唐蕾 傅明駿 劉文生 黃建華 周發(fā)林 江世貴

摘要：【目的】克隆斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）泛素結(jié)合酶E2 H基因（UBE2H），了解其組織特異性表達(dá)情況，為揭示UBE2H在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程的作用提供依據(jù)。【方法】PCR擴(kuò)增斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因的開(kāi)放閱讀框，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦各組織及不同發(fā)育期斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺和卵巢中的表達(dá)情況；并構(gòu)建pET32a-UBE2H原核表達(dá)重組質(zhì)粒，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化。【結(jié)果】克隆獲得的斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因全長(zhǎng)1010 bp（GenBank登錄號(hào)KU870456），其中，5'非編碼區(qū)77 bp，3'非編碼區(qū)378 bp，開(kāi)放閱讀框555 bp（編碼184個(gè)氨基酸）。斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H蛋白等電點(diǎn)（pI）4.88，分子量20.85 kD。斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H氨基酸序列與其他物種相似度很高，為78.00%～83.00%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦淋巴組織中表達(dá)量最高，其次為鰓；在斑節(jié)對(duì)蝦不同卵巢發(fā)育期肝胰腺和卵巢中的表達(dá)量均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，但其峰值出現(xiàn)時(shí)間存在差異，肝胰腺的最高表達(dá)量出現(xiàn)在卵巢III期，卵巢的最高表達(dá)量出現(xiàn)在卵巢II期。經(jīng)原核表達(dá)獲得的斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H融合蛋白約39.00 kD，純化后的蛋白濃度為2.92 μg/μL?！窘Y(jié)論】斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H參與了其卵母細(xì)胞發(fā)育和肝胰腺中卵黃蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，與斑節(jié)對(duì)蝦的卵巢發(fā)育密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 斑節(jié)對(duì)蝦；UBE2H基因；克隆；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；原核表達(dá)

中圖分類號(hào)： S945.47 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）11-1958-08

Abstract：【Objective】The present study was conducted to clone ubiquitin-conjugating enzyme E2 H gene（UBE2H） of Penaeus monodon and explore its tissue specific expression， in order to provide references for revealing ovary development of P. monodon. 【Method】Open reading frame of UBE2H gene in P. monodon was amplified by PCR， and UBE2H gene expressions in different tissues， and in hepatopancreas and ovary of P. monodon at different ovary developmental stages were detected using real-time quantitative PCR. pET32a-UBE2H prokaryotic expression recombinant plasmid was constructed， and induction expression and protein purification was carried out. 【Result】The cloned UBE2H gene（GenBank accession No. KU870456） was 1010 bp in length， including 5'UTR of 77 bp and 3'UTR of 378 bp and an open reading frame（ORF） of 555 bp（encoding 184 amino acids）. Isoelectric point（pI） of UBE2H protein was 4.88， molecular weight was 20.85 kD. Amino acid sequence of UBE2H protein was highly similar to those of other species， the similarity reached 78.00%-83.00%. Real-time quantitative PCR results indicated that expression quantity of UBE2H gene was the highest in lymphoid tissue in P. monodon， and followed by gill. The expression quantities of UBE2H gene in hepatopancreas and ovary at different ovary developmental stages both went through an up-down variation， but peak times were different. The largest expression quantity of UBE2H gene in hepatopancreas occurred at ovary developmental stage Ⅲ， whereas the largest expression quantity in ovary occurred at ovary developmental stageⅡ. Fusion protein UBE2H obtained through prokaryotic expression was 39.00 kD， protein concentration after purification was 2.92 μg/μL. 【Conclusion】UBE2H gene of P. monodon participate in oocyte development and transport of yolk protein in hepatopancreas， and is closely related to ovary development of P. monodon.

Key words： Penaeus monodon； UBE2H gene； clone； real-time quantitative PCR； prokaryotic expression

0 引言

【研究意義】泛素結(jié)合酶E2 H（Ubiquitin-conjuga-

ting enzyme E2 H，UBE2H）屬于泛素結(jié)合酶E2家族成員，其主要功能是在E1激活泛素后協(xié)助特異性E3s將活化的泛素轉(zhuǎn)移到底物上，從而使底物轉(zhuǎn)移到蛋白酶體上進(jìn)行降解（邱小波等，2008；張瑩瑩等，2008b）。已有研究證實(shí)，UBE2H的主要作用蛋白為組蛋白和細(xì)胞骨架蛋白，同時(shí)參與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行性途徑（Martin et al.，2009）。斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）是世界三大養(yǎng)殖對(duì)蝦品種之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，發(fā)展至今其人工繁殖技術(shù)已逐漸完善，但有關(guān)卵巢發(fā)育的分子機(jī)制尚未明確。因此，研究UBE2H在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程的作用，可為研究泛素—蛋白酶體通路在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育的分子機(jī)理提供參考依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】目前，關(guān)于UBE2H基因的研究主要集中在疾病方面，如自閉癥（Vourch et al.，2003）、耳聾（Modamio-H■ybj■r et al.，2004）、肌萎縮側(cè)索硬化（Martin et al.，2009）、肝癌（Keng et al.，2009）等，但具體的作用機(jī)理尚未得到系統(tǒng)闡述。此外，還有研究表明，在小鼠的骨骼肌細(xì)胞中UBE2H基因能協(xié)助MG53（Muscle-specific mitsugumin 53）基因使黏著斑激酶蛋白（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）泛素化降解（Nguyen et al.，2014）。有關(guān)泛素結(jié)合酶E2的研究已較深入，張瑩瑩等（2008a）應(yīng)用H1-U6雙啟動(dòng)子RNAi載體篩選到兩個(gè)人類泛素結(jié)合酶hUBE2W的RNAi有效靶點(diǎn)，并進(jìn)行蛋白水平及mRNA水平的表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示其在睪丸成年期的表達(dá)最高；國(guó)果等（2014）通過(guò)克隆家蠅泛素結(jié)合酶基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究在外界刺激誘導(dǎo)下其功能結(jié)構(gòu)與抗病特性間的關(guān)系奠定了理論基礎(chǔ)；張西軒等（2014）通過(guò)構(gòu)建人類泛素結(jié)合酶UbcH5c的活性位點(diǎn)突變體S22R和F62A，并分析這2種突變體蛋白與野生型蛋白在泛素化反應(yīng)中的活性差異，結(jié)果表明，突變體S22R和F62A均不同程度地改變了人類泛素結(jié)合酶UbcH5c與泛素分子間的結(jié)合活性；陳學(xué)昭等（2015）克隆獲得松江鱸泛素結(jié)合酶E2-D2基因cDNA序列，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)經(jīng)鰻弧菌（Vibrio anguillarum）刺激后該基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示其在血液、脾臟、肝臟和鰓中均呈上調(diào)表達(dá)，可能參與了松江鱸的先天免疫防御。近年來(lái)，泛素和泛素結(jié)合酶在甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育研究也屢見(jiàn)報(bào)道，如日本囊對(duì)蝦（Shen et al.，2009）、日本沼蝦（Zhang et al.，2010）、斑節(jié)對(duì)蝦（傅明駿等，2015）等，進(jìn)一步證實(shí)泛素結(jié)合酶在甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。【本研究切入點(diǎn)】雖然泛素結(jié)合酶在甲殼動(dòng)物性腺發(fā)育中的研究較常見(jiàn)（Shen et al.，2009；Zhang et al.，2010；傅明駿等，2015），但有關(guān)UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦的卵巢發(fā)育中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因的開(kāi)放閱讀框，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UBE2H基因的組織特異性表達(dá)情況，并構(gòu)建重組質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)，為進(jìn)一步揭示UBE2H在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程的分子機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試斑節(jié)對(duì)蝦（40±5 g）取自南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，采集其腦、胸神經(jīng)、心臟、肌肉、肝胰腺、鰓、腸道、淋巴組織、精巢、卵巢等組織，加入RNAlater過(guò)夜后置于-80 ℃保存，用于基因克隆及組織特異性表達(dá)分析。根據(jù)黃建華等（2005）的方法進(jìn)行斑節(jié)對(duì)蝦卵巢不同發(fā)育階段判斷，取不同卵巢發(fā)育時(shí)期斑節(jié)對(duì)蝦（120～200 g）的卵巢和肝胰腺組織，以同樣方法保存，用于研究UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢和肝胰腺中的表達(dá)情況。

1. 2 RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄

用TRIzol（Invitrogen公司）提取斑節(jié)對(duì)蝦腦、淋巴、心臟等組織及不同發(fā)育期的斑節(jié)對(duì)蝦卵巢、肝胰腺組織RNA，然后分別采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳及核酸蛋白分析儀Nanodrop 2000進(jìn)行RNA的質(zhì)量與濃度檢測(cè)。同時(shí)，取3.0 μg肝胰腺RNA用Prime ScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于目的基因片段驗(yàn)證；或取1.0 μg各組織RNA，用Prime ScriptTM Real-time PCR Kit（TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于UBE2H基因表達(dá)情況檢測(cè)。

1. 3 斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因驗(yàn)證

從斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得的UBE2H基因片段，設(shè)計(jì)針對(duì)其開(kāi)放閱讀框的驗(yàn)證引物UBE2H-F（5'-TTGTGTAAAGACGCACTCGG-3'）和UBE2H-R（5'-TCAAACAGATGAGACACAGCCT-3'）。以斑節(jié)對(duì)蝦的cDNA為模版，UBE2H-F和UBE2H-R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，具體PCR反應(yīng)體系組成及擴(kuò)增程序參考PrimeScriptTM RT-PCR Kit的說(shuō)明。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，然后進(jìn)行切膠回收。PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體16 ℃連接過(guò)夜，重組質(zhì)粒經(jīng)42 ℃水浴熱激后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，PCR檢測(cè)目的條帶正確導(dǎo)入后送至廣州華大生物科技有限公司測(cè)序。

1. 4 生物信息學(xué)分析

利用表1所示的生物信息學(xué)軟件對(duì)克隆獲得的目的基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1. 5 斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因熒光定量PCR檢測(cè)

分別以斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因開(kāi)放閱讀框序列和內(nèi)參基因18S序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物UBE2H-qF（5'-CTTACCCTAACCCGATTGA-3'）和UBE2H-qR（5'-CTTCTTCCGTTGCGTATC-3'）、18S-

qF（5'-GAGACGGCTACCACATCTAAG-3'）和18S-qR（5'-ATACGCTAGTGGAGCTGGA-3'），對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦各組織、不同發(fā)育時(shí)期的卵巢及對(duì)應(yīng)時(shí)期的肝胰腺組織的UBE2H基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系10.0 μL：5.0 μL SYBR Premix Ex Taq、1.5 μL cDNA模板、0.3 μL上游引物、0.3 μL下游引物，ddH2O補(bǔ)足至10.0 μL；擴(kuò)增程序參考PrimeScriptTM Real-time PCR Kit的說(shuō)明。每個(gè)樣品3個(gè)平行，采用2-ΔΔCt法計(jì)算UBE2H基因表達(dá)量，再以SSPS 18.0進(jìn)行單因素方差分析。

1. 6 斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H原核表達(dá)、免疫印跡及蛋白純化

根據(jù)斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因序列設(shè)計(jì)原核表達(dá)的引物UBE2H-BF（5'-GAATTCATGTCATCACCCAGT

GCAGGA-3'）和UBE2H-BR（5'-GCGGCCGCTTAGAG

CTCCATGTCT-3'），以斑節(jié)對(duì)蝦cDNA為模板進(jìn)行UBE2H基因克隆，有正確片段插入的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，然后用EcoR I和Not I酶切UBE2H片段和pET32a載體，凝膠電泳后切膠回收UBE2H基因片段和線性的pET32a載體，用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，接種于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢驗(yàn)和測(cè)序鑒定。取陽(yáng)性重組菌液接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h左右，當(dāng)其OD達(dá)0.4～0.6時(shí)加入IPTG至最終濃度為1 mmol/L，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)。分別于誘導(dǎo)表達(dá)0、2、4和6 h時(shí)取2. 0 mL菌液，以pET32a載體為陰性對(duì)照，離心收集菌體，棄上清液后加入200.0 μL PBS重懸菌體，再加50.0 μL的5×上樣緩沖液，煮沸10 min，10000×g離心1 min，取10.0 μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后拍照。

按常規(guī)方法對(duì)IPTG誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后處理過(guò)的pET32a-UBE2H重組菌液樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉、PBST洗膜、6×His Tag HRP抗體孵育、PBST洗膜、HRP-DAB試劑盒顯色及拍照。同時(shí)，按原核表達(dá)的條件進(jìn)行pET32a-UBE2H重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)濃度1 mmol/L，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞破碎儀對(duì)誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行破碎，檢測(cè)蛋白是否可溶，然后用His-Tagged的Ni2+-NAT親和層析柱進(jìn)行純化（韋友傳等，2014），并按蛋白定量試劑盒說(shuō)明檢測(cè)純化蛋白濃度。

2 結(jié)果與分析

2. 1 斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因序列分析結(jié)果

斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因全長(zhǎng)1010 bp（GenBank登錄號(hào)KU870456）。其中，開(kāi)放閱讀框555 bp，編碼184個(gè)氨基酸；5'非編碼區(qū)77 bp；3'非編碼區(qū)378 bp。斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H蛋白等電點(diǎn)（pI）4.88，分子量20.85 kD。由UBE2H基因序列結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可知，其編碼該氨基酸序列無(wú)信號(hào)肽，UBE2H蛋白第87位的半胱氨酸（87Cys）為泛素結(jié)合酶特有的活性位點(diǎn)，共含有12個(gè)磷酸化位點(diǎn)（142Ser、165Ser、167Ser、169Ser、170Ser、172Ser、175Ser、13Thr、44Thr、

150Thr、137Tyr和144Tyr），且含有一個(gè)泛素家族特有的UBCc結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2. 2 斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

分別使用PSIPRED和SWISS-MODEL對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，用蛋白三維結(jié)構(gòu)軟件PyMOL對(duì)其蛋白序列進(jìn)行空間三維結(jié)構(gòu)模擬。由圖2可知，斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)β-片層、6個(gè)α-螺旋及連接的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，與三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與人類的相似度達(dá)84.46%，具有很高的相似性。

2. 3 多重序列比對(duì)結(jié)果

用Bioedit進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果如圖3所示。斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H氨基酸序列與其他物種的相似性很高，說(shuō)明泛素家族特有的泛素結(jié)構(gòu)域較保守。與斑節(jié)對(duì)蝦相似性最高的是紅麗魚(yú)（Pundamilia nyererei）、羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）和非洲爪蟾（Xenopus laevis），相似度為83.00%；其次為斑馬魚(yú)（Danio rerio）、人類（Homo sapiens）、白斑狗魚(yú)（Esox lucius）、獼猴（Macaca mulatta）、地山雀（Pseudopodoces humilis）、野豬（Sus scrofa）、豚鼠（Cavia porcellus）、小家鼠（Mus musculus）和家貓（Felis catus），相似度為80.00%；與東方果蠅（Bactrocera dorsalis）的相似度為78.00%。

用MEGA 6.0構(gòu)建基于UBE2H氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖4），結(jié)果顯示哺乳類（人類、小家鼠等）、鳥(niǎo)類（地山雀）等脊椎動(dòng)物聚為一支，再與兩棲類（非洲爪蟾）聚為一支；魚(yú)類聚為另一支，然后所有脊椎動(dòng)物聚為一大支；東方果蠅為外群，其進(jìn)化地位相對(duì)低等。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的總體趨勢(shì)與Bioedit多重序列比對(duì)結(jié)果一致。

2. 4 斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因的表達(dá)分析結(jié)果

2. 4. 1 UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦各組織中的表達(dá)情況 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)變化，以β-action為內(nèi)參基因。由圖5可知，斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因在所檢測(cè)的11種組織（腦、胸神經(jīng)、心臟、肝胰腺、肌肉、胃、腸、淋巴組織、鰓、精巢和卵巢等）中均有表達(dá)，其中以淋巴組織的表達(dá)量最高，鰓次之，與其他組織的表達(dá)水平存在顯著差異（P< 0.05，下同）；其他組織中的表達(dá)差異不顯著（P>0.05，下同）。

2. 4. 2 UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦不同卵巢發(fā)育期卵巢和肝胰腺中的表達(dá)情況 UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦不同卵巢發(fā)育期肝胰腺中的表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)（圖6-A），在卵巢I、II期對(duì)應(yīng)的肝胰腺中其表達(dá)量平穩(wěn)，在卵巢III期對(duì)應(yīng)肝胰腺中表達(dá)顯著升高，是卵巢I期肝胰腺中表達(dá)量的1.9倍；隨后在卵巢IV、V期對(duì)應(yīng)肝胰腺中表達(dá)量下降，顯著低于卵巢I期。UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢中的表達(dá)量也呈先上升后下降的變化趨勢(shì)（圖6-B），但以II期卵巢的表達(dá)量最高，為I期的3.0倍左右，其余發(fā)育期的表達(dá)差異不顯著。

2. 5 斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因原核表達(dá)、免疫印跡及蛋白純化結(jié)果

30 ℃下以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pET32a- UBE2H，并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)2 h后開(kāi)始出現(xiàn)明顯的表達(dá)蛋白條帶，但蛋白表達(dá)量較誘導(dǎo)4和6 h后的少（圖7-A）。采用Western blotting進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白可檢測(cè)到His Tag，且條帶大小在39.00 kD左右（圖7-B），與預(yù)期結(jié)果相符。將純化后的蛋白分管保存，再進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H融合蛋白條帶單一，且目的條帶大小在39.00 kD左右，與預(yù)期結(jié)果一致。試劑盒檢測(cè)得知斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H融合蛋白濃度為2.92 μg/μL。

3 討論

目前，泛素結(jié)合酶在人類免疫疾病研究中較常見(jiàn)，如在艾滋?。╒erPlank et al.，2001）、T細(xì)胞白血病（Shembade et al.，2007）及腫瘤壞死因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)（Fukushima et al.，2007）；在甲殼動(dòng)物中也有類似報(bào)道。陳安靜（2013）研究表明，中國(guó)明對(duì)蝦泛素結(jié)合酶E2能介導(dǎo)白斑綜合征病毒含有RING結(jié)構(gòu)域蛋白的泛素化，并抑制病毒復(fù)制。本研究克隆獲得的斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因全長(zhǎng)1010 bp，含有一個(gè)泛素家族特有的UBCc結(jié)構(gòu)域，與陳學(xué)昭等（2015）發(fā)現(xiàn)松江鱸（Trachidermus fasciatus）泛素結(jié)合酶E2-D2基因的cDNA序列中含有一個(gè)UBCc結(jié)構(gòu)域的研究結(jié)果一致。綜合多重序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果可知，斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H氨基酸序列與其他物種的相似度很高（78.00%～83.00%），說(shuō)明在物種進(jìn)化過(guò)程中UBCc結(jié)構(gòu)域較保守（Sheng et al.，2012）。斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因的組織特異性表達(dá)結(jié)果顯示，該基因在各組織中均有表達(dá)，但以淋巴組織表達(dá)量最高，鰓次之。淋巴組織和鰓是斑節(jié)對(duì)蝦主要的免疫器官，由此推測(cè)UBE2H基因的主要作用與斑節(jié)對(duì)蝦的免疫相關(guān)。

泛素—蛋白酶系統(tǒng)具有炎癥調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生物學(xué)功能，在甲殼動(dòng)物性腺發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如日本囊對(duì)蝦的泛素綴合酶E2r在卵巢發(fā)育III期的表達(dá)量最高，推測(cè)其在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用（Shen et al.，2009）；中華絨螯蟹泛素結(jié)合酶Ubc9基因在卵巢發(fā)育III期的表達(dá)量達(dá)最高值，但在IV期逐漸降到最低值（Wang et al.，2012）；斑節(jié)對(duì)蝦Ubc基因在卵巢發(fā)育III期的表達(dá)量最高，IV期開(kāi)始降低（傅明駿等，2015）。為了闡明UBE2H在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程中的作用，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦不同卵巢發(fā)育期卵巢和肝胰腺中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H基因在卵巢II期的表達(dá)量最高。斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育II期為核染色質(zhì)期，是機(jī)體累積能量、卵母細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程；III期為周邊核仁期，是卵母細(xì)胞快速發(fā)育、累積卵黃蛋白的時(shí)期（黃建華等，2005）。因此，推測(cè)UBE2H參與了斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育與能量積累的過(guò)程。在十足類甲殼動(dòng)物的卵巢發(fā)育過(guò)程中，肝胰腺可合成卵黃蛋白原，并通過(guò)血淋巴組織運(yùn)送到卵巢組織（陳金民等，2010）；但Tseng等（2001）、Hiransuchalert等（2013）研究表明，斑節(jié)對(duì)蝦的卵巢和肝胰腺均能合成卵黃蛋白原。本研究也發(fā)現(xiàn)，UBE2H基因在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育III期對(duì)應(yīng)肝胰腺中的表達(dá)量最高，故推測(cè)UBE2H參與斑節(jié)對(duì)蝦中卵黃蛋白原從肝胰腺到卵巢的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。

為進(jìn)一步探究斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H的生物學(xué)活性和蛋白表達(dá)情況，本研究還構(gòu)建了pET32a-UBE2H重組質(zhì)粒，并以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出約39.00 kD的融合蛋白，其氨基端有一個(gè)6個(gè)組氨酸構(gòu)成的His Tag和一個(gè)19.00 kD左右的硫氧還蛋白。該結(jié)果為下一步的抗體制備、卵巢組織免疫組化研究打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

斑節(jié)對(duì)蝦UBE2H參與了其卵母細(xì)胞發(fā)育和肝胰腺中卵黃蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，與斑節(jié)對(duì)蝦的卵巢發(fā)育有著密切關(guān)系，為下一步研究斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育的分子機(jī)制提供了參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）