張麗 李霆格 楊文漢 曾媛 李婧 梅晶晶 趙安瑾 王健

摘 要 茶樹油具有良好的抑菌能力，在果蔬天然保鮮殺菌劑的開發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景。采用濾紙擴散法測定不同濃度的茶樹油對香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌的離體抑制效果。結(jié)果顯示，茶樹油對這2種菌都具有良好的抑菌效果，且濃度增加，抑菌作用逐漸增強，對芒果炭疽菌和香蕉炭疽菌的EC50分別為339.13和143.10 μL/L。

關(guān)鍵詞 茶樹油 ；香蕉炭疽菌 ；芒果炭疽菌 ；抑菌率

分類號 S789；TQ658 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.03.011

Abstract Tea tree oil has good prospects in development and application of natural fresh-keeping preservatives in fruits， vegetables for its ability of anti-microbial effect. In this research in vitro inhibition effect of tea tree oil on Colletotrichum musae and C. gloeosporioides under different concentrations were studied with filter paper dispersion method. The results showed that the tea tree oil had significant inhibition on mycelial growth of the two fungi. As the concentration increased， the antimicrobial activity increased accordingly. The results of experiment revealed the EC50 of tea tree oil on C. gloeosporioides and C. musae were respectively 339.13 μL/L and 143.10 μL/L.

Keywords tea tree oil ； Colletotrichum musae ； Colletotrichum gloeosporioides ； antimicrobial rate

茶樹油（Tea tree oil，TTO） 是指取自于桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬（Melaleuca L.）的數(shù)種植物的精油，其中最主要的一種為互葉白千層（M. alternifola），故又稱為互葉白千層油，“茶樹油”是其商業(yè)名稱[1]。茶樹油是一種無色或淺黃色液體，具有令人愉快的豆蔻氣味[2]。茶樹油具有廣譜抗菌、抗真菌、抗病毒和抗炎活性[3]，對痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes，G+）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccus aureus，G+）、表皮葡萄球菌（Staphyloccusepidermidis，G+）具有較強的抑制作用[1]。它無毒、無腐蝕，且不會把細菌、病毒、微菌殺死，只是適當?shù)囊种破渖L[4]，其藥用價值使得它在外科、牙科和婦科臨床上都得到了廣泛應(yīng)用[5]。

香蕉炭疽病是香蕉果實采后最主要的病害之一，是由香蕉炭疽菌[C. musae （Berk. & Curt.） Arx.]引起，該病菌具有潛伏性，在香蕉幼果期就可侵入果實果皮內(nèi)部，直至果實成熟，癥狀才開始顯現(xiàn)，如果不采取防治措施，會造成果實大量腐爛，嚴重影響香蕉的果實品質(zhì)和食用價值[6]。

芒果炭疽病是芒果生產(chǎn)中發(fā)生最普遍、危害性最大的一種真菌病害，是由芒果炭疽菌（C. gloeosporioides Pens）引起。該病害具有潛伏性，芒果在幼果期染病后，病菌以侵染絲在果皮中滯育，不會引發(fā)癥狀，果實成熟時或儲運期間才陸續(xù)表現(xiàn)癥狀，感病部分會出現(xiàn)不規(guī)則的黑色斑塊，與未感病部分有明顯的分界，會微下陷且有裂痕，最后導致果實變黑腐爛，嚴重影響果實的產(chǎn)量和品質(zhì)[7]。

炭疽病是熱帶蔬果采后的一種重要病害之一。目前，對于蔬果仍以化學殺菌劑為主，但長期使用化學殺菌劑不僅會使病菌產(chǎn)生抗藥性，而且農(nóng)藥殘留還會導致環(huán)境污染及威脅人類健康等。因此，研究安全有效的防治措施勢在必行，其中生物防治是目前最有應(yīng)用前景的措施之一[8]。茶樹油是世界公認的抗菌較好的植物精油[1]，它以一種膜破壞劑的形式發(fā)揮作用，通過破壞膜的結(jié)構(gòu)，使得細胞的形態(tài)發(fā)生改變，從而達到抑菌的效果[9]。朱德明等[10]采用瓊脂培養(yǎng)基擴散法研究茶樹油對芭蕉炭疽病菌的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.05%濃度的茶樹油對其有明顯抑制效應(yīng)。但是由于茶樹油不易溶于水，采用瓊脂培養(yǎng)基擴散法可能會降低抑菌效果。本研究利用濾紙擴散法，測定茶樹油對芒果炭疽菌和芭蕉炭疽菌的抗菌效果，為利用茶樹油研制高效、低毒、綠色熱帶蔬果的抗病劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

茶樹油由海南大學園藝園林學院實驗室提供。

1.1.2 供試菌種

香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌由海南大學園藝園林學院實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g；葡萄糖20 g；瓊脂20 g；去離子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌落直徑和抑菌率測定

選直徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿，倒入PDA培養(yǎng)基，冷卻凝固后接入菌種。待菌絲長滿培養(yǎng)皿，用直徑為0.8 cm的打孔器在上述菌落邊緣切下帶菌培養(yǎng)基。將平板倒置，取一張直徑為9 cm的無菌濾紙置于皿蓋中央，吸取不同體積的茶樹油滴于濾紙片上，使其濃度分別為60、120、180、240、300、360 μL/L，用于香蕉炭疽病菌的測試；再吸取不同體積的茶樹油滴于濾紙片上，使其終濃度分別為50、100、200、300、400、500 μL/L，用于芒果炭疽病菌的測試。以濾紙上不添加茶樹油的培養(yǎng)皿為空白對照。每處理重復3次。將接種后的培養(yǎng)皿密封后置于25℃培養(yǎng)箱中。接種2、4、6、8、10 d后，觀察記錄菌絲的長勢，并測量培養(yǎng)皿的菌落直徑。待相應(yīng)對照培養(yǎng)皿長滿時停止觀察和測量。每個菌落按十字交叉法測量2次，取其平均值代表菌落的大小，抑菌率計算公式為：

抑菌率（%）=（dC-dT）×100/（dC-0.8）。

式中，dC：對照菌落直徑（cm）；dT：不同處理條件下的菌落直徑（cm）；0.8：接種菌塊的直徑（cm）。

1.2.2 數(shù)據(jù)記錄與分析

采用Excel 和DPS 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，所有試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度茶樹油對菌絲生長速率的影晌

2.1.1 芒果炭疽菌菌絲生長速率

不同濃度的茶樹油處理后，芒果炭疽菌菌絲生長速率不同，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，與空白試驗對照，加入茶樹油后芒果炭疽菌菌絲的生長速率都減緩、速率增長梯度減小，在第4天的菌絲生長直徑中，大于300 μL/L幾乎不長菌絲，且隨著茶樹油濃度的逐步加大，菌絲的生長速率越來越小、增長梯度趨于平緩。當茶樹油濃度為400和500 μL/L時，菌絲幾乎停止生長，說明茶樹油濃度大于400 μL/L時，對芒果炭疽菌菌絲的抑制效果明顯。

2.1.2 香蕉炭疽菌菌絲生長速率

不同濃度的茶樹油處理后，香蕉炭疽菌菌絲生長速率不同，結(jié)果見圖2。

與空白試驗對照，加入茶樹油后的香蕉炭疽菌菌絲生長速率也都減緩、速率增長梯度也減小，隨著茶樹油濃度的逐步加大，菌絲的生長速率越來越小、增長梯度趨于平緩，且茶樹油的抑制效果很強，在對照組培養(yǎng)皿長滿菌絲時，濃度為360 μL/L組的菌絲幾乎不長。但隨著時間的增長，抑菌作用在減小。茶樹油濃度為240～360 μL/L時，菌絲生長速率接近，差異不顯著，說明240 μL/L濃度的茶樹油即可對香蕉炭疽病菌產(chǎn)生明顯的抑制作用。

2.2 抑菌率

2.2.1 芒果炭疽病抑菌率

不同濃度茶樹油對芒果炭疽病抑菌率變化如表1所示。

由表1可知，空白對照與加茶樹油有極顯著差異，說明添加茶樹油可以顯著抑制芒果炭疽菌的生長，處理50與100 μL/L、100與200 μL/L間無顯著差異，處理400與500 μL/L也無顯著差異?？梢缘贸?，茶樹油對芒果炭疽病菌有一定的抑制作用，且隨著茶樹油濃度的增加，抑制率也增強，400 μL/L以上濃度可以達到較高的抑制效果。以EC50作為衡量茶樹油對不同病原菌菌絲生長抑制活性大小的指標，茶樹油對芒果炭疽病菌的EC50為339.13 μL/L。

2.2.2 香蕉炭疽菌抑菌率

不同濃度茶樹油對香蕉炭疽菌抑菌率變化見表2。

由表2可知，空白對照組與加茶樹油組有極顯著差異，處理60與120 μL/L、180與240 μL/L間有顯著差異，處理120與180 μL/L無顯著差異，處理240與300 μL/L、300與360 μL/L間也無顯著差異。說明茶樹油對香蕉炭疽病菌有一定的抑制作用，且濃度越大，抑制效果越顯著。240 μL/L的濃度可以達到80%以上的抑菌率。實驗結(jié)果表明，茶樹油對香蕉炭疽病菌的EC50為143.10 μL/L。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

不同濃度茶樹油對芒果炭疽病菌和香蕉炭疽病菌均有抑制活性，隨著濃度的不斷增加，茶樹油的抑菌作用越強，當茶樹油濃度大于400 μL/L時，芒果炭疽病菌菌絲的抑菌效果顯著；大于240 μL/L時，對香蕉炭疽病菌的抑制效果顯著。茶樹油對芒果炭疽病菌的EC50為339.13 μL/L，對香蕉炭疽病菌的EC50為143.10 μL/L，說明茶樹油對香蕉炭疽菌抑制作用比芒果炭疽菌強。

3.2 討論

目前，控制果蔬采后病害的主要手段是使用化學殺菌劑，但化學殺菌劑對人類健康及自然環(huán)境都有嚴重危害和影響，因此，這一問題已受到全世界關(guān)注[11]。如果品生產(chǎn)中通常采用波爾多、多菌靈等化學農(nóng)藥對鮮果進行處理，以減少果品貯藏運輸過程中的損失及病蟲害。運用此方法處理的果品，食用安全性差，難以達到綠色食品衛(wèi)生要求[10]。茶樹油是目前所知活性最強的天然抗菌劑，可高效、無毒、無刺激地殺死真菌和細菌[12]。在國際上，茶樹油已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、化工等領(lǐng)域[12-13]。茶樹油作為食品香料使用，早已獲得美國的批準（FEMA號3902）[13]。茶樹油在焙烤食品、軟飲料、谷類早餐、糖果、油脂、冷凍乳制品、水果制品、糧食制品等中的平均使用濃度為10 mg/kg，平均最高濃度為50 mg/kg[13]。2003年，我國衛(wèi)生部發(fā)布的公告中，已將茶樹油列入食品香料名單[14]。這些都說明茶樹油是一種高效、低毒、安全的殺菌劑，使用茶樹油作為果蔬采后的生物殺菌劑，具有廣闊前途。

朱德明等[10]采用瓊脂培養(yǎng)基擴散法對茶樹油對芭蕉炭疽病菌的抑制作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)0.05%濃度的茶樹油對其有明顯抑制效應(yīng)。靜瑋等[15]以香蕉果實為材料，采用菌絲生長速率方法測定不同劑量（0～40 μL）的茶樹油及其主要成分（4-松油烯醇、α-松油醇、γ-松油烯和1.8-桉葉油素）對香蕉炭疽病菌的離體抗菌活性影響進行研究，結(jié)果表明，20～40 μL茶樹油能顯著抑制炭疽病菌的菌絲生長，且濃度越高，抑制效果越明顯；接種炭疽病菌的果實經(jīng)茶樹油處理后，病斑直徑顯著小于未處理果實。本研究采用濾紙擴散法，得到茶樹油對香蕉炭疽病菌的EC50為143.10 μL/L，說明茶樹油的揮發(fā)擴散蒸汽也可有效抑制香蕉炭疽病菌，與靜瑋等[15]的研究結(jié)果一致。

張胡煥等[16]采用生長速率法測定10種常用殺菌劑對芒果炭疽病菌的毒力。結(jié)果表明：45%咪鮮胺EW對芒果炭疽病菌生長的抑制作用最強，其EC50值為0.01 mg/L；40%氟硅唑EC、25%丙環(huán)唑EC、95%苯醚甲環(huán)唑TC、50%撲海因WP的抑制作用相對較強，其EC50值為0.03～0.81 mg/L；96%睛菌唑TC、15%三唑酮WP、96%百菌清TC、30%醚菌酯WP的抑制作用較小，其EC50值為4～65.2 mg/L；50%代森錳鋅WP抑制作用最小，其EC50值為105.0 mg/L。本實驗研究結(jié)果表明，茶樹油對芒果炭疽病菌EC50為339.13 μL/L，比大部分的化學殺菌劑都要低，更具優(yōu)勢。

綜上所述，茶樹油對香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌具有明顯的抑制作用，而且具有安全無毒，操作方便的優(yōu)勢，在以后香蕉炭疽病和芒果炭疽病的防治中，茶樹油具有廣闊的應(yīng)用前景。

致 謝 感謝海南大學園藝園林學院從心黎老師提供的香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌材料，特此致謝！

參 考 文 獻

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