楊善 王熙乾 葉昌輝 謝平 黃興 周鴻凱

摘 要 探究2種水分條件下，氮素對(duì)甘蔗脯氨酸合成積累的效應(yīng)，為甘蔗生產(chǎn)中氮素的施用提供理論參考。以粵糖55為材料，采用桶栽試驗(yàn)，在2種水分條件下，測(cè)定4個(gè)氮素水平間的脯氨酸含量、葉綠素含量、P5CS與δ-OAT活性及其基因表達(dá)，以及有效莖數(shù)、莖徑、株高、蔗莖產(chǎn)量、錘度的表現(xiàn)值。結(jié)果表明：隨施氮水平的提高，干旱脅迫下，葉綠素、脯氨酸的含量及δ-OAT、P5CS基因表達(dá)量逐漸提高，δ-OAT、P5CS活性先增后降；正常水分下，葉綠素含量不斷增加，脯氨酸含量、P5CS活性、δ-OAT活性不斷下降。有效莖數(shù)、株高、蔗莖產(chǎn)量等性狀隨著氮素水平的增加而增加，而莖徑、 糖錘度則是先增后降。 通過(guò)分析結(jié)果認(rèn)為， 在過(guò)磷酸鈣（P肥）、 氯化鉀（K肥）施用量分別固定為1 800、750 kg/hm2時(shí)，磚紅壤土尿素（N肥）施用量在456～918 kg/hm2范圍內(nèi)最佳，甘蔗抗逆性不斷增強(qiáng)，產(chǎn)量不斷增加，糖分高但呈下降趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞 氮肥；甘蔗；脯氨酸；P5CS；δ-OAT；產(chǎn)量

中圖分類號(hào) S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Effects of Nitrogen on Proline Biosynthesis and

Accumulation and Key Gene Expression in Sugarcane

YANG Shan，WANG Xiqian，YE Changhui，XIE Ping，HUANG Xing，ZHOU Hongkai*

College of Agriculture， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088， China

Abstract The effects of nitrogen on proline biosynthesis and accumulation were explored under two kinds of water conditions in order to provide references for nitrogen application in sugarcane production.The sugarcane variety YT-55 plants were cultivated in buckets. Under normal water and drought stress conditions and the four levels of nitrogen， the physiological and biochemical indices were tested such as the gene expression and activity of P5CS， δ-OAT， proline content and chlorophyll content. As well as the performance values of effective stalks， stalk diameter， plant height， cane yield and brix were tested too. With nitrogen levels improving， the chlorophyll content， proline content and the gene expression of δ-OAT and P5CS were gradually improved， the activity of δ-OAT and P5CS had first increasing trend then decreasing trend under drought stress. Under normal water condition， the chlorophyll content was gradually improved， but proline content， the activity of P5CS and δ-OAT were gradually decreased with nitrogen levels improving. The production traits were increased such as effective stalks， plant height and cane yield with nitrogen levels increasing， but stalk diameter and brix had first increasing trend then decreasing trend. The results of analysis showed that in P and K fertilizer application amount fixed for 1 800 kg/hm2 potassium chloride， 750 kg/hm2 calcium superphosphate respectively， the best N fertilizer application amount should be within range of 456-918 kg/hm2 urea in latosol soil， drought resistance and yield of sugarcane was growing， sugar content was high but showed a downward trend.

Key words Nitrogen fertilizer；Sugarcane；Proline；P5CS；δ-OAT；Yield

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.012

隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人地矛盾日益突出，使得蔗區(qū)逐步向缺水且無(wú)灌溉條件的旱坡地和偏遠(yuǎn)山區(qū)轉(zhuǎn)移。由于這些地區(qū)常發(fā)生的春、秋、冬旱，從而引起甘蔗出苗困難、生長(zhǎng)受阻，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量及糖分積累。在干旱脅迫下，甘蔗會(huì)發(fā)生葉片卷曲、葉面積減小、氣孔關(guān)閉、水分蒸騰減少等變化，這與甘蔗的御旱性有關(guān)[1]。耐旱適應(yīng)反應(yīng)中滲透調(diào)節(jié)方面的研究最多，為適應(yīng)干旱脅迫，甘蔗體內(nèi)會(huì)短時(shí)間內(nèi)大量積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如脯氨酸、甜菜堿等），降低水勢(shì)，以確保細(xì)胞能從外界繼續(xù)吸水，保證植株正常生長(zhǎng)[2]。陳如凱等[3]認(rèn)為干旱條件下脯氨酸積累可作為甘蔗選育抗早品種的有效指標(biāo)。一般認(rèn)為脯氨酸的生物合成途徑有谷氨酸途徑（Glu→Pro）和鳥(niǎo)氨酸途徑（Orn→Pro），而2個(gè)合成途徑的調(diào)控關(guān)鍵酶分別為P5CS（△1-毗咯琳-5-羧酸合成酶）和δ-OAT（δ-鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶）[4]。黃誠(chéng)梅等[5]用3個(gè)甘蔗品種以PEG脅迫1～6 d模擬干旱脅迫，結(jié)果表明，脅迫條件下甘蔗葉片的脯氨酸含量具有明顯上升的趨勢(shì)，P5CS活性顯著提高，但δ-OAT活性變化不明顯，表現(xiàn)為品種間的差異顯著。

氮（N）是植物所必需的、首要的大量元素，是氨基酸、葉綠素、核物質(zhì)、酶、生物激素等生命物質(zhì)的重要合成原料，參與酶、輔酶和輔基如NAD+、NADP+、FAD+等的構(gòu)成[6]。同種作物在不同生育期的需氮量不同，不同施氮方式對(duì)作物氮素的吸收有不同影響。藍(lán)立斌等[7]的研究結(jié)果表明，甘蔗氮肥施用按基肥、分蘗肥、攻莖肥分3次施用，對(duì)甘蔗生理生化性狀有積極的影響，能持久保持較強(qiáng)的生理優(yōu)勢(shì)。張立新等[8]研究認(rèn)為水分脅迫下，施用氮肥能顯著提高玉米的硝酸還原酶活性及脯氨酸、甜菜堿和可溶性蛋白質(zhì)含量，改善氮代謝。因此，氮素水平能影響甘蔗的抗逆性。

前人著重于不同氮肥水平對(duì)甘蔗產(chǎn)量、品質(zhì)和農(nóng)藝性狀的影響研究[9-10]，而氮素對(duì)脯氨酸積累及其合成酶活性、基因差異表達(dá)及產(chǎn)量效應(yīng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在正常水分和干旱脅迫下，設(shè)4個(gè)施氮水平，測(cè)定甘蔗葉片δ-OAT活性、P5CS活性、脯氨酸含量及葉綠素含量等抗逆性生理指標(biāo)，以及株高、重量、莖數(shù)、莖徑、錘度等產(chǎn)量、品質(zhì)性狀等的表現(xiàn)值，比較不同氮素水平間的差異，以期為粵西甘蔗耐旱、高產(chǎn)栽培技術(shù)的創(chuàng)新提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以粵糖55（粵西蔗區(qū)主栽品種之一）為材料，試驗(yàn)土壤為磚紅壤土，其部分理化性質(zhì)如下：pH值為5.08，堿解氮為152.12 mg/kg，速效鉀為158.56 mg/kg，有效磷為53.27 mg/kg，有機(jī)質(zhì)為27.80 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)為桶栽試驗(yàn)（膠桶高50 cm、口徑40 cm，距桶底10 cm處側(cè)面開(kāi)4個(gè)對(duì)稱的排水小孔），每桶裝25 kg土壤，種植2個(gè)雙芽段。在施用鉀肥（氯化鉀）750 kg/hm2和磷肥（過(guò)磷酸鈣）1 800 kg/hm2的水平上（該施肥量為湛江當(dāng)?shù)爻Ｓ檬┓柿浚?，設(shè)置4個(gè)氮肥（尿素）施用水平（記為1、2、3、4）分別為：0、456、918、1374 kg/hm2（918 kg/hm2為湛江當(dāng)?shù)爻Ｓ檬┓柿浚糠N肥料施用量按每公頃9萬(wàn)芽進(jìn)行換算，每桶按4芽施肥。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。試驗(yàn)處理設(shè)置2個(gè)生長(zhǎng)條件：①土壤含水量>18%作為正常條件；②土壤含水量<8%時(shí)（甘蔗出現(xiàn)枯萎）作為干旱脅迫。

試驗(yàn)地點(diǎn)：廣東海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)生物研究所。2013年6月18日開(kāi)始種植，按計(jì)劃施肥量施用全量的磷肥、半量的氮肥和鉀肥，肥料與土壤充分混勻，施肥在20～30 cm土層內(nèi)，齊苗后定苗，每桶選留對(duì)稱且健壯的2株甘蔗幼苗，用自來(lái)水澆灌，保持土壤濕潤(rùn)；于2013年9月10日追肥（將計(jì)劃施肥量的另一半氮肥和鉀肥全部施入）。2013年11月30日，實(shí)測(cè)土壤含水量為（18.65±1.32）%時(shí)，每桶取一株甘蔗苗進(jìn)行測(cè)試分析，采集其+1葉進(jìn)行脯氨酸含量、δ-OAT酶活性、P5CS酶活性的測(cè)定，取其心葉進(jìn)行作為總RNA提取材料。隨后，將試驗(yàn)桶栽甘蔗移入玻璃溫室內(nèi)，停水管理，進(jìn)行6 d干旱脅迫處理，當(dāng)甘蔗葉片開(kāi)始出現(xiàn)萎焉時(shí)（2013年12月6日，實(shí)測(cè)土壤含水量為（7.35±0.57）%，按上述方法取樣、測(cè)試分析。甘蔗產(chǎn)量構(gòu)成性狀及錘度測(cè)定于2014年1月12日進(jìn)行。

1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法 脯氨酸含量的測(cè)定按Bates等[11]的方法；葉片色素含量提取采用乙醇-丙酮混合液浸泡法[12]；P5CS提取參照Hayzer等[13]的方法，活性測(cè)定參照韓曉玲[14]的方法，一個(gè)酶活性單位（1U）定義為每分鐘生成1 μmol γ-谷氨酰胺所需要的酶量；δ-OAT的抽提、活性測(cè)定參照余光輝等[15]的方法，一個(gè)酶活性單位（1U）定義為每小時(shí)生成1 mmol P5C所需要的酶量?？俁NA提取采用TRNzo-lA+總RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄采用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒，2種試劑盒均購(gòu)自天根生化科技公司；引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）用Takara寶生物公司的SYBRRPremix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒；儀器使用Roche LightCyclerR2.0；基因表達(dá)分析采用2-△△Ct法[16]進(jìn)行分析，以正常水分條件下的基因表達(dá)量定義為1。

引物設(shè)計(jì)：利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0，按照GenBank中甘蔗P5CS基因的cDNA序列（EU005373.2）、甘蔗δ-OAT基因的cDNA序列（EF517495.1），并根據(jù)RT-qPCR的引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，最終篩選出特異性好、無(wú)引物二聚體的引物，分別為P5CS基因的引物（F：5′-GTGGGTGT

TGAAGGTCTC-3′，R：5′-AGGAAGGTTCTTATGG

GT-3′）和δ-OAT基因的引物（F：5′-GAGTTTAGG

GACCAGTTACAGAA-3′，R：5′-AAGCAGGAGAT

AGAGCGTCAT-3′）。其中，內(nèi)參基因引物則引用闕友雄等[17]篩選的25SrRNA引物（F：5′-GCAGCCA

AGCGTTCATAGC-3′，R：5′-CCTATTGGTGGGTGA

ACAATCC-3′）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS19.0分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Duncans法分析不同氮肥水平間測(cè)定指標(biāo)的差異顯著性（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量分析

由圖1可知，在2種水分條件下，葉綠素含量隨氮素水平的增加而增加；施氮水平1～2時(shí)，葉片葉綠素含量無(wú)顯著性差異；在水平2～3時(shí)，葉綠素含量急劇增加，相對(duì)于水平1，正常水分時(shí)葉綠素含量增加了28.4%，干旱脅迫時(shí)則增加了34.8%。這表明氮素施用量對(duì)甘蔗葉片的葉綠素含量有顯著性影響。

2.2 游離脯氨酸含量分析

由圖2可知，在2種水分條件下，因施氮肥水平不同，脯氨酸含量有顯著性差異，表明不同施氮量對(duì)脯氨酸含量有顯著的影響。干旱脅迫下，施氮水平1～4時(shí)，脯氨酸的含量隨氮水平的增加而增加。施氮水平2、3、4與水平1相比較，脯氨酸增加量分別為90.7%、116.44%、141.52%，增幅越來(lái)越小。正常水分下，施氮水平1時(shí)，脯氨酸含量最高，而水平4時(shí)最低。并且各個(gè)施氮肥水平下，脯氨酸含量均有顯著性差異。由此表明，氮素對(duì)甘蔗的正常生長(zhǎng)發(fā)育有顯著性影響，若缺氮，會(huì)引起氮素脅迫，使得葉片脯氨酸含量增加。

2.3 δ-OAT活性分析

由圖3可知，在2種水分條件下，δ-OAT活性均呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，在施氮水平2時(shí)最大，水平4時(shí)最小。在正常水分條件下，只有施氮水平1與其他水平間有顯著性差異，說(shuō)明氮素會(huì)顯著性地影響δ-OAT活性。而干旱脅迫下，δ-OAT活性比正常水分下都有顯著性地增加，說(shuō)明此時(shí)滲透脅迫是引起δ-OAT活性增強(qiáng)的主要因素，同時(shí)氮素也有一定的影響。

2.4 P5CS活性分析

由圖4可知，在正常水分下，P5CS的活性隨著氮肥施用量的增加而緩慢下降，只有施氮肥水平1與其他水平間有顯著性差異，其他水平間無(wú)顯著性差異。在干旱脅迫下，P5CS活性整體顯著性高于正常水分下的值，說(shuō)明干旱脅迫顯著性地激活了P5CS活性，呈先增后降的趨勢(shì)。在施氮水平2時(shí)，P5CS活性最高，水平4時(shí)最低。由此表明，在2種水分條件下，氮肥施用量對(duì)P5CS的活性均有顯著性影響。

2.5 總RNA提取驗(yàn)證及引物篩選

對(duì)提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28S和18S條帶清晰完整，無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象（圖5），表明總RNA樣品比較完整，無(wú)明顯降解。

以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用上述基因P5CS、δ-OAT的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（圖6），結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物條帶單一，無(wú)引物二聚體出現(xiàn)，片段大小符合qRT-PCR的要求。同時(shí)，回收PCR產(chǎn)物并測(cè)序，通過(guò)Blast比對(duì)，結(jié)果為目的基因片段。

2.6 δ-OAT、P5CS基因表達(dá)分析

圖7、8可知，隨著施氮肥水平增加，δ-OAT和P5CS基因相對(duì)于正常水分條件下的表達(dá)量均呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。在施氮肥水平1時(shí)，2個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量都最小，與水平2時(shí)的基因表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異。而施氮肥水平4時(shí)，2個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均最大。由此表明，氮肥的施用量對(duì)δ-OAT、P5CS基因的表達(dá)有顯著性影響。同時(shí)，2個(gè)基因的表達(dá)量均在施氮肥水平3時(shí)才顯著性地增加，說(shuō)明施氮肥量不足，不利用δ-OAT、P5CS基因表達(dá)，繼而影響到δ-OAT、P5CS活性，最終制約脯氨酸的合成與積累。

2.7 甘蔗產(chǎn)量性狀及錘度分析

由表1可知，隨著氮肥水平的提高，有效莖數(shù)、株高、蔗莖產(chǎn)量均呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，莖徑、錘度則呈現(xiàn)先增后降趨勢(shì)。蔗莖產(chǎn)量在氮肥水平1～3上均呈現(xiàn)顯著性差異，說(shuō)明氮肥對(duì)甘蔗產(chǎn)量提高有顯著的影響。在氮肥水平1～2內(nèi)，蔗莖產(chǎn)量增加了77.2%；在水平2～3內(nèi)，蔗莖產(chǎn)量增加13.3%；在水平3～4內(nèi)，蔗莖產(chǎn)量增加了4.7%。上述結(jié)果表明，不施氮肥會(huì)使甘蔗產(chǎn)量大減，同時(shí)隨著氮肥施用量增加，產(chǎn)量增加幅度越來(lái)越小。有效莖數(shù)在相鄰施氮肥水平間均無(wú)顯著性差異；甘蔗的莖徑、平均株高在施氮肥水平2～4間均無(wú)顯著性差異，但與水平1卻有顯著性差異；甘蔗錘度在氮肥水平2時(shí)最大，水平1時(shí)最小，水平1與其它水平下的錘度有顯著性差異。上述結(jié)果表明，氮肥水平對(duì)有效莖數(shù)、莖徑、株高、錘度均有顯著的影響。

3 討論與結(jié)論

氮素與植物的葉綠素含量、生長(zhǎng)發(fā)育、光合作用速率及產(chǎn)量密切相關(guān)。有研究結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，增施氮肥，能夠提高作物的生長(zhǎng)速率、光合速率和產(chǎn)量[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在氮肥不足時(shí)，甘蔗生長(zhǎng)發(fā)育受到影響，葉綠素含量、莖徑、有效莖數(shù)、產(chǎn)量、株高都下降，品質(zhì)也差。葉綠素含量、蔗莖產(chǎn)量隨著氮施用量的增加而增加，但增幅越來(lái)越小，918 kg/hm2與1 374 kg/hm2間的葉綠素含量、產(chǎn)量未達(dá)到顯著性差異；而錘度在施氮肥為456 kg/hm2時(shí)最大，隨后降低，與918 kg/hm2間的錘度未達(dá)到顯著性差異。因此，氮肥的施用量應(yīng)為456～918 kg/hm2范圍內(nèi)最佳，此時(shí)葉綠素含量、產(chǎn)量不斷增加，糖分較高但呈下降趨勢(shì)。此結(jié)論與張躍彬等[10]、 藍(lán)立斌等[19]、 周正邦等[20]的研究結(jié)論相似。

在干旱脅迫下，脯氨酸可調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢(shì)，穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)，并能在脅迫解除后作為氮素和碳架為植物提供能源[21]。其中P5CS與δ-OAT分別是脯氨酸合成2個(gè)途徑的關(guān)鍵酶，調(diào)控脯氨酸的合成。相關(guān)研究結(jié)果表明，已成功獲得轉(zhuǎn)P5CS基因的擬南芥[22]、 煙草[23]、 甘藍(lán)[24]植株及轉(zhuǎn)δ-OAT基因的水稻[25]植株，均有增強(qiáng)植株抗逆性的表現(xiàn)。因此，δ-OAT、P5CS活性及其基因表達(dá)量的高低對(duì)于游離脯氨酸的合成積累，提高作物的抗逆性至關(guān)重要。本研究在干旱脅迫下，δ-OAT、P5CS活性均在施氮肥量為456 kg/hm2時(shí)最大，再增加施氮量則活性下降；而456 kg/hm2與918 kg/hm2水平間的P5CS活性無(wú)顯著性差異，說(shuō)明在施氮量為456～918 kg/hm2，有利于提高δ-OAT、P5CS活性。δ-OAT、P5CS基因表達(dá)量、脯氨酸含量則是隨著氮肥施用量增加而增加，說(shuō)明干旱脅迫、氮肥水平均可上調(diào)δ-OAT、P5CS基因的表達(dá)，以增加脯氨酸的合成。施氮肥水平0與456 kg/hm2間，δ-OAT、P5CS基因表達(dá)間無(wú)顯著性差異，脯氨酸含量則是急劇地增加，增幅最大；大于456 kg/hm2時(shí)，基因表達(dá)量、脯氨酸含量都顯著增大，但此后脯氨酸含量的增幅越來(lái)越小。因此，干旱脅迫下，施氮肥量為918 kg/hm2時(shí)，最有利于δ-OAT、P5CS活性及基因表達(dá)、脯氨酸合成。然而δ-OAT、P5CS活性與其基因表達(dá)之間的變化趨勢(shì)并不一致，可能是基因從表達(dá)到成功翻譯受到許多因子調(diào)控，如鈍化蛋白[26]、相關(guān)降解酶[27]對(duì)酶活性進(jìn)行調(diào)控。而在正常水分下，在施氮量為456～1 374 kg/hm2間，δ-OAT、P5CS活性及脯氨酸含量雖呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，但各個(gè)水平間均未達(dá)到顯著性差異。上述結(jié)果表明，此時(shí)施氮肥量為456 kg/hm2即可，δ-OAT、P5CS活性也未被顯著激活，脯氨酸含量較低，植株并未受到缺氮脅迫，符合環(huán)保與經(jīng)濟(jì)性的原則。綜上所述，本研究在過(guò)磷酸鈣、氯化鉀的施用量分別為1 800、750 kg/hm2時(shí)，磚紅壤土尿素施用量在456～918 kg/hm2范圍內(nèi)最佳，隨著氮肥施用量增加，甘蔗抗旱能力不斷增強(qiáng)、產(chǎn)量不斷增加，糖分高但呈下降趨勢(shì)。具體施肥量還與田間水、肥管理水平密切相關(guān)。

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