劉玲利 李叢 樊金娟 朱延姝 崔震海 阮燕曄 宋波 郭志有

摘 要 建立了遼寧省能源專用甜高粱再生體系，篩選適合組織培養(yǎng)的遼甜系列品種，為遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。以遼甜系列甜高粱芽基部為外植體，在添加不同激素濃度的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)而獲得再生植株。遼甜4號和遼甜7號在添加500 mg/L水解酪蛋白和3 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基上能夠誘導(dǎo)出生長狀態(tài)良好的愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到92%和89%，遼甜4號愈傷組織分化能力比較強(qiáng)，在含有1 mg/L IAA和0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上分化率為76%；遼甜1號和遼甜5號出愈率相對較低，愈傷組織狀態(tài)差，再生能力較弱。結(jié)果表明，能源用甜高粱遼甜系列品種中，遼甜4號更適用于組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞 甜高粱；愈傷組織；成熟種子；芽基部；再生體系

中圖分類號：S566.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.32.060

甜高粱[Sorghum bicolor（L）.Moench]是C4作物中光合作用效率較高作物之一，生長迅速、糖分積累快、生物學(xué)產(chǎn)量高，具有抗旱、耐澇、耐貧瘠、耐鹽堿和乙醇轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最具開發(fā)潛力的能源作物之一[1]。然而甜高粱種質(zhì)資源的匱乏，尤其抗倒伏、含糖量高的品種資源缺乏，傳統(tǒng)的常規(guī)育種己不能滿足人們對高能作物甜高粱的需求，分子育種能方便快捷的將所需的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)入作物，進(jìn)而獲得性狀優(yōu)良的作物品種[2]。建立方便、穩(wěn)定、高效的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，是分子育種的基礎(chǔ)。甜高粱是公認(rèn)的再生體系較難的一種作物，大量研究結(jié)果表明，高粱愈傷組織的誘導(dǎo)和再生，受到諸多因素的影響。不同品種的選擇、外植體的選擇、培養(yǎng)基成分、外源激素的配比等都是影響高粱組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素。以往的研究中，甜高粱的組培多以幼胚、幼穗為外植體，但獲取幼胚和幼穗費(fèi)時、費(fèi)力，同時受季節(jié)、地域的限制，難以保證穩(wěn)定充足的外植體供應(yīng)。而來源于成熟種子的外植體，如成熟種子、成熟胚、芽頂端分生組織等可以保證外植體的穩(wěn)定供給。遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所育成的能源專用甜高粱遼甜系列品種，具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗、廣適等特點(diǎn)。本研究以能源專用甜高粱（遼甜系列品種）成熟種子為材料，選取成熟種子萌發(fā)后嫩芽組織的膨大部分為外植體，通過調(diào)整培養(yǎng)基激素濃度，篩選出最佳誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)基，減輕褐化及水漬化問題；比較不同遼甜品種愈傷組織的誘導(dǎo)，分化及再生能力，篩選適宜組織培養(yǎng)的品種，為后續(xù)基因工程研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用的試驗材料為遼甜系列品種：遼甜1號、4號、6號和遼甜7號，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 芽基部膨大組織的分離

將甜高粱種子用75%的乙醇滅菌1 min，然后用0.1%的升汞滅菌15 min，最后用無菌水洗滌6～7次，用無菌濾紙將種子表面水分吸干。將滅菌后的種子胚面朝下，接種于MS+500 mg/L酸水解酪蛋白+2，4-D（2.0、3.0和4.0 mg/L）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，（25±2）℃黑暗條件下培養(yǎng)3～7 d。選擇芽基部膨大的正常種子，無菌條件下切取帶有種子的膨大部分轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并統(tǒng)計不同品種萌發(fā)種子膨大率。

1.2.2 繼代培養(yǎng)

培養(yǎng)5～7 d后，根據(jù)膨大部分愈傷組織形成情況，將生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS+500 mg/L酸水解酪蛋白+3.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT的繼代培養(yǎng)基上，（25±2）℃黑暗條件下培養(yǎng)28 d。

1.2.3 植株再生

將生長良好的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基（MS+1 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA）上培養(yǎng)30 d，再將芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+3 mg/L IBA）上，培養(yǎng)條件為（25±2）℃，每天16 h光照，光照強(qiáng)度為35 μmol/（m2·s）。

1.3 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

初始分生組織膨大率=（接種一周后膨大的分生組織塊數(shù)目/接種的外植體數(shù)目）×100%；

愈傷組織誘導(dǎo)率=（接種四周后愈傷組織數(shù)目/接種的外植體數(shù)目）×100%；

愈傷組織分化率=（誘導(dǎo)出的叢生芽塊數(shù)目/轉(zhuǎn)接的膨大分生組織塊數(shù)目）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽基部膨大率及愈傷組織的誘導(dǎo)

將無菌的成熟的種子置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)4～5 d后，芽基部均出現(xiàn)膨大現(xiàn)象。四個品種在2，4-D濃度為3.0 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中膨大組織的生長狀態(tài)好于其他誘導(dǎo)培養(yǎng)基。如圖1所示，遼甜4號和遼甜7號芽基部膨大率較高，分別為100%和98%，并且生長狀態(tài)較好，出現(xiàn)愈傷組織；遼甜1號和遼甜5號芽基部膨大率相對較低，分別為84%和88%，并且膨大組織部分出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，生長狀態(tài)較差。

2.2 愈傷組織的繼代

將生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有低濃度KT的繼代培養(yǎng)基上，繼代時需將誘導(dǎo)時留著的種子部分切除，減少褐化，每2周繼代一次，共繼代2次，繼代過程中愈傷組織形成率有明顯的差異。如圖2所示，遼甜4號和遼甜7號愈傷組織生長良好，體積明顯增大，且愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，顏色呈淡黃色，愈傷組織最終誘導(dǎo)率分別為92%和89%；遼甜1號和遼甜5號愈傷組織最終誘導(dǎo)率分別為36%和24%，并且遼甜1號愈傷組織質(zhì)地堅硬生長緩慢，而遼甜5號愈傷組織出現(xiàn)了水漬化和褐化問題。

2.3 再生植株的形成

將最終得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，5～6 d后愈傷組織表面出現(xiàn)綠色，1～2周后愈傷組織表面出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，3～4周后生長出不定芽。遼甜4號和遼甜7號最終分化率分別為76%和48%，而遼甜1號和遼甜5號分別為12%和9%。將不定芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，4～6周后得到完整植株。

3 討論

3.1 外植體的選擇與處理

甜高粱再生體系的建立中，外植體的選擇與處理是誘導(dǎo)初期的關(guān)鍵步驟。本研究選用成熟種子，取材方便，不受時空限制。待其芽長到2 cm左右時（約4～5 d），芽基部漸漸出現(xiàn)膨大，將其芽軸及芽尖切除，并保留膨大部分和胚乳部分3～5 d，待芽基部愈傷組織穩(wěn)定形成后，再將胚乳部分切除。此方法使胚性愈傷組織形成率提高了17%，但胚乳部分也不能長時間保留，營養(yǎng)耗盡后，顏色加深，出現(xiàn)干癟現(xiàn)象，此時要及時去除。

對比發(fā)現(xiàn)，直接切除胚乳部分的外植體，極易出現(xiàn)水漬狀，最終褐化。同時，若種子胚乳部分與膨大部分接觸點(diǎn)出現(xiàn)了黑色褐化，要及時將種子胚乳部分去除，減少褐化。

3.2 組織培養(yǎng)過程中的褐化問題

研究表明，若離體材料較小，極易出現(xiàn)褐化，外植體受傷害程度如切口面積過大也會加重褐變程度。本研究對外植體的處理中，胚乳部分的切除與否也會影響褐化程度，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因除了離體材料大小及切口面積外，也可能因為胚乳里面含有相應(yīng)的生長激素或酶類，減少了褐化，有利于愈傷組織的形成，對新生組織有一定的保護(hù)作用。在繼代時發(fā)現(xiàn)有些愈傷組織出現(xiàn)褐化，但未接觸培養(yǎng)基的愈傷組織正常生長，下面部分出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，可能是組織的一種自我保護(hù)，確保了上面的愈傷組織正常生長，有些愈傷組織出現(xiàn)水漬狀，這種愈傷組織不再具有分化能力，可通過提高瓊脂的濃度來改善。

3.3 不同品種間組織培養(yǎng)與再生能力比較

不同品種的甜高粱在組織培養(yǎng)及再生能力方面存在差異。四個遼甜品種中，遼甜4號的愈傷組織誘導(dǎo)效率高、生長較快、結(jié)構(gòu)緊密、顏色淡黃，且遼甜4號無論在初始分生組織膨大率、愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織分化率上都高于其他遼甜品種。這可能是由于不同品種的基因型不同。

4 結(jié)論

本研究以能源專用甜高粱遼甜系列品種成熟種子為材料，建立并改進(jìn)了甜高粱再生體系，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中種子發(fā)芽2 d后出現(xiàn)膨大，芽長達(dá)到2 cm左右時，剪掉其余芽組織，有利于胚性愈傷組織的形成，在愈傷組織穩(wěn)定形成后，去除種子的胚乳部分，可以減輕褐化和水漬化；同時篩選適宜組織培養(yǎng)的遼甜系列品種，發(fā)現(xiàn)遼甜4號品種具有更高的再生能力，更易于組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)

[1]汪家灼.甜高粱雜交種——新的生物質(zhì)能源[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（3）：75-76.

[2]葛玉紅.甜高粱再生體系的優(yōu)化研究[D].廣西：廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，2011.

（責(zé)任編輯：劉昀）