楊帆 宋林林 謝序澤 趙臻 周立帥 葉文雨 魯國東

摘 要 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是研究病原真菌生長發(fā)育及致病機理的重要模式生物。Rho家族蛋白是一類具有GTP酶活性的GTP結(jié)合蛋白，在多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著分子開關(guān)的作用。通過生物信息學(xué)方法分析MoRho2的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)域等信息，并推測其潛在功能。為進一步明確MoRho2蛋白的功能，利用基因敲除技術(shù)獲得MoRho2基因的敲除突變體。表型分析結(jié)果表明，與野生型菌株相比，MoRho2敲除突變體的菌絲生長速度、分生孢子形態(tài)、附著胞形態(tài)、產(chǎn)孢量、對植物的毒力等方面均無明顯的差異，但分生孢子萌發(fā)和附著胞形成略滯后于野生型菌株。突變體能夠產(chǎn)生正常的侵入栓并侵入洋蔥表皮。綜上所述，MoRho2基因可能參與稻瘟病菌分生孢子的萌發(fā)和附著胞的形成，結(jié)果為進一步揭示基因MoRho2的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 稻瘟病菌；MoRho2；基因敲除；功能分析

中圖分類號 S435.111 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract Rice blast fungus， Magnaporthe oryzae， is an important model for the study of the interaction between host plant and pathogenic fungus. Rho-family proteins act as molecular switches in signal transduction. In this study， we applied bioinformatics and gene knock-out techniques to study the function of MoRho2 in the fungus. Bioinformatics analysis showed that the gene had no signal peptide and transmembrane. A slight delay of conidium germination and appressorium development and a slight decrease of penetration pegs were observed in MoRho2 knock-out mutant， when compared to wild-type strain.However， the mutant was not affected in growth rate， conidiation and pathogenicity， probably on account of the gene redundancy of MoRho2 in the fungal genome. Taken together， it appeared more likely that MoRho2 regulated conidium germination and appressorium development of rice blast fungus. These results would help to well understand the biological function and the molecular regulation mechanism of MoRho2.

Key words Magnaporthe oryzae； MoRho2； Gene knock-out； Functional analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.024

Rho族蛋白是Ras超家族蛋白最主要成員之一，具有內(nèi)在的GTP酶活性，該家族成員有GTP結(jié)合的激活態(tài)和GDP結(jié)合的失活態(tài)2種狀態(tài)，它們之間的轉(zhuǎn)換受GEF、GAP、GDI這3種調(diào)控蛋白的調(diào)控，在調(diào)控細(xì)胞過程中發(fā)揮分子開關(guān)的作用[1]。真核生物的大量研究結(jié)果表明，Rho族蛋白調(diào)控細(xì)胞骨架相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑，起著調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)的建成、細(xì)胞極性、細(xì)胞運動、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄等過程[2-3]。

近年來，真菌中Rho族蛋白研究取得許多進展，Rho1，Rho2，Rho3和Rho4與真菌的細(xì)胞分化與極性生長有關(guān)。釀酒酵母（saccharomyces cerevisiae）中，Rho1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞完整性、細(xì)胞極性生長、肌動蛋白重排等過程[4]；Rho2結(jié)合到前纖維蛋白上，調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排[5]；裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）Rhol對隔膜的形成、細(xì)胞周期中細(xì)胞壁生長以及肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排密切相關(guān)[6]；Rho2參與調(diào)控細(xì)胞壁a-葡聚糖的生物合成，依靠調(diào)控胞漿移動對細(xì)胞分離進行調(diào)控[7]；Rho3與細(xì)胞分裂有關(guān)，對細(xì)胞極性以及細(xì)胞壁完整性是必需的[8]。

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是研究植物病原真菌與寄主互作的理想模式生物之一[9-10]。 稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫共有7個Rho族基因，分別是Rho1-4、RhoX、Rac1、Cdc42[11]。前期的研究結(jié)果表明，稻瘟病菌中MoRho3敲除突變體與野生型相比，附著胞形成滯后且形成率降低、對植物的致病性降低、分生孢子的形態(tài)從倒梨形突變成長橢圓形、產(chǎn)孢量減少、分生孢子萌發(fā)延遲等[12]；稻瘟病菌中Rac1影響分生孢子形成、發(fā)育以及對植物的致病性[13]；稻瘟病菌中MoCdc42敲除突變體的產(chǎn)孢量減少，分生孢子形態(tài)變細(xì)變長，影響植物的致病性[14]。基于以上研究，推測稻瘟病菌中Rho2蛋白同源物（MoRho2）在稻瘟病菌的生長發(fā)育中可能起到較為關(guān)鍵的作用，并有可能與其它Rho族蛋白共同在稻瘟病菌生長發(fā)育及其致病過程中的信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文對Rho2基因的功能進行分析，將有助于闡明稻瘟病菌Rho2所調(diào)控的生物學(xué)功能，為開展防治稻瘟病菌與生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與質(zhì)粒 稻瘟病菌野生型菌株△Ku70，MoRho2基因敲除突變體，MoRho2異位整合突變體均保存于本實驗室；供試質(zhì)粒pCX62保存于本實驗室。

1.1.2 植物材料 水稻品種CO39和大麥品種Gold Promise均保存于本實驗室。

1.2 方法

1.2.1 蛋白序列獲得及分析 以稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫中（http：//broad.harvard.edu/annotation/genome/magnaporthe_grisea/MultiHome.html）公布的MoRho2（MGG_02457.6）蛋白序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中用Blastp功能搜索其它真菌基因組數(shù)據(jù)庫，獲得其它真菌中的同源蛋白序列。用Clustal X和MEGA6.0軟件對MGG_02457.6同源蛋白進行多序列比對和系統(tǒng)進化樹的繪制。利用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）工具對其進行跨膜結(jié)構(gòu)分析[15]。使用在線工具SignalIP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/）軟件進行信號肽的預(yù)測與分析[15]。

1.2.2 MoRho2基因敲除突變體的獲得 以稻瘟病菌株ΔKu70的基因組DNA為模板，采用引物MoRho2AF和MoRho2AR擴增稻瘟病菌MoRho2開放閱讀框上游0.9 kb的片段，經(jīng)XhoI單酶切后，插入至pCX62載體上，形成重組載體。同理，采用引物MoRho2BF和MoRho2BR，擴增MoRho2開放閱讀框下游1.0 kb的片段，并克隆到pCX62載體的HindIII和SacI酶切位點之間，最后獲得基因敲除載體PCX62-MoRho2-AB。以稀釋后的基因敲除載體PCX62-MoRho2-AB為模板，采用引物MoRho2AF和MoRho2BR擴增MoRho2A-hph-MoRho2B片段。取適量MoRho2A-hph-MoRho2B片段，在PEG介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)化至新鮮制備好的稻瘟病野生型ΔKu70的原生質(zhì)體[16]，通過同源重組的原理進行基因敲除。利用PCR的方法篩選基因敲除的陽性轉(zhuǎn)化子，篩選陽性轉(zhuǎn)化子的PCR引物為MoRho2OF和MoRho2OR、MoRho2UA和H853。所用引物及目的見表1。

1.2.3 MoRho2基因突變體表型分析 （1）生長速度測定。采用Wu等[17]方法，取濾紙片保存的稻瘟病野生型和MoRho2各突變體菌株在淀粉酵母固體培養(yǎng)基（酵母粉2 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蔗糖3 g/L，瓊脂粉20 g/L）上活化，26 ℃溫度下，生長3～4 d后，在菌落外緣用直徑0.5 cm的打孔器打孔，將圓形菌絲塊倒放在新的淀粉酵母瓊脂培養(yǎng)基平板上，于28 ℃下倒置培養(yǎng)；分別在生長的第3、5、7、10天測量菌落的直徑，培養(yǎng)至第10天時，進行拍照。

（2）產(chǎn)孢量分析及細(xì)胞形態(tài)觀察。采用Wu等[17]方法，用直徑0.5 cm的打孔器在已長滿菌絲的淀粉酵母固體培養(yǎng)基（酵母粉2 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蔗糖3 g/L，瓊脂粉20 g/L）上打孔，然后將圓形菌絲塊轉(zhuǎn)接于直徑9 cm含米糠固體培養(yǎng)基（米糠40 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH6.0）中，28 ℃光照培養(yǎng)14 d。用2 mL無菌水沖洗收集稻瘟病菌分生孢子，2層擦鏡紙過濾孢子收集液。用血球計數(shù)板測得分生孢子數(shù)，再換算成單位面積產(chǎn)孢量。3次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

（3）孢子萌發(fā)及附著胞形成實驗。采用Nishimura等方法[18]，孢子懸浮液濃度為1×104～5×104個/mL。在Gelbond film（BMA公司產(chǎn)品）疏水表面和親水表面進行孢子萌發(fā)及附著胞形成實驗，液滴大小為15 μL，表面各滴3滴，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，25 ℃保濕培養(yǎng)，分別于4、8、12、24 h在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率及附著胞形成率。

（4）洋蔥表皮侵染試驗。采用Nishimura[18]等方法，孢子懸浮液濃度為2×104個/mL。采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在每孔中加入2 mL蒸餾水，切取大小適宜的洋蔥表皮第三層的內(nèi)表皮，置于蒸餾水上，將孢子懸浮液滴放在洋蔥表皮上，大小為20 μL每滴，設(shè)置10個重復(fù)，保濕培養(yǎng)，分別在24 h及48 h顯微鏡下觀察侵染情況。

（5）致病性分析。采用Xu等[19]離體接種方法：剪取五葉期的水稻品種CO39嫩葉或10 d苗齡的大麥品種Gold Promise葉片置于保濕處理的培養(yǎng)皿中。將菌絲塊接種于葉片表面，每個樣品重復(fù)3 個葉片，置于26 ℃黑暗培養(yǎng)24 h，光照培養(yǎng)5 d 后觀察病情，拍照。

以上每個實驗均做3 次重復(fù)試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 MoRho2（MGG_02457.6）的生物信息學(xué)分析

真菌與MGG_02457.6蛋白同源序列，用ClustalX軟件和MEGA5.0軟件采用臨近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，MoRho2與TrRho2在同一個分支上，說明這2個基因的親緣關(guān)系較近（圖1）。采用SignaIP 4.1在線軟件對其進行信號肽預(yù)測，根據(jù)軟件的默認(rèn)參數(shù)，ORFs的Cmax 值<0.49，Smean值<0.5，表明MoRho2蛋白不存在信號肽（圖2）。以TMHMM Server v.2.0對其進行跨膜域預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白不含有跨膜區(qū)（圖3）。

2.2 MoRho2基因敲除突變體獲得

根據(jù)同源重組的原理（圖4），構(gòu)建了稻瘟病菌MoRho2基因敲除載體，轉(zhuǎn)化至野生型菌株△Ku70的原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化子經(jīng)400 μg/mL潮霉素和PCR分子驗證，如圖5所示轉(zhuǎn)化子△MoRho2-1和△MoRho2-3的ORF均沒有得到PCR產(chǎn)物，而得到了片段大小為1 117 bp的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化子MoRho2-ect-4和MoRho2-ect-6獲得了片段為745 bp的產(chǎn)物，說明獲得了2個具潮霉素抗性的基因功能缺失轉(zhuǎn)化子△MoRho2-1、△MoRho2-3和2個異位整合轉(zhuǎn)化子MoRho2-ect-4、MoRho2-ect-6。濾紙片保存于-20 ℃，備用。

2.3 菌落生長速度及產(chǎn)孢量統(tǒng)計

CM瓊脂培養(yǎng)基上的菌落生長速度表明，MoRho2基因敲除突變體與野生型菌株生長速度之間沒有顯著差異（圖6；表2）。如稻瘟病菌野生型菌落和MoRho2基因敲除突變體菌株菌落的生長速度分別為（4.35+0.17）mm/d、（4.27+0.26）mm/d。

2.4 分生孢子形態(tài)、產(chǎn)孢量

進一步對ΔMoRho2基因突變體產(chǎn)孢能力進行分析，結(jié)果顯示，突變體均能產(chǎn)生正常形態(tài)的分生孢子（圖7，表3）和黑色素化的附著胞（圖8，表4），產(chǎn)孢量相對野生型菌株也無明顯變化（表2）。

2.5 分生孢子侵染洋蔥表皮

將突變體的分生孢子接種洋蔥表皮24 h后，發(fā)現(xiàn)野生型菌株ku70所產(chǎn)生的附著胞侵入栓的形成率是75.03%（表5），成功侵入到洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)，并進一步分化成侵染菌絲，在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)侵染生長（圖9），而MoRho2基因敲除突變體附著胞侵入栓的形成率是1.15%，另外MoRho2異味整合突變體附著胞侵入栓的形成率是45.05%；接種洋蔥表皮48 h后，野生型菌株附著胞侵入栓的形成率是100%，而MoRho2基因敲除突變體附著胞侵入栓的形成率是48.19%，MoRho2異味整合突變體附著胞侵入栓的形成率是92.75%（表5）?？梢姡疚敛【騇oRho2影響分生孢子附著胞侵入栓產(chǎn)生的數(shù)量。

2.6 致病性分析

進一步分別用稻瘟病菌野生型和突變體菌株的菌絲塊接種生長五葉期的水稻苗和10 d左右的大麥苗，結(jié)果表明，野生型和突變體均能在大麥和水稻葉片上產(chǎn)生典型病斑（圖10）?？梢姡疚敛【鶰oRho2基因與其致病性不相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

在絲狀真菌中，Rho族蛋白是極性生長與細(xì)胞骨架重組過程中關(guān)鍵的調(diào)控因子。前人研究結(jié)果表明，在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，Rho2與肌動蛋白結(jié)合蛋白信號傳導(dǎo)有關(guān)及調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)建成[20-21]；研究結(jié)果表明，稻瘟病基因組中有7個Rho族蛋白成員，且在稻瘟病菌中均有表達。稻瘟病菌Rho族蛋白MoRho3、MoRac1、MoCdc42在稻瘟病菌分生孢子形態(tài)建成、附著胞分化以及侵染性生長過程中起著非常重要作用[13-14，22]。因而推測Rho2蛋白可能與稻瘟病菌生長發(fā)育或致病過程有直接相關(guān)。

生物信息學(xué)結(jié)果表明，MoRho2蛋白為穩(wěn)定的親水蛋白，穩(wěn)定系數(shù)為53.11，疏水性值為-0.092；分析特性表明，該蛋白不含有信號肽序列，不具有跨膜結(jié)構(gòu)，不具有分泌途徑，且無GPI錨定修飾，主要定位在細(xì)胞膜上。因此，該蛋白具有參與細(xì)胞的分化與極性生長的可能性。

然而，在本研究中，對突變體MoRho2表型分析結(jié)果表明，無論是在菌絲的生長速度、產(chǎn)孢能力以及致病性方面它們與野生型菌株均沒有顯著的差異。基于不同專家的研究成果，說明稻瘟病菌中有可能存在Rho基因功能冗余現(xiàn)象。因此，Rho族基因功能的鑒定對于探明真菌致病過程十分重要。本研究僅通過單基因敲除的方法進行功能研究，為進一步確定MoRho2基因參與信號傳導(dǎo)過程，對該基因的分析可通過多個基因突變、蛋白互作等其他方法進一步研究。

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