曾蘋 侯雷 和秀麗 王瑩 馬武開

【摘 要】目的：探討潤燥靈對(duì)干燥綜合征模型小鼠脾臟的影響。方法：將90只C57bl/6j小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，醋酸潑尼松組和潤燥靈高、中、低劑量組，每組15只?？瞻讓?duì)照組正常飼養(yǎng)，其余各組采用免疫誘導(dǎo)法建立干燥綜合征模型小鼠，各治療組予潤燥靈高、中、低劑量中藥及醋酸潑尼松灌胃治療，用藥4周后眼球取血，處死小鼠后無菌取出脾臟，HE染色，觀察病理切片，并采用MTT法檢測(cè)脾T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力。結(jié)果：脾臟病理切片觀察顯示，模型對(duì)照組脾臟較空白對(duì)照組脾臟結(jié)構(gòu)廣泛破壞，白髓廣泛增生，紅髓萎縮，脾血竇結(jié)構(gòu)不清。潤燥靈高劑量組及醋酸潑尼松組與空白對(duì)照組比較，未見明顯病理改變。潤燥靈中、低劑量組脾臟白髓呈不同程度增生，紅髓呈不同程度萎縮。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組OD值明顯高于空白對(duì)照組，2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.01）；除潤燥靈低劑量組外，其余3個(gè)治療組均低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。結(jié)論：潤燥靈能夠抑制干燥綜合征模型小鼠ConA誘導(dǎo)的脾T淋巴細(xì)胞的增殖，修復(fù)干燥綜合征模型小鼠脾臟的免疫損害。

【關(guān)鍵詞】 干燥綜合征；潤燥靈；T細(xì)胞；涎腺；動(dòng)物模型；脾臟

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.03.002

Study on the Effect of Runzao Ling（潤燥靈）on the Spleen of Mouse with Sj?gren's Syndrome

ZENG Ping，HOU Lei，HE Xiu-li，WANG Ying，MA Wu-kai

【ABSTRACT】Objective：To explore the effect of Runzao Ling（潤燥靈）on the spleen of mouse with sj?gren's

syndrome.Methods：Ninety C57bl/6j mice were randomly divided into a blank control group，a model control group，a prednisone acetate group and the high，medium and low dose groups of Runzao Ling，15 mice in each group.The blank control group was fed normally.The rest groups were used to establish Sjogren's syndrome models by immune induction.All the treatment groups were given high，medium and low doses of Runzao Ling and prednisone by gavages.After

4 weeks of medication，blood of them was drawn from their eyeballs.Then killed the mice，took out their spleen sterilely and did HE staining to observe the pathological sections.MTT was used to detect proliferation transformation ability of the splenic T lymphocytes.Results：According to the spleen pathological sections，spleens of the model control group were more destroyed than those of the blank control group.Their white pulp had hyperplasia，red pulp had atrophy，and splenic sinusoid structure was not clear.The Runzao Ling high dose group and the prednisone group had no significant pathological changes compared with the blank control group.The white pulp of the spleens in the medium and Runzao Ling low dose groups had hyperplasia in different degrees，and their red pulp showed different degrees of atrophy.MTT assay showed that the OD value of the model control group was higher than that of the control group，with significant difference between them（P < 0.01）.Except for the low dose group，the OD value of the other three treatment groups was lower than that in the model control group，and the difference was statistically significant（P < 0.01）.

Conclusion：Runzao Ling can inhibit the proliferation of splenic T lymphocytes induced by ConA in the mice of sj?gren's syndrome and repair the immune damage of their spleens.

【Keywords】 sj?gren's syndrome；

Runzao Ling（潤燥靈）；T lymphocyte；salivary

gland；animal model；spleen

干燥綜合征（sj?gren's syndrome，SS）是一種以侵犯涎腺、淚腺等外分泌腺為主，具有高度淋巴細(xì)胞浸潤的自身免疫性疾病，可見于任何年齡，最常見于40～60歲的女性，其發(fā)病率在風(fēng)濕免疫病中居第2位，僅次于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[1]。本病病理為淋巴及漿細(xì)胞浸潤，脾臟是機(jī)體最大的外周淋巴器官，當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激或機(jī)體免疫紊亂時(shí)，脾臟中T細(xì)胞便會(huì)克隆增殖。本病屬中醫(yī)學(xué)“燥證”“燥毒”“燥痹”等范疇。筆者認(rèn)為，津虧、血瘀、燥毒是其發(fā)病特點(diǎn)，采用潤燥解毒、養(yǎng)陰生津、化瘀通絡(luò)的治療方法，辨證與辨病相結(jié)合，組成潤燥靈方，經(jīng)臨床驗(yàn)證取得良好治療效果[2]。筆者建立SS模型小鼠，探討潤燥靈方對(duì)SS模型小鼠脾臟的修復(fù)作用及對(duì)脾臟中T細(xì)胞的干預(yù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇C57bl/6j小鼠90只，SPF級(jí)，雌性，8周齡，體質(zhì)量約20 g，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（軍）2012-0011。Lewis大鼠20只，SPF級(jí)，雌性，8周齡，體質(zhì)量約150 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 潤燥靈為本科室經(jīng)驗(yàn)方，由腫節(jié)風(fēng)10 g、姜黃10 g、白花蛇舌草10 g、生地黃15 g、玄參15 g、紫草10 g、當(dāng)歸10 g、赤芍15 g、金銀花10 g等組成。生藥購自本院藥房。上藥加水浸泡10 min，煎煮2次，每次30 min，合并濾液，濃縮成每毫升含生藥5 g液體，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。醋酸潑尼松（浙江仙琚制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)140746）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 百白破疫苗（武漢生物制品股份有限公司，批號(hào)20140104-2）由貴州省湄潭縣衛(wèi)生防疫站提供；SIGMA弗氏完全佐劑（批號(hào)SLBJ2845V）；考馬斯亮蘭試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20140710）；MTT（索萊寶生物科技，批號(hào)20150119）；紅細(xì)胞裂解液（索萊寶生物科技，貨號(hào)R1010）；ConA（SIGMA，貨號(hào)C-2010）；異丙醇（富宇試劑，XK13-011-00015）；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛（索萊寶生物科技，貨號(hào)P1110），PBS緩沖液（HYCLONE，SH30256）。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組 將90只C57bl/6j小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，醋酸潑尼松組和潤燥靈高、中、低劑量組，每組15只。

2.2 動(dòng)物模型的建立 參照Cutler方法加以改進(jìn)[3]，

在無菌條件下取Lewis大鼠頜下腺，電動(dòng)勻漿，4 ℃，1000 g，15 min離心，保留上清；向沉淀中加入

2 mL PBS，再次勻漿、離心，將2次上清液混合，4 ℃，10 000 g，15 min離心，保留沉淀加入1 mL PBS，冰浴保存；取上清4 ℃，25 000 g，15 min離心，保留沉淀加入1 mL PBS，冰浴保存；取上清4 ℃，40 000 g，15 min離心，保留沉淀加入1 mL PBS，冰浴保存；取上清4 ℃，100 000 g，15 min離心，保留沉淀加入1 mL PBS，冰浴保存，棄上清；將4次沉淀混合，采用考馬斯亮藍(lán)比色法，測(cè)定抗原質(zhì)量分?jǐn)?shù)為

8.7 mg·mL-1，加入PBS緩沖液稀釋抗原質(zhì)量分?jǐn)?shù)至2 mg·mL-1，再加入同體積弗氏完全佐劑，制備成最終抗原質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 mg·mL-1。除空白對(duì)照組外，其余模型對(duì)照組及用藥組首次免疫，每只小鼠背部、腹部注射抗原，總量為每只0.2 mL；第

2天予背部、腹部注射百白破疫苗0.5 mL，此后每隔14 d再加強(qiáng)免疫1次，除空白對(duì)照組外，其余模型對(duì)照組及用藥組再次加強(qiáng)免疫，每只小鼠背部、腹部注射抗原，總量為每只0.2 mL；第2天予背部、腹部注射百白破疫苗0.5 mL，產(chǎn)生類似于人SS的唾液腺改變及臨床表現(xiàn)特點(diǎn)，連續(xù)免疫4周。

2.3 給藥方法 建立動(dòng)物模型，第5周開始灌胃給藥。根據(jù)人與小鼠體表面積換算給藥，潤燥靈中劑量組為人的等效劑量（給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5 g·mL-1），

潤燥靈高劑量組為人等效量2倍量（給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g·mL-1），潤燥靈低劑量組為人等效量1/2量（給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25 g·mL-1），醋酸潑尼松組為人的等效劑量（給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 mg·mL-1），

各組均每日灌服2 mL，連續(xù)灌胃給藥4周。

2.4 病理學(xué)檢測(cè) 于第8周眼球取血，處死小鼠，立即取出小鼠脾臟。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，由專業(yè)病理人員在光學(xué)顯微鏡下閱片。

2.5 小鼠脾臟T細(xì)胞增殖檢測(cè) 無菌取脾，分離成單個(gè)細(xì)胞，調(diào)脾淋巴細(xì)胞質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5×106·mL-1，

加入96孔板中，每孔100 μL。用含ConA刺激物的1640完全培養(yǎng)液補(bǔ)足至每孔200 μL，最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 μg·mL-1，每組設(shè)3個(gè)平行孔。將培養(yǎng)板放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)板3000 r·min-1，離心5 min，棄去上清，用濾紙吸去水分后，每孔加入酸化異丙醇100·L-1，靜置15 min，輕輕混勻后，492 nm波長測(cè)OD值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 脾臟病理切片 空白對(duì)照組小鼠脾臟脾血竇分布于脾小體之間，未見擴(kuò)散。紅、白髓分布整齊，排列均勻。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，脾臟結(jié)構(gòu)廣泛破壞，白髓區(qū)脾小體廣泛增生，期間見大量淋巴細(xì)胞及單核、多核巨噬細(xì)胞增生。紅髓萎縮，脾血竇結(jié)構(gòu)不清。潤燥靈高劑量組及醋酸潑尼松組較正常組比較未見明顯病理改變。潤燥靈中劑量組脾臟結(jié)構(gòu)不規(guī)則，白髓區(qū)輕度增生。潤燥靈低劑量組脾臟結(jié)構(gòu)破壞，白髓增生明顯，淋巴細(xì)胞、單核、多核巨噬細(xì)胞散在分布于紅髓之間。見圖1。

3.2 各組小鼠脾臟T細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力比較 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組OD值明顯高于空白對(duì)照組，2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.01）；各用藥組治療后T細(xì)胞增殖有不同程度下降，除潤燥靈低劑量組外，其余3組與模型對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；潤燥靈高、中劑量組T細(xì)胞的增殖與醋酸潑尼松組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

4 討 論

SS是一種以侵犯外分泌腺為主的慢性、炎癥性自身免疫病。臨床上除口眼干澀等主要癥狀外，還會(huì)出現(xiàn)受累腺體T淋巴細(xì)胞浸潤、外周血中免疫球蛋白含量增多和高水平的自身抗體等免疫系統(tǒng)紊亂的表現(xiàn)。脾是機(jī)體最大的外周淋巴器官，其中含有大量的T細(xì)胞和B細(xì)胞，當(dāng)這些免疫細(xì)胞被抗原刺激后，引起T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖。SS屬中醫(yī)學(xué)“燥證”“燥痹”“燥毒”等范疇[4]。中醫(yī)藥較西藥治療SS具有明顯優(yōu)勢(shì)。根據(jù)SS的發(fā)病特點(diǎn)，本課題組將SS的主要病因病機(jī)歸為陰虛、瘀血及燥毒相互搏結(jié)[5-6]，而致五臟六腑失其所養(yǎng)，五官九竅失其滋潤。潤燥靈方對(duì)改善SS癥狀有較好療效[2]。朱躍蘭[7]也認(rèn)為，SS的病機(jī)在于燥、毒、瘀三者間的相互作用，并指出治療當(dāng)以潤燥、解毒、活血為原則。劉維[8]指出，治療SS應(yīng)以清熱解毒、潤燥護(hù)陰為原則。潤燥靈方中腫節(jié)風(fēng)、玄參、白花蛇舌草清熱解毒，當(dāng)歸潤燥活血，姜黃、紫草、赤芍化瘀通絡(luò)，生地黃養(yǎng)陰生津。

本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組小鼠比較，脾臟病理改變明顯。潤燥靈高劑量組、醋酸潑尼松組與空白對(duì)照組脾臟比較，未見明顯病理改變。潤燥靈中、低劑量組脾臟均有較明顯病理改變，且潤燥靈中劑量組脾臟的病理改變較潤燥靈低劑量組輕。說明潤燥靈濃度越高對(duì)小鼠脾臟的修復(fù)效果越好，并且潤燥靈高劑量對(duì)修復(fù)小鼠脾臟的作用同醋酸潑尼松相當(dāng)。

SS模型小鼠脾臟中T細(xì)胞的增殖能力經(jīng)MTT法檢測(cè)顯示，模型對(duì)照組SS小鼠脾臟中T細(xì)胞的增殖明顯高于空白對(duì)照組（P < 0.01）；加用潤燥靈治療后，高、中、低劑量組均有較明顯改善，各用藥組治療后小鼠脾臟中T細(xì)胞的增殖均明顯小于模型對(duì)照組（P < 0.01），說明醋酸潑尼松與潤燥靈均可以抑制SS模型大鼠體內(nèi)亢進(jìn)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。但潤燥靈高、中、低劑量組對(duì)SS小鼠脾臟T細(xì)胞的增殖抑制作用不及醋酸潑尼松對(duì)照組（P < 0.01），說明潤燥靈對(duì)抑制SS模型大鼠體內(nèi)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力不及醋酸潑

尼松。

在以前的研究中，筆者對(duì)潤燥靈治療SS的作用機(jī)制進(jìn)行了探討，其能夠通過調(diào)節(jié)SS模型小鼠水分子通道蛋白5，改善模型小鼠的唾液量[9-10]。本次研究觀察了潤燥靈對(duì)SS模型小鼠的治療作用，并對(duì)其免疫機(jī)制做了初步探討，為后續(xù)進(jìn)一步探討潤燥靈對(duì)于T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用打下基礎(chǔ)。

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收稿日期：2015-09-03；修回日期：2015-12-07