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        橡膠樹(shù)乳管表達(dá)HbHMGR1基因雙元表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

        2016-05-30 10:48:04賀永國(guó)李哲黃綿佳曾憲海林位夫劉潔瓊張春紅馬曉曉
        關(guān)鍵詞:乳管橡膠樹(shù)克隆

        賀永國(guó) 李哲 黃綿佳 曾憲海 林位夫 劉潔瓊 張春紅 馬曉曉

        摘要:【目的】克隆橡膠樹(shù)乳管特異性強(qiáng)啟動(dòng)子HEV2.1(PHEV2.1),構(gòu)建天然橡膠生物合成途徑關(guān)鍵限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特異性植物表達(dá)載體,為橡膠樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)?!痉椒ā扛鶕?jù)已報(bào)道的HEV2.1序列(GenBank登錄號(hào)AY247789.1)設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物,采用PCR從橡膠樹(shù)熱研7-33-97基因組DNA中克隆PHEV2.1,與HbHMGR1基因融合構(gòu)建橡膠樹(shù)乳管特異性植物表達(dá)載體,并以PCR和限制性內(nèi)切酶酶切進(jìn)行鑒定?!窘Y(jié)果】用特異引物可從熱研7-33-97基因組DNA中擴(kuò)增獲得1852 bp的PHEV2.1片段,其與AY247789.1啟動(dòng)子序列的同源性為98.6%。將PHEV2.1與HbHMGR1基因融合構(gòu)建乳管特異性植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1,經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定證明植物表達(dá)載體構(gòu)建成功?!窘Y(jié)論】將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上再克隆至pCAMBIA2301載體上,能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301載體上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題,成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

        關(guān)鍵詞: 橡膠樹(shù);乳管特異性啟動(dòng)子PHEV2.1;HbHMGR1基因;植物表達(dá)載體;構(gòu)建;鑒定

        中圖分類號(hào): S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-1191(2016)02-0163-06

        0 引言

        【研究意義】轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié),對(duì)植物啟動(dòng)子功能進(jìn)行研究不僅可以揭示相應(yīng)基因的表達(dá)模式,還能為利用植物基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因的高效特異性表達(dá)提供有效途徑。橡膠蛋白(Hevein)是膠乳的主要成分,可在乳管中高效表達(dá),占可溶性蛋白質(zhì)的50%~70%,其基因家族成員HEV2.1基因啟動(dòng)子是乳管特異表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子(Van Parijs et al.,1991;Montoro et al.,2008)。橡膠樹(shù)3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶1(HbHMGR1)是橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶(Lynen,1969;Chye et al.,1992;馬曉曉等,2014),因此利用HEV2.1基因啟動(dòng)子和HbHMGR1基因構(gòu)建乳管特異性表達(dá)載體以轉(zhuǎn)化橡膠樹(shù),對(duì)提高橡膠樹(shù)的產(chǎn)量具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】早在20世紀(jì)60年代橡膠蛋白就已被認(rèn)識(shí)(Archer,1960),但在隨后的40年間除Broekaert等(1990)成功克隆獲得過(guò)一個(gè)編碼橡膠蛋白的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)M36986)外,有關(guān)編碼橡膠蛋白基因及啟動(dòng)子的研究鮮有報(bào)道。2005年,Pujade-Renaud等利用文庫(kù)篩選法從橡膠樹(shù)基因組DNA中分離獲得5個(gè)編碼橡膠蛋白的基因,首次證明橡膠蛋白是由一個(gè)小基因家族所編碼;同時(shí)克隆獲得HEV1.1啟動(dòng)子(PHEV1.1)和HEV2.1啟動(dòng)子(PHEV2.1),并融合uidA基因轉(zhuǎn)化水稻,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)啟動(dòng)子均能在轉(zhuǎn)基因水稻中驅(qū)動(dòng)uidA基因的表達(dá),且以PHEV2.1的功能最強(qiáng),能驅(qū)動(dòng)uidA基因在轉(zhuǎn)基因水稻的許多組織中高水平表達(dá)。Montoro等(2008)利用PHEV2.1融合uidA基因,并轉(zhuǎn)化橡膠樹(shù)分析其表達(dá)特性,結(jié)果表明,PHEV2.1驅(qū)動(dòng)uidA基因在根、莖、葉的乳管中特異性強(qiáng)表達(dá),印證了Archer等(1969)關(guān)于橡膠蛋白在乳管細(xì)胞中特異性表達(dá)的觀點(diǎn);隨后還發(fā)現(xiàn)PHEV2.1可受光誘導(dǎo),驅(qū)動(dòng)uidA基因在葉片所有細(xì)胞類型中表達(dá)?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前尚無(wú)利用PHEV2.1構(gòu)建HbHMGR1乳管特異性表達(dá)載體的研究報(bào)道?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)提取橡膠樹(shù)高產(chǎn)品種葉片基因組DNA,克隆橡膠樹(shù)乳管特異性啟動(dòng)子PHEV2.1,用其構(gòu)建乳管特異性植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1,以期為下一步橡膠樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1. 1 試驗(yàn)材料

        橡膠樹(shù)優(yōu)良品種熱研7-33-97的幼嫩葉片采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所橡膠樹(shù)國(guó)家種質(zhì)圃,用于提取基因組DNA。植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-MCS(T-DNA:35S poly A-NPTII-35S promoter-NOS terminator-MCS-35S promoter-uidA-NOS Poly A)與HbHMGR1基因由農(nóng)業(yè)部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;pCAMBIA3301載體由海南大學(xué)畢政鴻惠贈(zèng);大腸桿菌Trans5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;克隆載體pMD19-T、高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、T4 DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取及純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司;限制性內(nèi)切酶Hind III、Pst I和Xma I購(gòu)自美國(guó)NEB公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1. 2 試驗(yàn)方法

        1. 2. 1 橡膠樹(shù)葉片基因組DNA提取 橡膠樹(shù)葉片基因組DNA提取參照鐘淦彬等(2010)和鄒智等(2014)的方法進(jìn)行小量提取。

        1. 2. 2 橡膠樹(shù)乳管特異性啟動(dòng)子PHEV2.1克隆 根據(jù)Pujade-Renaud等(2005)報(bào)道的HEV2.1序列(NCBI登錄號(hào)AY247789)截取起始密碼子前的1830 bp堿基序列,用Primer 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物PHF1(5'-CCC

        因組DNA為模板,以PHF1和PHR1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收、加尾“A”后,克隆至pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α,經(jīng)12~16 h的培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè),選取PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的菌落送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用NCBI網(wǎng)上的BLASTn工具進(jìn)行序列同源性分析。

        1. 2. 3 HbHMGR1乳管特異性植物表達(dá)載體構(gòu)建及酶切鑒定 分別以Xba I和Xma I對(duì)pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGR1進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,切膠回收pCAMBIA3301的大片段和pCAMBIA2301-HbHMGR1的小片段,將兩片段用T4 DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α,過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè),提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-HbHMGR1;再用Hind III和Pst I分別對(duì)pCAMBIA3301-HbHMGR1和pMD19-T-PHEV2.1進(jìn)行雙酶切,電泳結(jié)束后對(duì)pCAMBIA3301-HbHMGR1的大片段和pMD19-T-PHEV2.1的小片段進(jìn)行切膠回收,回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α,過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè),提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒,并用Hind III、Pst I和Xma I對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定,確認(rèn)是否得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒為pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1;最后用Hind III和Xma I將PHEV2.1-HbHMGR1重組片段從pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1上切下,將其連接到pCAMBIA2301-MCS的Hind III和Xma I間,獲得植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α,挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR,提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒,用Hind III和Xma I進(jìn)行酶切鑒定,確認(rèn)HbHMGR1乳管特異性植物表達(dá)載體構(gòu)建是否成功。

        2 結(jié)果與分析

        2. 1 橡膠樹(shù)葉片基因組DNA的提取結(jié)果

        從橡膠樹(shù)熱研7-33-97的葉片中小量提取基因組DNA,取2.0 μL稀釋5倍后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)其純度。由圖1可以看出,提取獲得的橡膠樹(shù)葉片基因組DNA條帶整齊、清晰、完整性好、無(wú)明顯的雜質(zhì)和降解現(xiàn)象。利用微型紫外分光光度計(jì)測(cè)定,其濃度約100 ng/μL。

        2. 2 橡膠樹(shù)乳管特異性啟動(dòng)子PHEV2.1的克隆及序列分析結(jié)果

        以橡膠樹(shù)熱研7-33-97的葉片基因組DNA為模板,用特異性引物PHF1和PHR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得一條近2000 bp左右的條帶。經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序結(jié)果證實(shí),從熱研7-33-97基因組中擴(kuò)增獲得的PHEV2.1為1852 bp。將所獲得的序列錄入NCBI的BLASTn數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.Ncbi.Nlm.Nih.gov/ Blast.cgi? PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BLastSea-

        rch&LINK_LOC=blasthome)與Pujade-Renaud等(2005)報(bào)道的PHEV2.1序列(GenBank登錄號(hào)AY247789.1)進(jìn)行同源性比對(duì)分析,結(jié)果顯示,克隆獲得的PHEV2.1啟動(dòng)子序列與AY247789.1啟動(dòng)子序列的同源性為98.6%,相對(duì)于AY247789.1啟動(dòng)子序列(以此堿基序號(hào)為準(zhǔn)),其差異主要表現(xiàn)為:164G突變?yōu)門(mén),475T和476T間多了一個(gè)AT, 582T突變?yōu)锳,591T和592T間多了一段CACA

        TATTTTGCCTCTGTT序列,845C突變?yōu)門(mén),874A和875T間多了一個(gè)A。

        2. 3 植物表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果

        分別采用Hind III、Pst I、Xma I和Hind III、Xma I對(duì)pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1進(jìn)行酶切,其中,三酶切獲得一條與雙酶切等同的大片段和一條近2000 bp的條帶,近2000 bp的條帶為大小相近的PHEV2.1片段(1852 bp)和HbHMGR1片段(1728 bp),兩者由于大小相近而重疊顯示為一條條帶。此外,雙酶切獲得的小片段介于3000~5000 bp,與3592 bp的PHEV2.1-HbHMGR1重組片段大小一致。再以PHEV2.1的上游引物PHHF和HbHMGR1的下游引物PHHR對(duì)pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,也獲得一條介于3000~5000 bp的條帶,與雙酶切獲得的小片段一致,說(shuō)明中間植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1已構(gòu)建成功。

        提取質(zhì)粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1,以pCAMBIA2301-MCS為陰性對(duì)照、pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1為陽(yáng)性對(duì)照,分別采用Hind III和Xma I對(duì)其進(jìn)行雙酶切,結(jié)果表明,pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1經(jīng)雙酶切后得到一條與陽(yáng)性對(duì)照小片段等同且介于3000~5000 bp的小片段和一條在10000 bp以上的大片段,小片段與PHEV2.1-

        3 討論

        由于生物具有遺傳多樣性,即使是同一物種不同品種間的基因組DNA在遺傳組成上也存在差異,從不同品種基因組中克隆獲得的同源啟動(dòng)子也時(shí)有差異。魯旭(2014)在研究橡膠樹(shù)HbFCA功能時(shí),用DNAMAN軟件對(duì)比了克隆自熱研7-33-97、邊沁橡膠、少花橡膠、光亮橡膠、光亮矮生橡膠、2131野生種、色寶橡膠、熱研幼花和熱研預(yù)測(cè)等9個(gè)橡膠樹(shù)品種的HbFCA啟動(dòng)子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)品種的HbFCA啟動(dòng)子同源性為98.77%,其中熱研幼花與熱研預(yù)測(cè)的相似性達(dá)99.95%。這種現(xiàn)象同樣存在于單子葉植物中,蕭鳳回(2008)通過(guò)分析大麥、水稻干旱可誘導(dǎo)基因LEA啟動(dòng)子,發(fā)現(xiàn)克隆自不同品種的同源啟動(dòng)子序列間均存在一定差異。本研究根據(jù)Pujade-Renaud等(2005)報(bào)道的PHEV2.1序列(GenBank登錄號(hào)AY247789.1)設(shè)計(jì)引物,以橡膠樹(shù)熱研7-33-97的基因組DNA為模板,多次PCR擴(kuò)增均獲得一段1852 bp的序列,經(jīng)BLASTn比對(duì)分析證實(shí),多次克隆獲得的序列均相同,但與Pujade-Renaud等(2005)克隆自橡膠樹(shù)品種RRIM600的PHEV2.1序列略有差異,同源性為98.6%。

        HbHMGR1是橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶(Lynen,1969;Chye et al.,1992;馬曉曉等,2014),其基因在乳管中特異性表達(dá)(Chye et al.,1991)。因此,提高HbHMGR1基因在橡膠樹(shù)乳管中的表達(dá)量,對(duì)促進(jìn)橡膠的生物合成及提高其產(chǎn)量具有重要意義。原始的植物表達(dá)載體pCAMBIA2301理論上只有唯一的1個(gè)Pst I限制性酶切位點(diǎn),但實(shí)際應(yīng)用中的pCAMBIA2301載體上常存在2個(gè)突變?cè)黾拥腜st I酶切位點(diǎn)。為此,本研究將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上,經(jīng)雙酶切后再克隆至pCAMBIA2301載體上,能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題,成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-

        PHEV2.1-HbHMGR1。該研究結(jié)果為進(jìn)一步利用乳管特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)化橡膠樹(shù)及研究HbHMGR1基因在乳管中表達(dá)促進(jìn)膠乳生物合成的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

        4 結(jié)論

        將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上再克隆至pCAMBIA2301載體上,能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301載體上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題,成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

        參考文獻(xiàn):

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        (責(zé)任編輯 蘭宗寶)

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