ku之間的異源二聚體酸性可溶蛋白，根據(jù)二乙氨乙基纖維素柱（DEAE cellulose）層析分離出片段數(shù)及其在淀粉凝膠電泳上的遷移率，命名為14-3-3蛋白。在之后的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，14-3-3蛋白被認(rèn)為是一種腦特異蛋白，直到它首次在4種不同的植物中得到報(bào)道，即大麥（Hordeum vulgare）[2]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[3]、菠菜（Spinacia oleracea）和月見(jiàn)草（Oenothera biennis）[4]。隨后的研究顯示，14-3-3蛋白存在于幾乎所有的真核生物中[5]。迄今，已在多種植物中分離克隆到該蛋白基因，如大麥[2]、菠菜和月見(jiàn)草[3]、水稻（Oryza sativa）[6]、玉米（Zea mays）[7]、橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）[8]、擬南芥[3，9]等。研究表明，14-3-3蛋白的分布具有組織特異性，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中[10]，同時(shí)也分布于質(zhì)膜[11]、類囊體膜[12]、線粒體基質(zhì)[13]、葉綠體基質(zhì)[14]以及細(xì)胞核[15]上。Sehnke等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白在亞細(xì)胞中的定位與其蛋白結(jié)構(gòu)上的不同異構(gòu)型有關(guān)。此外，研究還揭示14-3-3蛋白序列高度保守，不同家族成員在結(jié)構(gòu)上都表現(xiàn)出極大的相似性[18]。動(dòng)植物14-3-3蛋白同工型具有70%的相似性，然而卻不存在進(jìn)化的同源性[19]。

前人研究表明，14-3-3蛋白屬于生物細(xì)胞中重要的調(diào)節(jié)蛋白，通常以同源或者異源二聚體的形式存在，通過(guò)識(shí)別特異的磷酸化序列，與多種靶標(biāo)信號(hào)蛋白結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)[20]。其中，磷酸化的絲氨酸和蘇氨酸殘基的靶蛋白較易與14-3-3蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)植物的基礎(chǔ)代謝、物質(zhì)運(yùn)輸及植物病害和脅迫應(yīng)答反應(yīng)等[21]。Seehaus等[22]利用DDRT-PCR（differential display reverse transcription PCR，差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR）技術(shù)篩選感染假單孢菌（Pseudomonas syringae pv. glycinea）大豆（Glycine max）的超敏反應(yīng)中的差異表達(dá)基因，獲得了一個(gè)表達(dá)量增加的14-3-3基因。Hill等[23]在所構(gòu)建的棉花（Gossypium spp.）根部感染枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）24 h的文庫(kù)中，檢測(cè)到了14-3-3基因的轉(zhuǎn)錄積累。Finnie等[24]在無(wú)毒白粉病菌（Blumeria graminis）感染后的大麥表皮細(xì)胞層中，發(fā)現(xiàn)14-3-3基因和H+-ATP酶基因的表達(dá)量增加，同時(shí)14-3-3蛋白和H+-ATP酶復(fù)合物同步增加。蔡英卿等[25]以龍眼（Dimocarpus longan）為研究材料發(fā)現(xiàn)，龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中，在與轉(zhuǎn)錄因子相互作用下，14-3-3蛋白參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控胚性相關(guān)基因的表達(dá)；同時(shí)，該蛋白在結(jié)合質(zhì)膜H+-ATP酶和鉀離子通道蛋白后，參與龍眼體胚發(fā)生過(guò)程胚性維持或形態(tài)建成。Yan等[26]以擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，使用酵母雙雜技術(shù)證實(shí)，錨蛋白重復(fù)序列和14-3-3蛋白家族可以相互作用并參與介導(dǎo)防衛(wèi)應(yīng)答的PR1表達(dá)負(fù)調(diào)控。羅煉芳等[27]研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗（Saccharum spp.）14-3-3基因（GenBank Accession Number：AY222859）在不同組織中均有表達(dá)，且在甘蔗的莖中，14-3-3基因有著較高的表達(dá)水平，推測(cè)14-3-3基因可能參與了多種信號(hào)通路，并且與甘蔗的糖代謝相關(guān)。

甘蔗是世界上最重要的糖料作物，同時(shí)，甘蔗作為C4作物，具有較強(qiáng)的光合速度和干物質(zhì)積累能力，是最具有發(fā)展?jié)摿Φ目稍偕茉醋魑?。然而，在生產(chǎn)過(guò)程中，甘蔗病害和不良農(nóng)藝性狀嚴(yán)重影響甘蔗的生長(zhǎng)及產(chǎn)量。因此，抗性和優(yōu)良農(nóng)藝性狀的研究非常緊迫，而挖掘與此相關(guān)的基因是首要基礎(chǔ)。植物14-3-3蛋白與其靶蛋白相互作用，調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、參與生物和非生物脅迫及病原防衛(wèi)應(yīng)答[28]。目前，有關(guān)14-3-3基因的研究已有不少相關(guān)報(bào)道，但甘蔗中僅見(jiàn)有關(guān)14-3-3基因的組織特異性表達(dá)及其與糖代謝和礦物元素吸收之間關(guān)系的初步探討[27]，尚未見(jiàn)14-3-3基因在甘蔗抗病性中功能及其作用途徑的研究報(bào)道。

SSH（suppression subtractive hybridization，抑制消減雜交）技術(shù)以抑制PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，能夠高效、快速的篩選2個(gè)不同生物材料間的差異表達(dá)基因，尤其適合于甘蔗這種基因組尚不完全清晰的物種[29]。前期，本課題組利用SSH技術(shù)研究甘蔗抗黑穗病性的分子機(jī)制，獲得了一些與甘蔗黑穗病抗性相關(guān)的基因或ESTs。為此，本研究以黑穗病菌脅迫下，甘蔗ROC22品種SSH文庫(kù)中篩選出的與14-3-3基因同源的EST序列為探針，應(yīng)用電子克隆及RT-PCR技術(shù)從甘蔗中分離獲得Sc14-3-3蛋白基因，并對(duì)其序列特征與基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，以期獲得該基因功能的基礎(chǔ)資料，為研究甘蔗抗黑穗病分子機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)，及為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗黑穗病甘蔗品種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗品種ROC22（感黑穗病品種）和崖城05-179 （YC05-179，抗黑穗病品種）由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。具體研究材料如下：（1）取ROC22植株的側(cè)芽用于RT-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證；（2）水培法處理ROC22和YC05-179的蔗莖，并在蔗芽生長(zhǎng)點(diǎn)部位針刺接種5×106個(gè)/mL的黑穗病菌孢子，對(duì)照組接種無(wú)菌水。分別取0、24、48、72、120 h的蔗芽，用于生物逆境脅迫表達(dá)分析研究；（3）沙培法培育YC05-179的蔗莖至其長(zhǎng)出第四或第五葉，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的蔗苗洗凈沙子，于大燒杯中復(fù)水1周，分別用水楊酸（salicylic acid，SA，5 mmol/L）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA，100 μmol/L）和脫落酸（abscisic acid，ABA，100 μmol/L）進(jìn)行噴射葉面處理，并取處理6、12、24 h的蔗葉用于非生物逆境脅迫表達(dá)分析研究，同時(shí)以0 h未處理的蔗葉作為對(duì)照。以上所有取材均立即用液氮速凍，然后保存于-80 ℃冰箱，供實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測(cè)用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 采用Trizol法提取甘蔗材料的總RNA，經(jīng)檢測(cè)合格后再利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 甘蔗Sc14-3-3基因的電子克隆及RT-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證 以黑穗病菌脅迫下，甘蔗ROC22品種SSH文庫(kù)中篩選出的與14-3-3基因同源的EST序列為探針，在甘蔗EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行tblastn搜索，找到與此探針序列同源性較高的EST序列，并使用DNAStar軟件中的SeqMan對(duì)相關(guān)的Unigene進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)cDNA序列，然后運(yùn)用NCBI中的Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析該序列的保守結(jié)構(gòu)域，并用ORF Finder在線程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析其開(kāi)放閱讀框。

使用Primer 5.0對(duì)拼接獲得的電子克隆序列進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)，引物信息如表1中的Sc14-3-3a。參考TaKaRa公司的ExTaq酶說(shuō)明書，以ROC22蔗芽cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。其擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，當(dāng)產(chǎn)物片段大小與電子克隆預(yù)測(cè)大小相同時(shí)，使用Gel Extraction Kit純化回收該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行TA克隆并送測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用多種軟件及在線分析工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析，所用的主要數(shù)據(jù)庫(kù)及工具列于表2。

1.2.4 甘蔗Sc14-3-3基因的RT-qPCR引物設(shè)計(jì)及篩選 根據(jù)RT-qPCR引物設(shè)計(jì)原則，并以該目的基因的保守序列為參考，用AlleleID7.6軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，引物序列見(jiàn)表1中的Sc14-3-3b。將逆轉(zhuǎn)錄模板按照2倍稀釋法稀釋，反應(yīng)體系依SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Roche）說(shuō)明書進(jìn)行配置，按照程序（50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)）在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)每個(gè)樣品一式3份，反應(yīng)后進(jìn)行溶解曲線分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線制定，以鑒定引物的特異性及擴(kuò)增效率是否良好。

1.2.5 甘蔗Sc14-3-3基因的表達(dá)量測(cè)定及分析

分別以（1）ROC22和YC05-179接種黑穗病菌后0、24、48、72、120 h的蔗芽cDNA，（2）YC05-179經(jīng)SA、MeJA、ABA誘導(dǎo)0、6、12、24 h的葉片cDNA為模板進(jìn)行甘蔗Sc14-3-3基因的表達(dá)量測(cè)定。根據(jù)RT-qPCR引物的篩選結(jié)果，參考前人的研究選擇GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）作為內(nèi)參基因[30]（引物序列見(jiàn)表1中的GAPDH），反應(yīng)時(shí)每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。待擴(kuò)增程序結(jié)束后，在ABI PRISM7500 real-time PCR system軟件上對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步篩選分析后，導(dǎo)出定量數(shù)據(jù)文件，采用2-△△CT算法分析各基因的表達(dá)模式。數(shù)據(jù)分析結(jié)果由Excel表格計(jì)算得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sc14-3-3基因的電子克隆及RT-PCR驗(yàn)證

以黑穗病菌脅迫下，甘蔗ROC22品種SSH文庫(kù)中篩選出的與14-3-3基因同源的EST序列為探針，電子克隆到1條拼接序列，其具有完整的開(kāi)放讀碼框，編碼256個(gè)氨基酸，且包含14-3-3基因的保守序列，命名為Sc14-3-3基因（GenBank Accession Number：KJ577592）。實(shí)驗(yàn)以ROC22蔗芽的cDNA為模板進(jìn)行的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。PCR產(chǎn)物連接載體、轉(zhuǎn)化、測(cè)序后，經(jīng)NCBI中的blastp比對(duì)可知，該基因的氨基酸序列與羅煉芳等[27]報(bào)道的甘蔗Sc14-3-3蛋白相同，但編碼氨基酸的堿基及該基因的3′端卻有所差異（2.66%）（圖2），說(shuō)明甘蔗的不同品種之間對(duì)14-3-3基因有堿基偏好性，同時(shí)也暗示甘蔗Sc14-3-3家族基因中不同成員之間的序列差異可能主要體現(xiàn)在其3′位置。

2.2 Sc14-3-3基因編碼蛋白的氨基酸序列分析

Sc14-3-3基因推導(dǎo)編碼氨基酸序列的疏水性/親水性分析結(jié)果顯示，整條多肽鏈沒(méi)有明顯的疏水區(qū)，GRAVY值為-0.501，推測(cè)甘蔗Sc14-3-3蛋白是一種親水蛋白。由跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，Sc14-3-3蛋白沒(méi)有跨膜螺旋區(qū)，不是跨膜蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，Sc14-3-3蛋白不含信號(hào)肽。根據(jù)PredictProtein和NetPhos 2.0 Server在線軟件預(yù)測(cè)可知，該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)（圖3）；存在20個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，即10個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)和7個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)（圖4）；結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域位于N-端，包括4個(gè)蛋白結(jié)合區(qū)和1個(gè)多核苷酸結(jié)合區(qū)，以氨基酸殘基位點(diǎn)表示分別為第1、15、34、40和58位（圖5）。使用Profun 2.2 Server對(duì)甘蔗Sc14-3-3蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白的主要功能為翻譯和能量代謝。

2.3 Sc14-3-3基因編碼蛋白的同源比對(duì)及進(jìn)化分析

以甘蔗Sc14-3-3氨基酸序列為探針，使用NCBI中的BlastP程序，篩選出多個(gè)14-3-3蛋白。從中選取的谷子（Setaria italica_gb|XP_004968972.1|）、玉米（Zea mays_gb|NP_001151592.1|）、短花藥野生稻（Oryza brachyantha_gb|XP_006659421.1|）、高粱（Sorghum bicolor_gb|XP_002445779.1|）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon_gb|XP_003574509.1|）和田野貝母（Fritillaria agrestis_gb|AAC04811.1|）與甘蔗Sc14-3-3蛋白的氨基酸序列相似性分別為99%、99%、98%、98%、95%和91%。使用DNAMAN軟件中的多重比對(duì)功能，對(duì)甘蔗14-3-3蛋白的氨基酸序列與以上6個(gè)物種的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)（圖6），結(jié)果顯示，不同物種間，該蛋白的N-端和中間區(qū)域相對(duì)保守，C-端差異相對(duì)較大，推測(cè)該基因的結(jié)構(gòu)是甘蔗為適應(yīng)環(huán)境或生長(zhǎng)發(fā)育所致。

為進(jìn)一步研究Sc14-3-3蛋白的分類，從NCBI中選取了擬南芥和水稻的8個(gè)14-3-3蛋白，并用MEGA5.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖7）。結(jié)果表明，甘蔗Sc14-3-3蛋白與擬南芥GF14 φ、GF14 ψ、GF14 κ和水稻GF14 f聚在同一分支，擬南芥GF14 ε、GF12 ρ、GF14 μ和水稻GF14 g聚在另一分支。研究顯示，植物14-3-3蛋白主要分為2個(gè)類群：ε類群和非ε類群[19]。擬南芥GF14 φ、GF14 ψ、GF14 κ和水稻GF14 f為非ε類群，擬南芥GF14 ε、GF12 ρ、GF14 μ和水稻GF14 g為ε類群[6，31]，其中，14-3-3基因的ε類群不同于非ε類群的基因之處在于ε類群都有一個(gè)相同的外顯子結(jié)構(gòu)[31]，故推測(cè)該Sc14-3-3基因?qū)儆诜铅蓬惾?，無(wú)此外顯子結(jié)構(gòu)。

2.4 Sc14-3-3基因的RT-qPCR分析

2.4.1 Sc14-3-3基因引物的評(píng)估 采用2倍稀釋法稀釋ROC22蔗芽組織的cDNA模板，其濃度梯度分別為2-1，2-2，2-3，2-4，2-5。圖8為Sc14-3-3基因RT-qPCR產(chǎn)物的溶解曲線圖，由圖8可見(jiàn)，該基因擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線均為單峰，表明該引物（Sc14-3-3b）的特異性較高。根據(jù)CT值制定用于擴(kuò)增Sc14-3-3基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖9），其相關(guān)系數(shù)R2=0.995 8∈（0.99，1），表明該曲線的線性關(guān)系成立。引物的擴(kuò)增效率與曲線斜率相關(guān)，即擴(kuò)增效率（E）=10（1/斜率）-1，由此算出引物Sc14-3-3b的E=0.987∈（0.95，1.05），表明擴(kuò)增效率較高，可用于基因的定量表達(dá)分析研究。

2.4.2 甘蔗Sc14-3-3基因在SA、MeJA和ABA脅迫下的表達(dá)特性分析 SA[32]、MeJA[33]和ABA[34]等3種激素是良好的生物脅迫模擬劑。在SA、MeJA和ABA脅迫下，甘蔗Sc14-3-3基因的表達(dá)特性分析如圖10所示。具體地，SA、MeJA、ABA脅迫下，YC05-179中Sc14-3-3基因均上調(diào)表達(dá)，但表達(dá)情況卻有所不同：脅迫6～24 h的YC05-179材料中，MeJA處理下Sc14-3-3基因的相對(duì)表達(dá)量在6 h時(shí)急劇增加，約為0 h的4.21倍，之后表達(dá)量雖仍在增加，但增加的幅度逐漸降低；SA和ABA脅迫下Sc14-3-3基因的相對(duì)表達(dá)量均隨著處理時(shí)間的增加而增加，但在各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量均較MeJA脅迫下的要低。此外，在12 h時(shí)，SA和ABA脅迫對(duì)Sc14-3-3基因的表達(dá)量的影響效果相似，均約為對(duì)照組的2.00倍，但6 h時(shí)，SA脅迫下該基因的相對(duì)表達(dá)量大于ABA脅迫，24 h時(shí)卻與此相反。從以上研究結(jié)果可以推測(cè)，甘蔗Sc14-3-3基因與其響應(yīng)生物脅迫（比如黑穗病菌）的機(jī)制有關(guān)。

2.4.3 甘蔗Sc14-3-3基因在黑穗病菌脅迫下的表達(dá)特性分析 黑穗病菌脅迫下，甘蔗Sc14-3-3基因在ROC22和YC05-179材料中的表達(dá)特性分析如圖11所示。在ROC22材料中，無(wú)論是對(duì)照組還是處理組，甘蔗Sc14-3-3基因的表達(dá)都受到抑制，且隨處理時(shí)間的增加，其表達(dá)量的變化不明顯，但處理組的相對(duì)表達(dá)量普遍比對(duì)照組高，其中，24 h和48 h時(shí)表現(xiàn)最為顯著；YC05-179材料中，對(duì)照組的Sc14-3-3基因的表達(dá)受到抑制，且各處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量沒(méi)有明顯差異，而處理組中Sc14-3-3基因的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，120 h時(shí)，處理組和對(duì)照組中該基因的相對(duì)表達(dá)量相差最大。以上研究證明，本研究所克隆的Sc14-3-3基因在甘蔗抗性材料中積極應(yīng)答黑穗病菌脅迫，可能與甘蔗抗黑穗病性有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，信號(hào)分子通常使靶分子磷酸化，進(jìn)而激活或者抑制靶分子的生物活性[28]。然而，有研究表明，僅磷酸化并不足以完成信號(hào)調(diào)節(jié)全過(guò)程，還需要和14-3-3蛋白結(jié)合來(lái)完成靶蛋白的轉(zhuǎn)化從而調(diào)控其活性[35-37]。14-3-3蛋白在真核生物中廣泛存在且高度保守，調(diào)節(jié)生命活動(dòng)的許多過(guò)程[5，18]?；钚孕问降?4-3-3蛋白以二聚體形式，通過(guò)接頭或支架作用與發(fā)生磷酸化的目標(biāo)靶蛋白相應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[38-39]。14-3-3蛋白對(duì)不同靶蛋白的調(diào)節(jié)效應(yīng)差別很大，如可以導(dǎo)致靶蛋白激活、滅活、降解、穩(wěn)定性增高或者改變靶蛋白胞內(nèi)定位[40-42]，盡管如此，14-3-3蛋白與磷酸化靶蛋白結(jié)合從而調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程依然是廣泛存在的[35]。

本研究基于構(gòu)建的甘蔗SSH文庫(kù)，結(jié)合電子克隆技術(shù)和RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)，從甘蔗品種ROC22中克隆到了一個(gè)甘蔗14-3-3蛋白基因，命名為Sc14-3-3（GenBank Accession Number：KJ577592）。該基因包含14-3-3基因的保守序列，有完整的開(kāi)放讀碼框，編碼256個(gè)氨基酸，且其氨基酸序列與羅煉芳等[27]報(bào)道的甘蔗Sc14-3-3蛋白相同，但編碼氨基酸的堿基及該基因的3′端卻有所差異（2.66%），說(shuō)明是同一個(gè)14-3-3蛋白家族成員，但在自然進(jìn)化或人工選擇的過(guò)程中，甘蔗的不同品種之間對(duì)14-3-3基因有堿基偏好性。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該編碼蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜螺旋區(qū)，定位于細(xì)胞質(zhì)中。根據(jù)前人研究[43]，擬南芥14-3-3蛋白前體無(wú)信號(hào)肽，但它們分散于細(xì)胞核、生物膜或其它細(xì)胞腔隙中，目前普遍認(rèn)為14-3-3蛋白的亞細(xì)胞定位可由其靶蛋白的信號(hào)肽引導(dǎo)，或通過(guò)和靶蛋白的相互作用定位于它們復(fù)合體的所在區(qū)域[43-44]，因此，推測(cè)該甘蔗Sc14-3-3蛋白與其靶蛋白于細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行互作。PredictProtein和Profun 2.2 Server在線軟件預(yù)測(cè)顯示，該Sc14-3-3蛋白具有多個(gè)潛在的磷酸化（Ser、Thr、Tyr）位點(diǎn)，并在N-端有4個(gè)蛋白結(jié)合區(qū)和1個(gè)多核苷酸結(jié)合區(qū)，且對(duì)翻譯有一定的作用。有研究結(jié)果表明，14-3-3蛋白的每一單體都有1個(gè)靶蛋白結(jié)合位點(diǎn)[45-46]，穩(wěn)定的N-端氨基酸殘基區(qū)域有助于14-3-3蛋白二聚體的形成及某些靶蛋白的結(jié)合能力，而C-端直接參與蛋白質(zhì)間的相互作用[46]，推測(cè)2個(gè)甘蔗Sc14-3-3蛋白單體在N-端結(jié)合形成二聚體，并在C-端形成凹穴，作為靶蛋白的作用面[27]，同時(shí)，Sc14-3-3蛋白通過(guò)結(jié)合2個(gè)靶肽或1個(gè)靶肽的2個(gè)結(jié)構(gòu)域，在C-端進(jìn)行相互作用，增強(qiáng)/抑制翻譯作用、調(diào)控靶蛋白的活性或與其他蛋白的結(jié)合能力等[40]。

前人研究表明，14-3-3蛋白廣泛參與了植物對(duì)各種脅迫應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程及病原防衛(wèi)應(yīng)答反應(yīng)。大麥在抵御白粉病菌的過(guò)程中，14-3-3蛋白的累積量增加[24]；水稻OsGFl4b和OsGFl4g幾乎可被所有的脅迫和激素誘導(dǎo)[47]；小麥（Triticum aestivum）Ta14R1和Ta14R2基因均受ABA誘導(dǎo)而呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，通過(guò)依賴ABA的非生物脅迫響應(yīng)途徑發(fā)揮作用[48]；機(jī)械傷害或殼聚糖或甲基茉莉酸酮酯脅迫下，白云杉（Picea glauca）和雜交白楊（Populus tomentosa Carr）中14-3-3的轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)[49-50]。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了甘蔗Sc14-3-3基因受SA、MeJA和ABA誘導(dǎo)和黑穗病菌脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果表明，SA、MeJA、ABA誘導(dǎo)后，YC05-179中，該Sc14-3-3基因均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，且MeJA脅迫下各處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量都比SA和ABA高，表明該Sc14-3-3基因可能參與甘蔗對(duì)不同生物逆境[49-50]的細(xì)胞免疫響應(yīng)，且對(duì)MeJA介導(dǎo)的信號(hào)途徑應(yīng)答較早；尤其值得注意的是，無(wú)論是否經(jīng)黑穗病菌脅迫，ROC22中該Sc14-3-3基因都下調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量變化不大，而YC05-179中，該基因僅在黑穗病菌脅迫后的材料中上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，表明該Sc14-3-3基因在甘蔗抵御黑穗病的過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用，但抗感材料中Sc14-3-3基因?qū)谒氩∶{迫的應(yīng)答反應(yīng)不同，即在感黑穗病甘蔗材料中其調(diào)控模式應(yīng)該是負(fù)調(diào)控，而在抗黑穗病材料中，黑穗病菌的誘導(dǎo)使其調(diào)控模式相反，可能是抗性材料中某些特異調(diào)節(jié)蛋白的改變或靶蛋白的活性變化影響了Sc14-3-3基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究從甘蔗中克隆獲得了Sc14-3-3基因的全長(zhǎng)序列，并通過(guò)生物信息學(xué)手段及RT-qPCR技術(shù)，分析了該基因的特征及其表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)該基因可能介導(dǎo)甘蔗對(duì)黑穗病的抗性，但由于14-3-3蛋白存在多種同工型，并且在任一時(shí)刻都同時(shí)存在多種靶蛋白，因此，要想進(jìn)一步的明確該基因的功能，還需要更深入的研究。

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責(zé)任編輯：黃 艷