王鳳蘭 王霞 于曉明

摘要：以吉林市左家鎮(zhèn)3個(gè)地區(qū)的18株野生珊瑚菌樣品為研究材料，應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記方法，分析其遺傳多樣性水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，左家地區(qū)珊瑚菌具有較高的遺傳多樣性，AFLP多態(tài)位點(diǎn)百分率為85.4%，遺傳距離在0.223～0.712之間，相似系數(shù)的變化范圍在0.442～0.824之間。應(yīng)用UPGMA聚類分析表明，所檢測(cè)的18株野生珊瑚菌樣品的遺傳距離與采樣地點(diǎn)有明顯關(guān)聯(lián)，并且ZJ居群野生珊瑚菌的遺傳多樣性遠(yuǎn)高于LT居群和FM居群。

關(guān)鍵詞：珊瑚菌；AFLP；遺傳多樣性；遺傳分化

基金項(xiàng)目：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科培育項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字〔2013〕第X009號(hào)）；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字〔2015〕第 041號(hào)）

中圖分類號(hào)： Q75 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.03.022

珊瑚菌（Clavicorona pyxydata），也稱“掃帚菌”，屬珊瑚菌科（Clavariaceae），其形狀多樣，顏色鮮艷，是我國(guó)野生食用菌中的一種重要資源。而傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，珊瑚菌具有補(bǔ)鈣、鎮(zhèn)靜的食補(bǔ)功效。有研究表明，珊瑚菌具有抗癌作用，珊瑚菌的水煎劑對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞株有明顯的抑制作用，可以作為抗乳腺癌的良好備選藥物。珊瑚菌在我國(guó)分布廣泛，其中常見(jiàn)種有葡萄枝瑚菌、密枝瑚菌、杯珊瑚菌、冠鎖瑚菌、須瑚菌、棒瑚菌、平截棒瑚菌等。由于珊瑚菌的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值而且目前尚不能進(jìn)行商業(yè)化栽培，因此目前市場(chǎng)上消費(fèi)的產(chǎn)品幾乎全部來(lái)自野生。目前，國(guó)內(nèi)僅對(duì)山東省、河南省、秦巴山區(qū)和雞足山地區(qū)的野生珊瑚菌進(jìn)行了資源調(diào)查，而有關(guān)珊瑚菌遺傳多樣性結(jié)構(gòu)狀況研究尚未開(kāi)展。在眾多分子生物學(xué)遺傳多樣性研究方法中，AFLP分子標(biāo)記技術(shù)具有實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、高效、遺傳多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，其檢測(cè)遺傳位點(diǎn)效率高于ISSR和SSR等技術(shù)。通過(guò)AFLP位點(diǎn)遺傳多樣性分析，可以檢測(cè)居群的遺傳多樣性水平；通過(guò)遺傳多樣度、基因多樣度各指數(shù)的分析可以了解居群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化；分析群體間的遺傳相似性和遺傳距離；通過(guò)聚類分析獲得顯示各居群間親緣關(guān)系的進(jìn)化系統(tǒng)。本研究運(yùn)用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在分子水平上探討吉林市左家地區(qū)18株的珊瑚菌親緣關(guān)系和遺傳多樣性，旨在揭示珊瑚菌遺傳多樣性水平，遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳分化，為珊瑚菌這一重要食（藥）用資源保護(hù)與利用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

從吉林市左家鎮(zhèn)三個(gè)地區(qū)采集18株野生珊瑚菌子實(shí)體（三個(gè)居群，分別編號(hào)為L(zhǎng)T1-6，F(xiàn)M1-6和ZJ1-6），樣品采集后用硅膠干燥并置于密封袋中。

1.2主要試劑

AFLP接頭、預(yù)擴(kuò)增引物和選擇性擴(kuò)增引物由上海生工公司合成；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP和DNA ladder Mix購(gòu)自Takara公司。

1.3珊瑚菌總DNA 的提取

稱量珊瑚菌子實(shí)體干燥樣品0.2克，采用改良的CTAB法[7]提取珊瑚菌基因組DNA，加100μL的TE緩沖液溶解總DNA，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AFLP擴(kuò)增

1.4.1 酶切與接頭連接 酶切反應(yīng)體系為1×T4 ligation buffer，1U EcoRI，1U MseI，100μmol/L EcoRI接頭，100μmol/L MseI 接頭，1U T4 ligase，200ng基因組DNA，加水補(bǔ)足到總反應(yīng)體積為30μL?；靹蚍磻?yīng)體系，在37℃條件下酶切4 小時(shí)，繼續(xù)在16℃條件下連接8 小時(shí)后4℃保存。

1.4.2預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增 本文所用的預(yù)擴(kuò)增引物和熒光標(biāo)記的選擇性擴(kuò)增引物由Invitrogen公司合成。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，包括1×反應(yīng)緩沖液，300μmol/L dNTPs，350μmol/L引物，0.5U ExTaq DNA聚合酶，1μL基因組DNA酶切產(chǎn)物作為模板。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35次循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。預(yù)擴(kuò)增PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋20倍作為選擇性擴(kuò)增PCR的模板。選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，包括1×反應(yīng)緩沖液，300μmol/L dNTPs，350μmol/L引物，0.5U ExTaq DNA聚合酶，1μL稀釋好的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性45秒，65℃退火45秒，72℃延伸90秒，10次循環(huán)，每輪循環(huán)溫度遞減1℃，94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35次循環(huán)，72℃延伸10分鐘，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳 80 V電壓下電泳60 分鐘，用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

1.4.3AFLP選擇性擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè)與分析 AFLP選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物送交長(zhǎng)春華大中天生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳和熒光信號(hào)讀取。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)AFLP擴(kuò)增條帶時(shí)，熒光信號(hào)值大于80時(shí)認(rèn)為有條帶記錄為1，小于80時(shí)認(rèn)為沒(méi)有條帶記錄為0。應(yīng)用NTSYS-pc2.1軟件計(jì)算樣品之間的相似系數(shù)，并進(jìn)行UPGMA聚類分析。根據(jù)遺傳距離用Mega3.0軟件UPGMA法聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1珊瑚菌的遺傳距離和相似系數(shù)分析

通過(guò)一共從36對(duì)選擇性擴(kuò)增的引物組合中讀取3227條帶，其中多態(tài)性條帶有2758條（占85.4%）。遺傳距離（Genetic Distance）和相似系數(shù)（Genetic Identity）是用來(lái)衡量種群之間遺傳分化程度的重要指標(biāo)用POPGENE 32軟件對(duì)吉林市左家鎮(zhèn)18株珊瑚菌（3個(gè)取樣地點(diǎn)）進(jìn)行遺傳距離和相似系數(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

3個(gè)珊瑚菌群間的遺傳距離的變化范圍在0.223～0.712之間，相似系數(shù)的變化范圍在0.442～0.824之間。珊瑚菌居群 ZJ與居群FM之間的遺傳距離最小，為0.223 相似系數(shù)也是最高的為0.824。左家地區(qū)珊瑚菌居群 ZJ與居群LT之間的遺傳距離最大，為0.712，同樣相似系數(shù)是最低的，為0.442。

2.2珊瑚菌樣品間和居群間的親緣關(guān)系聚類分析

用軟件NTSYS-pc 2.1對(duì)18個(gè)試驗(yàn)樣品相似系數(shù)進(jìn)行分析，使用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1表明ZJ-3號(hào)和ZJ-5號(hào)樣品的相似性最大，相似系數(shù)為0.79，說(shuō)明這2個(gè)樣品的親緣關(guān)系最為接近。聚類圖在相似系數(shù)約為0.50處可劃分為三大組，第1組包括9份資源，組內(nèi)又可劃分2個(gè)亞組。第2組包括4份資源。其他分散的樣品為L(zhǎng)T居群的5份資源，相互之間遺傳差異較大。上述結(jié)果表明左家地區(qū)居群（ZJ）和居群（FM）的親緣關(guān)系近，而居群（LT）與前兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3結(jié)語(yǔ)

隨著人們對(duì)食用珊瑚菌興趣的增加，野生珊瑚菌資源受到了巨大的威脅。吉林市左家地區(qū)具有豐富的野生珊瑚菌資源，為了了解野生珊瑚菌遺傳多樣性，避免野生珊瑚菌遺傳多樣性的散失，本文通過(guò)分析左家鎮(zhèn)3個(gè)地點(diǎn)的18株野生珊瑚菌樣品的遺傳多樣性水平，發(fā)現(xiàn)左家珊瑚菌具有較高的遺傳多樣性，AFLP多態(tài)位點(diǎn)百分率為85.4%，高于羊肚菌（79.55%）、松茸（76.92%）和冬蟲(chóng)夏草（69.60%），而低于美味牛肝菌（93.34%）[10]。而野生珊瑚菌遺傳相似性的UPGMA聚類圖（圖1）以及遺傳距離和遺傳相似性分析（表1）表明左家鎮(zhèn)ZJ居群野生珊瑚菌的遺傳多樣性遠(yuǎn)高于LT居群和FM居群。這一現(xiàn)象可能表明左家鎮(zhèn)的ZJ居群的野生珊瑚菌資源保護(hù)較好，而LT居群和FM居群的野生珊瑚菌資源可能因?yàn)槿祟惢顒?dòng)已經(jīng)遭到了一定程度的破壞。

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作者簡(jiǎn)介：王鳳蘭，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，本科在讀，研究方向：生物工程。

通訊作者：于曉明，碩士，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，講師，研究方向：分子生物學(xué)與基因工程。