賀永國(guó) 李哲 黃綿佳 曾憲海 林位夫 劉潔瓊 張春紅 馬曉曉

摘要：【目的】克隆橡膠樹(shù)乳管特異性強(qiáng)啟動(dòng)子HEV2.1（PHEV2.1），構(gòu)建天然橡膠生物合成途徑關(guān)鍵限速酶基因（HbHMGR1）的乳管特異性植物表達(dá)載體，為橡膠樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā扛鶕?jù)已報(bào)道的HEV2.1序列（GenBank登錄號(hào)AY247789.1）設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，采用PCR從橡膠樹(shù)熱研7-33-97基因組DNA中克隆PHEV2.1，與HbHMGR1基因融合構(gòu)建橡膠樹(shù)乳管特異性植物表達(dá)載體，并以PCR和限制性內(nèi)切酶酶切進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】用特異引物可從熱研7-33-97基因組DNA中擴(kuò)增獲得1852 bp的PHEV2.1片段，其與AY247789.1啟動(dòng)子序列的同源性為98.6%。將PHEV2.1與HbHMGR1基因融合構(gòu)建乳管特異性植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定證明植物表達(dá)載體構(gòu)建成功?！窘Y(jié)論】將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上再克隆至pCAMBIA2301載體上，能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301載體上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題，成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

關(guān)鍵詞： 橡膠樹(shù)；乳管特異性啟動(dòng)子PHEV2.1；HbHMGR1基因；植物表達(dá)載體；構(gòu)建；鑒定

中圖分類號(hào)： S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）02-0163-06

0 引言

【研究意義】轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié)，對(duì)植物啟動(dòng)子功能進(jìn)行研究不僅可以揭示相應(yīng)基因的表達(dá)模式，還能為利用植物基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因的高效特異性表達(dá)提供有效途徑。橡膠蛋白（Hevein）是膠乳的主要成分，可在乳管中高效表達(dá)，占可溶性蛋白質(zhì)的50%～70%，其基因家族成員HEV2.1基因啟動(dòng)子是乳管特異表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子（Van Parijs et al.，1991；Montoro et al.，2008）。橡膠樹(shù)3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶1（HbHMGR1）是橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶（Lynen，1969；Chye et al.，1992；馬曉曉等，2014），因此利用HEV2.1基因啟動(dòng)子和HbHMGR1基因構(gòu)建乳管特異性表達(dá)載體以轉(zhuǎn)化橡膠樹(shù)，對(duì)提高橡膠樹(shù)的產(chǎn)量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】早在20世紀(jì)60年代橡膠蛋白就已被認(rèn)識(shí)（Archer，1960），但在隨后的40年間除Broekaert等（1990）成功克隆獲得過(guò)一個(gè)編碼橡膠蛋白的cDNA序列（GenBank登錄號(hào)M36986）外，有關(guān)編碼橡膠蛋白基因及啟動(dòng)子的研究鮮有報(bào)道。2005年，Pujade-Renaud等利用文庫(kù)篩選法從橡膠樹(shù)基因組DNA中分離獲得5個(gè)編碼橡膠蛋白的基因，首次證明橡膠蛋白是由一個(gè)小基因家族所編碼；同時(shí)克隆獲得HEV1.1啟動(dòng)子（PHEV1.1）和HEV2.1啟動(dòng)子（PHEV2.1），并融合uidA基因轉(zhuǎn)化水稻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)啟動(dòng)子均能在轉(zhuǎn)基因水稻中驅(qū)動(dòng)uidA基因的表達(dá)，且以PHEV2.1的功能最強(qiáng)，能驅(qū)動(dòng)uidA基因在轉(zhuǎn)基因水稻的許多組織中高水平表達(dá)。Montoro等（2008）利用PHEV2.1融合uidA基因，并轉(zhuǎn)化橡膠樹(shù)分析其表達(dá)特性，結(jié)果表明，PHEV2.1驅(qū)動(dòng)uidA基因在根、莖、葉的乳管中特異性強(qiáng)表達(dá)，印證了Archer等（1969）關(guān)于橡膠蛋白在乳管細(xì)胞中特異性表達(dá)的觀點(diǎn)；隨后還發(fā)現(xiàn)PHEV2.1可受光誘導(dǎo)，驅(qū)動(dòng)uidA基因在葉片所有細(xì)胞類型中表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前尚無(wú)利用PHEV2.1構(gòu)建HbHMGR1乳管特異性表達(dá)載體的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)提取橡膠樹(shù)高產(chǎn)品種葉片基因組DNA，克隆橡膠樹(shù)乳管特異性啟動(dòng)子PHEV2.1，用其構(gòu)建乳管特異性植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，以期為下一步橡膠樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

橡膠樹(shù)優(yōu)良品種熱研7-33-97的幼嫩葉片采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所橡膠樹(shù)國(guó)家種質(zhì)圃，用于提取基因組DNA。植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-MCS（T-DNA：35S poly A-NPTII-35S promoter-NOS terminator-MCS-35S promoter-uidA-NOS Poly A）與HbHMGR1基因由農(nóng)業(yè)部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；pCAMBIA3301載體由海南大學(xué)畢政鴻惠贈(zèng)；大腸桿菌Trans5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD19-T、高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、T4 DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取及純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；限制性內(nèi)切酶Hind III、Pst I和Xma I購(gòu)自美國(guó)NEB公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 橡膠樹(shù)葉片基因組DNA提取 橡膠樹(shù)葉片基因組DNA提取參照鐘淦彬等（2010）和鄒智等（2014）的方法進(jìn)行小量提取。

1. 2. 2 橡膠樹(shù)乳管特異性啟動(dòng)子PHEV2.1克隆 根據(jù)Pujade-Renaud等（2005）報(bào)道的HEV2.1序列（NCBI登錄號(hào)AY247789）截取起始密碼子前的1830 bp堿基序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物PHF1（5'-CCC

因組DNA為模板，以PHF1和PHR1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收、加尾“A”后，克隆至pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，經(jīng)12～16 h的培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用NCBI網(wǎng)上的BLASTn工具進(jìn)行序列同源性分析。

1. 2. 3 HbHMGR1乳管特異性植物表達(dá)載體構(gòu)建及酶切鑒定 分別以Xba I和Xma I對(duì)pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGR1進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收pCAMBIA3301的大片段和pCAMBIA2301-HbHMGR1的小片段，將兩片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-HbHMGR1；再用Hind III和Pst I分別對(duì)pCAMBIA3301-HbHMGR1和pMD19-T-PHEV2.1進(jìn)行雙酶切，電泳結(jié)束后對(duì)pCAMBIA3301-HbHMGR1的大片段和pMD19-T-PHEV2.1的小片段進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒，并用Hind III、Pst I和Xma I對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定，確認(rèn)是否得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒為pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1；最后用Hind III和Xma I將PHEV2.1-HbHMGR1重組片段從pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1上切下，將其連接到pCAMBIA2301-MCS的Hind III和Xma I間，獲得植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒，用Hind III和Xma I進(jìn)行酶切鑒定，確認(rèn)HbHMGR1乳管特異性植物表達(dá)載體構(gòu)建是否成功。

2 結(jié)果與分析

2. 1 橡膠樹(shù)葉片基因組DNA的提取結(jié)果

從橡膠樹(shù)熱研7-33-97的葉片中小量提取基因組DNA，取2.0 μL稀釋5倍后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)其純度。由圖1可以看出，提取獲得的橡膠樹(shù)葉片基因組DNA條帶整齊、清晰、完整性好、無(wú)明顯的雜質(zhì)和降解現(xiàn)象。利用微型紫外分光光度計(jì)測(cè)定，其濃度約100 ng/μL。

2. 2 橡膠樹(shù)乳管特異性啟動(dòng)子PHEV2.1的克隆及序列分析結(jié)果

以橡膠樹(shù)熱研7-33-97的葉片基因組DNA為模板，用特異性引物PHF1和PHR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條近2000 bp左右的條帶。經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序結(jié)果證實(shí)，從熱研7-33-97基因組中擴(kuò)增獲得的PHEV2.1為1852 bp。將所獲得的序列錄入NCBI的BLASTn數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//blast.Ncbi.Nlm.Nih.gov/ Blast.cgi？ PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BLastSea-

rch&LINK_LOC=blasthome）與Pujade-Renaud等（2005）報(bào)道的PHEV2.1序列（GenBank登錄號(hào)AY247789.1）進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示，克隆獲得的PHEV2.1啟動(dòng)子序列與AY247789.1啟動(dòng)子序列的同源性為98.6%，相對(duì)于AY247789.1啟動(dòng)子序列（以此堿基序號(hào)為準(zhǔn)），其差異主要表現(xiàn)為：164G突變?yōu)門(mén)，475T和476T間多了一個(gè)AT， 582T突變?yōu)锳，591T和592T間多了一段CACA

TATTTTGCCTCTGTT序列，845C突變?yōu)門(mén)，874A和875T間多了一個(gè)A。

2. 3 植物表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果

分別采用Hind III、Pst I、Xma I和Hind III、Xma I對(duì)pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1進(jìn)行酶切，其中，三酶切獲得一條與雙酶切等同的大片段和一條近2000 bp的條帶，近2000 bp的條帶為大小相近的PHEV2.1片段（1852 bp）和HbHMGR1片段（1728 bp），兩者由于大小相近而重疊顯示為一條條帶。此外，雙酶切獲得的小片段介于3000～5000 bp，與3592 bp的PHEV2.1-HbHMGR1重組片段大小一致。再以PHEV2.1的上游引物PHHF和HbHMGR1的下游引物PHHR對(duì)pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，也獲得一條介于3000～5000 bp的條帶，與雙酶切獲得的小片段一致，說(shuō)明中間植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1已構(gòu)建成功。

提取質(zhì)粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，以pCAMBIA2301-MCS為陰性對(duì)照、pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1為陽(yáng)性對(duì)照，分別采用Hind III和Xma I對(duì)其進(jìn)行雙酶切，結(jié)果表明，pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1經(jīng)雙酶切后得到一條與陽(yáng)性對(duì)照小片段等同且介于3000～5000 bp的小片段和一條在10000 bp以上的大片段，小片段與PHEV2.1-

3 討論

由于生物具有遺傳多樣性，即使是同一物種不同品種間的基因組DNA在遺傳組成上也存在差異，從不同品種基因組中克隆獲得的同源啟動(dòng)子也時(shí)有差異。魯旭（2014）在研究橡膠樹(shù)HbFCA功能時(shí)，用DNAMAN軟件對(duì)比了克隆自熱研7-33-97、邊沁橡膠、少花橡膠、光亮橡膠、光亮矮生橡膠、2131野生種、色寶橡膠、熱研幼花和熱研預(yù)測(cè)等9個(gè)橡膠樹(shù)品種的HbFCA啟動(dòng)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)品種的HbFCA啟動(dòng)子同源性為98.77%，其中熱研幼花與熱研預(yù)測(cè)的相似性達(dá)99.95%。這種現(xiàn)象同樣存在于單子葉植物中，蕭鳳回（2008）通過(guò)分析大麥、水稻干旱可誘導(dǎo)基因LEA啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)克隆自不同品種的同源啟動(dòng)子序列間均存在一定差異。本研究根據(jù)Pujade-Renaud等（2005）報(bào)道的PHEV2.1序列（GenBank登錄號(hào)AY247789.1）設(shè)計(jì)引物，以橡膠樹(shù)熱研7-33-97的基因組DNA為模板，多次PCR擴(kuò)增均獲得一段1852 bp的序列，經(jīng)BLASTn比對(duì)分析證實(shí)，多次克隆獲得的序列均相同，但與Pujade-Renaud等（2005）克隆自橡膠樹(shù)品種RRIM600的PHEV2.1序列略有差異，同源性為98.6%。

HbHMGR1是橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶（Lynen，1969；Chye et al.，1992；馬曉曉等，2014），其基因在乳管中特異性表達(dá)（Chye et al.，1991）。因此，提高HbHMGR1基因在橡膠樹(shù)乳管中的表達(dá)量，對(duì)促進(jìn)橡膠的生物合成及提高其產(chǎn)量具有重要意義。原始的植物表達(dá)載體pCAMBIA2301理論上只有唯一的1個(gè)Pst I限制性酶切位點(diǎn)，但實(shí)際應(yīng)用中的pCAMBIA2301載體上常存在2個(gè)突變?cè)黾拥腜st I酶切位點(diǎn)。為此，本研究將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上，經(jīng)雙酶切后再克隆至pCAMBIA2301載體上，能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題，成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-

PHEV2.1-HbHMGR1。該研究結(jié)果為進(jìn)一步利用乳管特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)化橡膠樹(shù)及研究HbHMGR1基因在乳管中表達(dá)促進(jìn)膠乳生物合成的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上再克隆至pCAMBIA2301載體上，能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301載體上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題，成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

參考文獻(xiàn)：

魯旭. 2014. 橡膠樹(shù)HbFCA基因功能解析[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué).

Lu X. 2014. Functional analysis of HbFCA gene in rubber tree （Hevea brasiliensis）[D]. Haikou：Hainan University.

馬曉曉，李哲，戴雪梅，畢政鴻，方家林，黃華孫，李運(yùn)合，賀永國(guó). 2014. 橡膠樹(shù)HbHMGR1基因克隆及其愈傷組織轉(zhuǎn)化[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，45（5）：818-823.

Ma X X，Li Z，Dai X M，Bi Z H，F(xiàn)ang J L，Huang H S，Li Y H，He Y G. 2014. Gene cloning of HbHMGR1 and genetic transformation of callus in Hevea brasiliensis[J]. Journal of Southern Agriculture，45（5）：818-823.

蕭鳳回. 2008. 大麥、水稻干旱可誘導(dǎo)LEA基因啟動(dòng)子的克隆及功能分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué).

Xiao F H. 2008. Cloning and functional analyses of LEA gene promoters drought-inducible in barley and rice[D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University.

鐘淦彬，李維國(guó)，鄭學(xué)項(xiàng)，李海林，顏園園，易曉潔，陳祖興. 2010. 一種快速高效適于橡膠樹(shù)葉片AFLP分析的DNA提取方法[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，30（5）：1-5.

Zhong G B，Li W G，Zheng X X，Li H L，Yan Y Y，Yi X J，Chen Z X. 2010. A simple and effective DNA extraction method for AFLP analysis in Hevea brasiliensis Muell Arg[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture，30（5）：1-5.

鄒智，劉建汀，莊美露，楊禮富. 2014. 橡膠樹(shù)AtSAG12同源基因的克隆與表達(dá)特性分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，27（5）：2168-2172.

Zou Z，Liu J T，Zhuang M L，Yang L F. 2014. Molecular cloning and expression analysis of Arabidopsis SAG12 homologue from rubber tree（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，27（5）：2168-2172.

Archer B L，Audley B O G，McSweeney G P，Tan C H. 1969. Studies on composition of latex serum and bottom fraction particles[J]. Journal of the Rubber Research Institute of Malaya， 21：560-569.

Archer B L. 1960. The proteins of Hevea brasiliensis latex. 4. Isolation and characterization of crystalline hevein[J]. The Biochemical Journal，75（2）：236-240.

Broekaert I，Lee H I，Kush A，Chua N H，Raikhel N. 1990. Wound-induced accumulation of mRNA containing a hevein sequence in laticifers of rubber tree（Hevea brasiliensis）[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，87（19）：7633-7637.

Chye M L，Kush A，Tan C T，Chua H. 1991. Characterization of cDNA and genomic clones encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase from Hevea brasiliensis[J]. Plant Molecular Biology，16（4）：567-577.

Chye M L，Tan C T，Chua N H. 1992. Three genes encode 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in Hevea brasiliensis：hmg1 and hmg3 are differentially expressed[J]. Plant Molecular Biology，19（3）：473-484.

Lynen F. 1969. Biosynthetic pathways from acetate to natural products[J]. Pure and Applied Chemistry，14（1）：137-168.

Montoro P，Lagier S，Baptiste C，Marteaux B，Pujade-Renaud V，Leclercq J，Alemanno L. 2008. Expression of the HEV2.1 gene promoter in transgenic Hevea brasiliensis[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture， 94（1）：55-63.

Pujade-Renaud V，Sanier C，Cambillau L，Pappusamy A，Jones H，Ruengsri N，Tharreau D，Chrestin H，Montoro P，Narangajavana J. 2005. Molecular characterization of new members of the Hevea brasiliensis hevein multigene family and ana-

lysis of their promoter region in rice[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1727（3）：151-161.

Van Parijs J，Broekaert W F，Goldstein I J，Peumans-Planta W J. 1991. Hevein：an antifungal protein from rubber-tree（Hevea brasiliensis） latex[J]. Planta，183（2）：258-264.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）