孫清榮 孫洪雁 周廣芳

摘要：為了建立棗優(yōu)良新品種魯棗3號的莖段不定芽再生體系，以其幼嫩莖段為外植體，研究了不同基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對莖段愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽再生的影響。結(jié)果表明：基本培養(yǎng)基WPM比MS顯著提高了愈傷組織誘導(dǎo)率，WPM上的愈傷組織誘導(dǎo)率達100%，但不能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽。TDZ對不定芽的再生比6-BA更有效，成功誘導(dǎo)愈傷組織獲得了14.9%的不定芽再生率，而6-BA未能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽。魯棗3號莖段適宜的不定芽再生培養(yǎng)基為：MS+lmg/L TDZ+0.2mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：魯棗3號；莖段；愈傷組織；不定芽

中圖分類號：S665.101

文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）02-0012-03

棗（Zizyphus juijuba Mill.）是鼠李科棗屬多年生落葉木本果樹，原產(chǎn)地中國。紅棗營養(yǎng)豐富、富含維生素，深受廣大消費者喜愛，但由于棗樹在生長過程中經(jīng)常受到一些病蟲害危害，制約了紅棗產(chǎn)量。通過育種方法可以進行棗樹品種的抗性改良，但由于棗胚敗育率高及落花落果嚴重等，利用常規(guī)雜交育種方法很難達到品種改良的目的?；蚬こ痰耐庠椿蜻z傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物體細胞誘變技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)方法的發(fā)展為植物新品種的選育和改良提供了育種新途徑，該技術(shù)的成功應(yīng)用主要依賴于植物高效再生體系的建立。因此，建立棗樹的高效再生體系是利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段改良品種的首要步驟。

棗離體葉片不定梢誘導(dǎo)研究報道較多，但以棗嫩莖切段為外植體進行不定芽誘導(dǎo)的研究尚未見報道。魯棗3號是2010年山東省審定的極早熟鮮食棗新品種，為了更好地利用、保存和改良這一品種，本試驗研究了其莖段不定芽再生技術(shù)，為種苗的無性快繁、品種資源的離體保存及利用現(xiàn)代生物技術(shù)改良品種奠定基礎(chǔ)，同時也為其他品種莖段不定芽再生誘導(dǎo)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山東省果樹研究所棗樹資源圃種植的棗樹新品種魯棗3號成年大樹。

1.2 培養(yǎng)基

愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、噻苯?。═DZ）及3-吲哚丁酸（IBA），設(shè)置4種不同培養(yǎng)基處理（表1）。

不定芽的增殖培養(yǎng)基：WPM+2mg/L6-BA+1mg/LKT+0.5mg/L IBA。

生根培養(yǎng)基：1/4MS+1mg/L IBA。

所有培養(yǎng)基均添加蔗糖3%，瓊脂0.6%，在滅菌前調(diào)節(jié)pH值為5.8。

1.3 試驗方法

1.3.1 愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化培養(yǎng) 從生長健壯的魯棗3號樹上剪取半木質(zhì)化棗頭嫩枝，去掉葉片，帶回實驗室，剪取去掉兩端腋芽的節(jié)間莖段，用洗衣粉水清洗，再用自來水沖洗30min以上，控凈水，置于超凈工作臺上的無菌燒杯內(nèi)。先用70%酒精殺菌1min，再用5%次氯酸鈉殺菌8min，期間搖動3-5次，用無菌水洗4～5次，將材料置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)橫切成0.2cm左右的小段，橫切面向下接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（表1）。每個處理接種3瓶，每瓶接種10個，重復(fù)3次。接種后置于光周期為16h/8h（光/暗）、光強為40μmol·m-2·S-l、溫度為（25+2）℃的條件下培養(yǎng)，7周后，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率及不定芽再生率。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生愈傷組織的莖段數(shù)/接種總莖段數(shù)xl00

不定芽再生率（%）=產(chǎn)生不定芽的莖段數(shù)/接種總莖段數(shù)×100

1.3.2 不定芽伸長、增殖和生根培養(yǎng)將不定芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基進行繼代增殖和伸長培養(yǎng)。選取1.0cm以上的健康綠梢，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基進行生根誘導(dǎo)，置黑暗條件下培養(yǎng)1周，然后轉(zhuǎn)到光周期為16h/8h（光/暗）的光培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，4周后統(tǒng)計生根率。

生根率（%）=生根株數(shù)/接種總梢數(shù)×100

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS 7.5軟件進行統(tǒng)計分析，不同處理平均值用LSD法進行差異比較分析，檢驗0.05水平下差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組成對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

由表1可知，4種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)魯棗3號莖段產(chǎn)生愈傷組織，其中WPM基本培養(yǎng)基處理的愈傷組織誘導(dǎo)率可達100%，顯著高于MS基本培養(yǎng)基。

外源植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織的誘導(dǎo)作用因基本培養(yǎng)基的不同而表現(xiàn)不同。在WPM培養(yǎng)基上，TDZ和6-BA對愈傷組織的誘導(dǎo)作用無明顯差異；在MS培養(yǎng)基上，TDZ比6-BA對愈傷組織的誘導(dǎo)更有效，二者的愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著（表1）。

2.2 培養(yǎng)基組成對不定芽分化的影響

由表1可知，WPM培養(yǎng)基上的愈傷組織均未能分化不定芽。在MS基本培養(yǎng)基上添加1mg/LTDZ和0.2mg/L IBA時，可成功誘導(dǎo)愈傷組織分化不定芽（圖1A），不定芽再生率為14.9%；而添加6-BA的MS培養(yǎng)基未能誘導(dǎo)愈傷分化不定芽。由此可見，不定芽的分化受基本培養(yǎng)基和外源植物生長調(diào)節(jié)劑相互作用的影響。盡管WPM能高效誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，但不能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽。結(jié)果表明，誘導(dǎo)魯棗3號莖段不定芽再生的適宜培養(yǎng)基為MS+lmg/L TDZ+0.2mg/L IBA。

2.3 不定芽的生長與增殖

將不定芽轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基WPM+2mg/L 6-BA+1mg/L KT+O.5mg/L IBA培養(yǎng)基上，表現(xiàn)為既有伸長生長也有增殖生長（圖1B）。

2.4 生根誘導(dǎo)

伸長生長的不定梢在生根培養(yǎng)基上獲得了生根小植株（圖1C），生根率為85.4%。

3 結(jié)論與討論

以棗樹葉片為外植體進行不定梢誘導(dǎo)的研究報道較多，但因基因型不同，其獲得的再生率也不同。莖段不定芽再生的研究雖也有報道，但所用外植體為帶芽莖段，表現(xiàn)為在切口處產(chǎn)生不定芽。本研究是以節(jié)間（去掉兩端芽）莖段為外植體，首次成功獲得了再生不定芽。

本研究中，基本培養(yǎng)基WPM比MS雖然顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率，但WPM培養(yǎng)基上添加TDZ或6-BA均未獲得不定芽再生，而在MS培養(yǎng)基上添加TDZ成功獲得了不定芽，這與前人在MS培養(yǎng)基上獲得帶芽棗莖段不定芽再生的結(jié)論相一致，但所添加的植物生長調(diào)節(jié)劑不同，表明外植體或基因型不同，不定芽再生所需的植物生長調(diào)節(jié)劑不同。

TDZ是比6-BA細胞分裂素活性更強的類細胞分裂素物質(zhì)，更有利于誘導(dǎo)木本植物不定芽的再生。本研究結(jié)果表明：TDZ對于誘導(dǎo)魯棗3號莖段的不定芽再生比6-BA更有效，這與誘導(dǎo)棗葉片不定芽再生時TDZ比6-BA有效的研究結(jié)果一致。

本研究雖成功獲得了魯棗3號莖段不定芽的再生，但再生率低，不能有效應(yīng)用于生物技術(shù)育種研究，如何進一步提高再生率還需深入研究。