汪佳秀 武艷艷 鐘田坤

摘 要 目的：建立金線蓮無菌繁殖體系。方法：以金線蓮植株莖段為外植體，分析莖段不同位置、培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑和添加物對(duì)不定芽增殖和幼苗生長的影響。結(jié)果：外植體以中間段莖節(jié)（不含頂芽和長根）為宜，一步成苗最佳培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基+IBA（吲哚乙酸），用量為10 mL/L，香蕉100 g/L，活性炭2 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值5.8；不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+TDE，用量為0.1 mL/L，土豆汁100 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8；壯苗生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS，生長調(diào)節(jié)劑添加適宜量為6-BA（0～0.5 mg/L）+NAA（3.0～4.0 mg/L），香蕉（20.0%）對(duì)促進(jìn)幼苗生長有利，活性炭（0.3%）具有一定的促進(jìn)作用；試管苗移載適宜基質(zhì)為丹麥泥炭土，成活率可達(dá)到96%。結(jié)論：合理利用金線蓮組培快繁技術(shù)，建立無菌繁殖體系，能夠?qū)崿F(xiàn)金線蓮幼苗的快速繁殖。

關(guān)鍵詞 金線蓮；不定芽誘導(dǎo)；壯苗培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：Q944.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1673-890X（2016）06-0-03

金線蓮中富含氨基酸、抗衰老活性微量元素，藥效價(jià)值較高，被視為珍惜名貴藥材，備受青睞。但受自身生長特點(diǎn)等因素影響，金線蓮在自然條件下萌發(fā)率和繁殖率較低，在藥品市場(chǎng)一直供不應(yīng)求[1]?；谶@一現(xiàn)狀，利用植物培養(yǎng)技術(shù)來提高金線蓮繁殖速度，加大人工培養(yǎng)規(guī)模，對(duì)保護(hù)金線蓮和穩(wěn)定市場(chǎng)供應(yīng)，均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?，F(xiàn)將有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

無菌繁殖體系建立為江西金線蓮野生種源，采集植株莖段，外植體以含頂芽莖段為主。

1.2 方法

1.2.1 一步成苗

1.2.1.1 無菌繁殖

取植株，去葉，先放入水中漂洗，再用流水沖洗，時(shí)間分別為5、30 min；以75%酒精浸濕，放入0.1%氯化汞溶液中，12 min后取出，用蒸餾水沖洗，取莖上段（即具莖尖）、中段和下段（即匍匐莖段），各1.5 cm，均帶有節(jié)間，并分別接種于備好的培養(yǎng)基上。

1.2.1.2 最佳培養(yǎng)基配方

MS培養(yǎng)基+IBA（吲哚乙酸），用量為10 mL/L，香蕉100 g/L，活性炭2 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值5.8；培養(yǎng)條件為：溫度（25±2）℃，光照時(shí)間和強(qiáng)度分別為12 h/d、1 800 lx左右[2]。

1.2.2 分步出瓶

1.2.2.1 不定芽誘導(dǎo)

通過單因素實(shí)驗(yàn)考察基本培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響，大量元素減半（1/2MS），其他成分不變，各加入6-BA和NAA，用量分別為4.0 mg/L、1.0 mg/L；選取無菌健壯植株，做前期處理，接10個(gè)莖節(jié)，均重復(fù)3次，以MS為培養(yǎng)基，梯級(jí)加入細(xì)胞分裂素和生長素，培養(yǎng)期間定時(shí)觀察不定芽生長情況，統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)，分析生長調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響；繁殖最適培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+TDE，用量為0.1 mL/L，土豆汁100 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8。

1.2.2.2 壯苗培養(yǎng)

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，6-BA和NAA分別進(jìn)行梯級(jí)處理，前者設(shè)1～5 mg/L，后者設(shè)0.5～1.5 mg/L，共計(jì)15個(gè)處理，分析生長調(diào)節(jié)劑對(duì)幼苗生長和發(fā)根的影響；另加6-BA（0.5 mg/L）和NAA（2.0 mg/L），考察天然有機(jī)物與活性炭對(duì)幼苗生長的影響；生根最適合培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+6-BA，用量為0.1 mL/L，IBA（吲哚乙酸）5 mL/L，香蕉提取液50 g/L，活性炭2 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值5.8；接入將增殖培養(yǎng)無根幼苗，高為3 cm左右，具在3～4節(jié)間，有1～2片，接種無根幼苗10株，重復(fù)3次，定期觀察生長情況。

1.2.2.3 移栽

選苗，高為7 cm左右，莖基直徑2 mm左右，叢生根2～3條，煉苗后洗凈培養(yǎng)基，移入裝有不同基質(zhì)土盆中；移栽前，基質(zhì)均用45%多菌靈可濕性粉劑，均以800倍溶液澆透消毒，具體條件為：陰棚遮陰度為80%，空氣相對(duì)濕度為85%左右；移栽3個(gè)月后，記錄成活株數(shù)[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌繁殖體系建立和不定芽誘導(dǎo)影響分析

外植體莖段分化程度會(huì)影響到誘導(dǎo)結(jié)果，金線蓮莖段外植體不定芽誘導(dǎo)顯示，外植體上段的接種數(shù)共75段，萌動(dòng)率為100.0%，不定芽數(shù)為47個(gè)，平均芽增值率為0.60倍，芽體生長勢(shì)旺且芽數(shù)少；外植體中段的接種數(shù)共166段，萌動(dòng)率為100.0%，不定芽數(shù)為680個(gè)，平均芽增值率為4.03倍，芽體芽數(shù)較多且發(fā)育良好；外植體下段的接種數(shù)共94段，萌動(dòng)率為85.2%，不定芽數(shù)為138個(gè)，平均芽增值率為1.71倍，芽體芽數(shù)較少且生長緩慢?；九囵B(yǎng)基能夠萌發(fā)出不定芽體，但對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的影響較大，結(jié)果顯示，MS培養(yǎng)基芽體生長狀況最佳，其次1/2MS，與1/3MS比較差異較為明顯，表明MS和1/2MS培養(yǎng)基適合作為金線蓮經(jīng)段不定芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基，詳見表1。

本次實(shí)驗(yàn)所用生長調(diào)節(jié)劑為6-BA、KT和NAA，處理結(jié)果顯示：6-BA用量為1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L和6.0 mg/L，平均芽增長率分別為2.72倍、3.28倍、4.02倍、3.22倍；芽體生長變化趨勢(shì)為色嫩綠且芽較弱轉(zhuǎn)為色較率且芽較壯；KT用量為2.0 mg/L和4.0 mg/L，平均芽增長率分別為2.25倍、2.58倍，芽體生長狀況為色黃白且芽較弱；以6-BA 4.0 mg/L為準(zhǔn)，加NAA，用量為0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L，平均芽增長率分別為5.36倍、4.58倍、4.16倍，芽體生長狀況為色濃綠且芽粗壯。從中能夠得出，生長調(diào)節(jié)劑添加量對(duì)金線蓮不定芽增殖的影響較大，且不同生長調(diào)節(jié)劑所產(chǎn)生的影響存在差異，在相同添加量下，6-BA的增值率明顯高于KT，表明6-BA更適合金線蓮莖節(jié)不定芽的誘導(dǎo)，添加適宜量為4.0 mg/L；NAA對(duì)金線蓮不定芽的誘導(dǎo)具有一定的促進(jìn)作用，6-BA（4.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L），芽體生長狀況即能夠達(dá)到改善。

2.2 壯苗生根培養(yǎng)和移載成活影響分析

在金線壯苗生根培養(yǎng)中，6-BA和NAA添加量不同，壯苗凈增葉、發(fā)根數(shù)和鮮質(zhì)量?jī)粼隽恳泊嬖谝欢ú町悺６啻翁幚斫Y(jié)果顯示，6-BA（0.5 mg/L）+NAA（1.0 mg/L），平均凈增葉為1.8片，發(fā)根數(shù)為2.2條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?39.5 mg；6-BA（1.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L），平均凈增葉為1.3片，發(fā)根數(shù)為2.2條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?25.8 mg；6-BA（1.5 mg/L）+NAA（1.0 mg/L），平均凈增葉為1.1片，發(fā)根數(shù)為1.4條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?50.2 mg；6-BA（0.5 mg/L）+NAA（2.0 mg/L），平均凈增葉為3.2片，發(fā)根數(shù)為2.6條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?88.2 mg；6-BA（1.0 mg/L）+NAA（2.0 mg/L），平均凈增葉為2.1片，發(fā)根數(shù)為2.8條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?83.4 mg；6-BA（1.5 mg/L）+NAA（2.0 mg/L），平均凈增葉為1.6片，發(fā)根數(shù)為1.7條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?66.2 mg；6-BA（0.5 mg/L）+NAA（3.0 mg/L），平均凈增葉為4.3片，發(fā)根數(shù)為3.7條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?00.6 mg；6-BA（1.0 mg/L）+NAA（3.0mg/L），平均凈增葉為3.3片，發(fā)根數(shù)為3.0條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?22.8 mg；6-BA（3.0 mg/L）+NAA（1.5 mg/L），平均凈增葉為3.0片，發(fā)根數(shù)為2.2條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?24.6 mg；6-BA（0.5 mg/L）+NAA（4.0 mg/L），平均凈增葉為3.7片，發(fā)根數(shù)為3.3條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?62.8 mg；6-BA（1.0 mg/L）+NAA（4.0 mg/L），平均凈增葉為2.6片，發(fā)根數(shù)為2.6條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?84.8 mg；6-BA（1.5 mg/L）+NAA（4.0 mg/L），平均凈增葉為2.3片，發(fā)根數(shù)為2.4條，鮮質(zhì)量?jī)粼隽繛?35.8 mg。綜合比較來看，在金線壯苗培養(yǎng)中，6-BA適宜添加量為0～0.5 mg/L，NAA適宜添加量為3.0～4.0 mg/L。

不同添加物你對(duì)金線蓮幼苗生長的影響存在一定的差異，結(jié)果顯示，香蕉對(duì)促進(jìn)幼苗生長有利，土豆汁對(duì)促進(jìn)幼苗生長不利，活性炭具有一定的促進(jìn)作用，詳見表2。本次實(shí)驗(yàn)種植基質(zhì)以丹麥泥炭土為基質(zhì)，試管苗移載成活率達(dá)到96%。

3 討論

金線蓮莖段不同部位、培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑和添加物對(duì)不定芽增殖、幼苗生長均會(huì)產(chǎn)生一定的影響，有必要建立無菌繁殖體系，確定金線蓮幼苗快速繁殖的條件[4]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外植體以中間段莖節(jié)（不含頂芽和長根）為宜，一步成苗最佳培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基+IBA（吲哚乙酸），用量為10 mL/L，香蕉100g/L，活性炭2 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值5.8；不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS，生長調(diào)節(jié)劑添加適宜量為6-BA（4.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L）；壯苗生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS，生長調(diào)節(jié)劑添加適宜量為6-BA（0～0.5 mg/L）+NAA（3.0～4.0 mg/L），香蕉（20.0%）對(duì)促進(jìn)幼苗生長有利，活性炭（0.3%）具有一定的促進(jìn)作用；試管苗移載適宜基質(zhì)為丹麥泥炭土，成活率可達(dá)到96%。組織培養(yǎng)所獲得的金線蓮植株與野生金線蓮生長環(huán)境不同，在藥用成分和藥理活性方面可能存在一定的差異，這一問題還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]周銳，孔瓊，薛春麗，等.屏邊野生金線蓮組培快繁技術(shù)研究[J].云南農(nóng)業(yè)科技，2014，10（4）：7-10.

[2]周錦業(yè)，丁國昌，何荊洲，等.不同光質(zhì)對(duì)金線蓮組培苗葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2015，11（5）：67-72.

[3]袁小鈴，王建棟，王思雨，等.金線蓮組培快繁體系優(yōu)化及多糖含量測(cè)定[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，12（7）：983-985.

[4]魏翠華，秦建彬，謝宇，等.應(yīng)用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選臺(tái)灣金線蓮快繁培養(yǎng)基[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，10（4）：114-117.

（責(zé)任編輯：劉昀）