劉海霞 莫海江 程玉紅 馬洪波 夏海東 洪偉 董紅星 陳軍營(yíng)

摘要：本研究首次在小麥幼胚脫分化過(guò)程中利用Affymetrix小麥基因芯片技術(shù)對(duì)MADS—box基因表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到20個(gè)MADS-box基因，其中14個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，6個(gè)基因混合表達(dá)。這些基因大量下調(diào)表達(dá)，推測(cè)其在小麥幼胚脫分化中具有較強(qiáng)的抑制作用。此外發(fā)現(xiàn)，12 h是小麥幼胚脫分化過(guò)程中MADS-box基因表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。選取CA670406、CK213813、CA608865和AB107992四個(gè)基因進(jìn)行半定量RT-PCR驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果與小麥基因芯片結(jié)果基本一致。

關(guān)鍵詞：小麥；MADS-box基因；基因芯片；幼胚；脫分化

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.101：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001—4942（2016）03—0009—05

MADS-box基因是由酵母中的MCM1、擬南芥中的AG、金魚(yú)草中的DEFICIENS和人類(lèi)中的SRF4種MADS-box基因的首字母縮寫(xiě)而成。MADS-box基因家族是一類(lèi)序列特異的多基因家族，其所編碼的MADS-box蛋白即為MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，它以多聚體的形式通過(guò)其保守結(jié)構(gòu)域與特定的DNA序列結(jié)合來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，其主要功能表現(xiàn)為激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在許多植物基因組中存在數(shù)量不等的MADS-box重復(fù)基因，研究較早較多的植物是擬南芥、金魚(yú)草和矮牽牛，之后在水稻、油菜、罌粟、豌豆、番茄、葡萄、玉米、小麥等多種植物中也發(fā)現(xiàn)了MADS-box基因的存在。MADS-box基因具有多種生物學(xué)功能，它不僅與植物花器官的發(fā)育、花時(shí)的調(diào)控以及其它生殖生長(zhǎng)過(guò)程有關(guān)，而且也在根的形成、葉的生長(zhǎng)和植物抗逆反應(yīng)中起作用，其中，在擬南芥根部表達(dá)的MADS—box基因至少有50個(gè)。隨著研究的深入，人們對(duì)MADS—box基因的研究逐漸拓展到小麥上來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)，TaVRT-1基因在春化誘導(dǎo)的植物中表達(dá)，該基因Vrn-1區(qū)域與春化處理和耐冬性有關(guān)。TaMADS#11是TaVRT-1的一個(gè)同源基因，同樣具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的功能。WP11和WP12是小麥中分離出來(lái)的兩個(gè)與心皮化有關(guān)的基因，表達(dá)部位集中在小花漿片原基和雄蕊原基，該基因?qū)儆贐組PI亞家族基因。TaMADS#82是一個(gè)與WP11表達(dá)模式相似的基因。此外發(fā)現(xiàn)，WAG基因與小麥幼穗發(fā)育有關(guān)，VRNl和VRN2基因與小麥開(kāi)花結(jié)實(shí)相關(guān)。MADS-box基因的研究雖然有增多趨勢(shì)，但在小麥中的研究仍處于起步階段，對(duì)小麥幼胚脫分化過(guò)程的研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)用豫麥18幼胚為材料，在2，4-D誘導(dǎo)條件下進(jìn)行脫分化處理，結(jié)合基因芯片技術(shù)，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)MADS-box基因的差異表達(dá)情況，對(duì)揭示它們?cè)谛←溣着呙摲只^(guò)程中的作用具有重要的參考意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

利用豫麥18作為試材，于小麥?zhǔn)诜酆?6 d采集幼穗在無(wú)菌條件下剝?nèi)∮着?，放置于MS+2，4-D（2 mg/L）培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，分別于脫分化處理0、2、6、12、24、72 h時(shí)取樣，用液氮處理，-70%低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1小麥幼胚總RNA的提取 總RNA的提取按QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit試劑盒操作程序進(jìn)行。總RNA純化按QIAGEN公司的RNeasy mini試劑盒操作程序進(jìn)行。用DEPC處理過(guò)的ddH20溶解RNA，瓊脂糖凝膠電泳（180V，0.5 h）對(duì)總RNA 28S和18S比例進(jìn)行檢測(cè)，在260/280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定總RNA的吸光值，計(jì)算其濃度和純度。

1.2.2小麥幼胚cDNA、cRNA的合成與純化按照Affymetrix公司方法進(jìn)行cDNA、cRNA合成。eDNA合成需取1～8μg總RNA作為模板。生物素標(biāo)記的eRNA合成需取12μL上述eDNA溶液作為模板。按基因芯片分析樣品純化操作程序?qū)DNA、cRNA進(jìn)行純化。按1.2.1方法對(duì)cDNA、eRNA濃度、純度和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。1.2.3

小麥幼胚cRNA片段化和芯片檢測(cè)

在1.5 mL無(wú)RNA酶、滅菌的離心管中加入濃度為1μg/μL的cRNA 15 μL，5×片段化緩沖液6 μL，無(wú)RNA酶水9μL，將體系混勻，94℃溫浴35min，冰上放置，獲得長(zhǎng)度為35～200 bp的cRNA片段。雜交液的配制按Affymetrix公司提供的配方進(jìn)行，再將其加入到經(jīng)過(guò)預(yù)雜交處理的Affy—metrix Wheat Gene Chip中，45℃、60 r/min雜交16 h。采用全自動(dòng)洗滌工作站450（Affymetrix公司，USA）對(duì)基因芯片進(jìn)行洗滌和染色，采用高分辨芯片掃描儀3000（Affymetrix公司，USA）對(duì)基因芯片進(jìn)行掃描，獲得各基因不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)信號(hào)值。

1.2.4小麥幼胚基因芯片檢測(cè)參數(shù)的獲取信號(hào)值的讀取、處理采用GCOSl.2軟件，并對(duì)獲取的信號(hào)值、信號(hào)檢出（P，A，M）以及試驗(yàn)與對(duì)照組問(wèn)的比值進(jìn)行歸一化處理。

1.2.5小麥幼胚基因芯片MADS—box家族基因的確認(rèn)

通過(guò)NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）、DATF（datf.cbi.pku.edu.cn）和DRTF（drtf.cbi.pku.edu.cn）等網(wǎng)站在擬南芥和水稻等植物數(shù)據(jù)庫(kù)中查找MADS—box家族相關(guān)基因的名稱，根據(jù)基因名稱在小麥基因芯片上查找相應(yīng)名稱，獲取各時(shí)間點(diǎn)的熒光信號(hào)值。計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)熒光信號(hào)值與0 h（對(duì)照）熒光信號(hào)值的比值，并算出各比值以2為底的對(duì)數(shù)，當(dāng)對(duì)數(shù)值小于-1為有意義下調(diào)差異表達(dá)，當(dāng)對(duì)數(shù)值大于+1為有意義上調(diào)差異表達(dá)。

1.2.6 MADS-box基因半定量RT-PCR驗(yàn)證

利用反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，用β-actin作為內(nèi)參，從MADS-box家族基因中抽取CA670406等4個(gè)基因進(jìn)行半定量RT-PCR驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1.0 μL，10×Buffer5.0 iμL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，25 mmol/LMgCl₂3.0 μL，20 μmol/L上下游引物各1.25 μL，5 U/μL Taq酶0.2μL，ddH₂O加至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55～57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。取5μL反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1 MADS-box基因家族中PI亞族基因的表達(dá)分析

編碼花器官相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PI（HSTILLATA protein）的基因?qū)儆诨òl(fā)育ABC模型中的B類(lèi)基因，在花瓣、雄蕊的形成中發(fā)揮作用。在小麥幼胚脫分化過(guò)程中，檢測(cè)到的PI轉(zhuǎn)錄因子基因在12～24 h下調(diào)表達(dá)，其靶基因WP11（AB107991）和WPI2（AB107992）分別在12、72 h和6～24 h下調(diào)表達(dá)（圖1）。推測(cè)在小麥幼胚脫分化過(guò)程中，PI轉(zhuǎn)錄因子基因及其靶基因具有一定的抑制作用。

2.2 MADS—box基因家族中AG亞族基因的表達(dá)分析

參與決定雄蕊、心皮、花分生組織形成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子AG（Floral homeotic protein）基因的研究較早出現(xiàn)在擬南芥和金魚(yú)草中，之后發(fā)現(xiàn)該類(lèi)基因在小麥成熟胚脫分化過(guò)程中表達(dá)。在小麥幼胚脫分化過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼AG的基因CA658343，其在12、72 h下調(diào)表達(dá)。具有獨(dú)立促進(jìn)心皮分化功能的靶基因SPT（SPATULA）有4個(gè)成員（CK213813、BE417035、CA608865、BJ272559），BJ272559僅在12 h有意義下調(diào)表達(dá)；BE417035在12 h下調(diào)，24～72 h轉(zhuǎn)為上調(diào)；CK213813、CA608865在2～6 h上調(diào)，12 h轉(zhuǎn)為下調(diào)，24～72h上調(diào)（圖1）。

2.3 MADS-box基因家族中AGL9亞族基因的表達(dá)分析

在小麥幼胚脫分化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)編碼調(diào)節(jié)外界信號(hào)反應(yīng)蛋白AGL9的5個(gè)基因（BJ221584、BJ276784、CA726603、CD374109、CN009238，圖1）。這5個(gè)基因在幼胚脫分化過(guò)程中均呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，其中在2、12 h全部下調(diào)。靶基因AG有一個(gè)成員（CA658343），僅在12、72 h表達(dá)。靶基因fbp2編碼果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase），有兩個(gè)成員（CD894372、CA686703），其中，CD894372在2～6、24～72 h上調(diào)表達(dá)，在12 h下調(diào)表達(dá)，CA686703僅在6～12h下調(diào)表達(dá)。

2.4 MADS—box基因家族中CO亞族基因的表達(dá)分析

CO亞族基因編碼開(kāi)花時(shí)間早晚的成花計(jì)時(shí)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄的mRNA達(dá)到一定域值時(shí)可顯著地促進(jìn)靶基因LFY的表達(dá)。本試驗(yàn)編碼轉(zhuǎn)錄因子CO的有4個(gè)基因（BE442521、BG906984、CA670406、CA730918），在小麥幼胚脫分化過(guò)程中呈下調(diào)趨勢(shì)，12 h時(shí)下調(diào)幅度最大，推測(cè)這4個(gè)基因在12 h抑制作用最強(qiáng)。其中，BG906984在2～72 h均下調(diào)。靶基因LFY（CD911368）在12 h下調(diào)（圖1）。推測(cè)在小麥幼胚脫分化過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子CO基因?qū)ζ浒谢騆FY（CD911368）可能具有一定的促進(jìn)作用。

2.5 RT-PCR檢測(cè)MADS-box基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性

根據(jù)小麥基因芯片信號(hào)值的高低，抽取CA670406、CK213813、CA608865和AB107992共4個(gè)MADS-box基因進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)（以β-actin內(nèi)參作為對(duì)照），對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)比較可知，小麥基因芯片結(jié)果與RT—PCR檢測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明Affymetrix小麥基因芯片數(shù)據(jù)相對(duì)可靠。

3結(jié)論與討論

MADS-box基因的生物學(xué)功能非常豐富，但前人研究?jī)?nèi)容主要側(cè)重于植物生殖生長(zhǎng)如花器官發(fā)育、種子發(fā)育、果實(shí)發(fā)育等方面，研究對(duì)象主要集中于擬南芥、水稻等植物。本試驗(yàn)在對(duì)小麥成熟胚脫分化中MADS-box基因的表達(dá)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，對(duì)小麥幼胚脫分化中MADS-box基因的表達(dá)變化進(jìn)行研究，證明MADS-box基因不僅在小麥成熟胚脫分化中表達(dá)，而且也在小麥幼胚脫分化中表達(dá)，拓寬了MADS-box家族基因在小麥中的表達(dá)范圍。此外，本研究再次證明MADS-box基因在生理學(xué)上具有分化、脫分化雙重功能。本試驗(yàn)共研究了20個(gè)MADS-box基因的表達(dá)變化，這些基因整體以下調(diào)表達(dá)為主，其中下調(diào)表達(dá)基因共14個(gè)，混合表達(dá)基因6個(gè)，表明小麥幼胚脫分化過(guò)程是一個(gè)受多個(gè)MADS-box基因控制的復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程。這些基因大量下調(diào)表達(dá)，推測(cè)它們?cè)谟着呙摲只幸种谱饔孟鄬?duì)較強(qiáng)。在小麥幼胚脫分化的各個(gè)時(shí)期，20個(gè)MADS-box基因在12 h均下調(diào)，其中19個(gè)基因的下調(diào)值是對(duì)照值的15倍，表明12 h是MADS-box基因大量表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。此外，MADS-box基因在幼胚脫分化中發(fā)生上調(diào)的有6個(gè)，表達(dá)強(qiáng)度變化較小，上調(diào)值達(dá)到對(duì)照3.7倍的僅有CD894372、BE417035、CK213813這3個(gè)基因，推測(cè)這些基因在小麥幼胚脫分化過(guò)程中具有一定的促進(jìn)作用。