楊偉克　唐芬芬　劉增虎　鐘健

摘要：【目的】探明5齡家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶基因表達(dá)及其酶活性變化規(guī)律，為解析家蠶回避桑葉1-脫氧野尻霉素（DNJ）毒害作用的適應(yīng)機(jī)制提供參考依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)5齡家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1和BmSuc2的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)和分析，同時(shí)測(cè)定β-呋喃果糖苷酶活性?！窘Y(jié)果】BmSuc1基因在5齡家蠶中腸的不同發(fā)育階段均有表達(dá)，其中在5齡起蠶和盛食期的相對(duì)表達(dá)量較高；而B(niǎo)mSuc2基因在整個(gè)5齡期的相對(duì)表達(dá)量均非常低。從5齡起蠶到熟蠶，β-呋喃果糖苷酶活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，以第5 d（盛食期）的酶活性最高，達(dá)158.82 U/mg。【結(jié)論】BmSuc1基因表達(dá)水平及β-呋喃果糖苷酶活性變化規(guī)律與5齡家蠶吸收利用桑葉蔗糖營(yíng)養(yǎng)的生理進(jìn)程基本一致，提示BmSuc1基因作為一種蔗糖水解酶基因在家蠶中腸組織消化吸收桑葉蔗糖營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞： 家蠶；β-呋喃果糖苷酶；BmSuc1基因；BmSuc2基因；酶活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S881.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）05-0721-05

Abstract：【Objective】In order to provide reference for illustrating adaptive mechanism of Bombyx mori avoiding toxicity of 1-deoxynojirimycin（DNJ）， the present study was conducted to investigate change regularities of β-fructofuranosidase gene expression and its enzyme activity in the midgut of the 5th instar B. mori larvae. 【Method】The real-time fluorescent quantitative PCR was applied to analyze expression of BmSuc1 and BmSuc2 genes in midgut of the 5th instar B. mori larvae， meanwhile the activities of β-fructofuranosidase were determined. 【Result】BmSuc1 gene was expressed in midgut of the 5th instar larvae at different developmental stages， moreover it was highly expressed at moulting and glutonous stages of the 5th instar larvae， while BmSuc2 gene was lowly expressed all the time at the 5th instar of larvae. Furthermore， the activity of β-fructofuranosidase showed a trend of ascending first and then descending from newly moulted silkworm to matured silkworm， especially at the 5th day of glutonous stage with the highest enzyme activity（158.82 U/mg）. 【Conclusion】The expression level of BmSuc1 gene and Chang of β-fructofuranosidase activity are corresponded with mulberry sucrose metabolism in the 5th instar larvae， therefore， it is revealed that BmSuc1 gene plays a leading role in midgut absorbing sucrose nutrition from mulberry leaves.

Key words： Bombyx mori； β-fructofuranosidase； BmSuc1 gene； BmSuc2 gene； enzymatic activity

0 引言

【研究意義】1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）能夠抑制α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）活性，但對(duì)β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）沒(méi)有抑制作用（Krasikov et al.，2001；Kiso et al.，2003）。DNJ能夠通過(guò)抑制昆蟲(chóng)腸道α-葡萄糖苷酶活性而阻止昆蟲(chóng)分解和吸收蔗糖營(yíng)養(yǎng)，使其不能正常生長(zhǎng)發(fā)育，甚至造成死亡（Kite et al.，1997；Asano et al.，2001）。桑樹(shù)的葉片、枝條和根莖等部位均富含DNJ，寡食性昆蟲(chóng)家蠶一生以桑葉為食物來(lái)源，之所以能有效避開(kāi)桑葉DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，主要是依賴(lài)β-呋喃果糖苷酶分解吸收桑葉中的蔗糖營(yíng)養(yǎng)（Asano et al.，2001；Daimon et al.，2008；張蕾等，2014）。家蠶5齡期是食桑量最大的階段，研究此階段β-呋喃果糖苷酶基因在家蠶中腸的表達(dá)變化規(guī)律，解析家蠶中腸蔗糖水解酶的功能及其活性，對(duì)闡明家蠶回避桑樹(shù)生物堿DNJ毒害作用的酶學(xué)適應(yīng)機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蔗糖是包括昆蟲(chóng)在內(nèi)所有動(dòng)物的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，分解蔗糖的水解酶有兩種：一種是催化葡萄糖側(cè)基的α-葡萄糖苷酶，另一種是催化果糖側(cè)基的β-呋喃果糖苷酶（Krasikov et al.，2001）。α-葡萄糖苷酶普遍存在于動(dòng)植物和微生物中，但動(dòng)物體內(nèi)不存在β-呋喃果糖苷酶、其蔗糖消化吸收主要依賴(lài)于α-葡萄糖苷酶水解作用的觀點(diǎn)長(zhǎng)期存在，影響著人們的科學(xué)判斷（Krasikov et al.，2001；Alberto et al.，2004）。早期的研究有報(bào)道β-呋喃果糖苷酶存在于少數(shù)幾種昆蟲(chóng)的腸液中（Santos and Terra，1986；Sumida et al.，1994；Carneiro et al.，2004），但一直未見(jiàn)相關(guān)基因的克隆鑒定。直到2008年，Daimon等率先在家蠶基因組中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與細(xì)菌性β-呋喃果糖苷酶基因具有較高同源性的基因，分別命名為BmSuc1和BmSuc2，且證實(shí)其編碼的蛋白質(zhì)在家蠶中腸中具有β-呋喃果糖苷酶活性特征。另外，有研究表明非食桑昆蟲(chóng)蓖麻蠶和柞蠶的體內(nèi)也存在β-呋喃果糖苷酶同源基因，其中蓖麻蠶有2個(gè)（ScSuc1和ScSuc2），柞蠶有3個(gè)（ApSuc1a、ApSuc1b和ApSuc2），但這些基因都不具備β-呋喃果糖苷酶的活性特征，說(shuō)明β-呋喃果糖苷酶與食桑/非食桑昆蟲(chóng)的食性選擇密切相關(guān)（張蕾，2014）。【本研究切入點(diǎn)】食桑昆蟲(chóng)家蠶分解桑葉中的蔗糖主要依賴(lài)于β-呋喃果糖苷酶而非α-葡萄糖苷酶，因此桑葉中高濃度的DNJ對(duì)其無(wú)毒害作用。目前，關(guān)于家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶活性及BmSuc1和BmSuc2基因表達(dá)的變化規(guī)律尚無(wú)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)整個(gè)5齡期家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶基因的表達(dá)量，并測(cè)定此時(shí)β-呋喃果糖苷酶的活性，旨在探明BmSuc1和BmSuc2基因及β-呋喃果糖苷酶在5齡家蠶中腸的變化規(guī)律，為解析家蠶回避桑葉生物堿DNJ毒害作用的適應(yīng)機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試家蠶為菁松×皓月，人工孵化，飼育溫度25.5～ 28.0 ℃，濕度60%～70%，桑葉飼養(yǎng)。取5齡起蠶至熟蠶的中腸組織，每頭蠶的中腸組織縱切分成兩份，一份用于抽提RNA，另一份用于酶活性測(cè)定。每次取樣均設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取5頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、Taq DNA聚合酶和熒光定量試劑SYBR■ Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白定量測(cè)試盒（A045-2）與β-呋喃果糖苷酶活性試劑盒（A082-2）購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1. 2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按照RNAiso Plus試劑操作說(shuō)明提取中腸總RNA，得到的總RNA用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行處理以去除基因組DNA。通過(guò)上述方法制備獲得的RNA用DEPC水進(jìn)行1∶50稀釋?zhuān)缓笥诤怂岬鞍追治鰞x上分別測(cè)出OD260和OD280，通過(guò)OD260/OD280計(jì)算RNA樣品濃度；并根據(jù)PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒使用說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。另外，取OD260/OD280在1.80～2.00的樣品用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1. 3 引物設(shè)計(jì)與合成

利用Primer Premier 5.0軟件，按照Real-time PCR要求設(shè)計(jì)引物。引物序列見(jiàn)表1。

1. 4 目的基因PCR擴(kuò)增

進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)前，需對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行普通PCR檢測(cè)。一是鑒定引物的特異性及是否有引物二聚體產(chǎn)生；二是初步檢測(cè)目標(biāo)基因在家蠶中腸的大概轉(zhuǎn)錄情況，為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)提供定性參考。利用表1中的引物，以反轉(zhuǎn)錄獲得的家蠶中腸cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，即在5 v/cm電壓下電泳25～30 min，然后在UVP凝膠成像系統(tǒng)上觀察并攝影。

1. 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)參照SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。StepOne熒光定量PCR擴(kuò)增儀記錄試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，最后根據(jù)2-△△Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 6 β-呋喃果糖苷酶活性測(cè)定

取家蠶中腸樣品加入4 ℃預(yù)冷的1.0 mL磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），在冰上勻漿，4 ℃下8000 r/min離心5～8 min，收集上清液。按照蛋白定量試劑盒說(shuō)明測(cè)定蛋白質(zhì)含量，再根據(jù)β-呋喃果糖苷酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明測(cè)定酶活性。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及制圖，利用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可以看出，從5齡家蠶中腸組織中能分別擴(kuò)增出單一的BmSuc1和BmSuc2基因條帶，且沒(méi)有明顯的引物二聚體條帶出現(xiàn)，說(shuō)明本研究設(shè)計(jì)的引物可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。另外，通過(guò)比較擴(kuò)增片段條帶的寬窄、深淺，發(fā)現(xiàn)BmSuc1基因的條帶較亮，而B(niǎo)mSuc2基因的條帶很弱，表明BmSuc1與BmSuc2基因的轉(zhuǎn)錄水平存在差異，但其差異需要通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)才能進(jìn)行準(zhǔn)確分析。

2. 2 5齡家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶基因的表達(dá)情況

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)5齡起蠶至熟蠶的中腸β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1和BmSuc2進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，BmSuc2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)波動(dòng)較小，從5齡起蠶到熟蠶的相對(duì)表達(dá)量都非常低；而B(niǎo)mSuc1基因在整個(gè)5齡期的相對(duì)表達(dá)量存在很大差異，其中5齡起蠶時(shí)的相對(duì)表達(dá)量較高，取食第1 d的BmSuc1基因相對(duì)表達(dá)量有一定程度的降低，從第2 d開(kāi)始逐漸升高，在第4 d的相對(duì)表達(dá)量最高，第5 d又開(kāi)始降低，到第7～8 d降至最低點(diǎn)。BmSuc1基因在整個(gè)5齡期呈先減弱后升高再降低的變化趨勢(shì)，出現(xiàn)一個(gè)峰值。說(shuō)明BmSuc1與BmSuc2基因在5齡家蠶中腸的轉(zhuǎn)錄表達(dá)規(guī)律不一致。

2. 3 5齡家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶的活性變化

5齡家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶的活性變化情況如圖3所示。由圖3可知，從5齡起蠶到熟蠶，β-呋喃果糖苷酶活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。5齡起蠶到取食第2 d，β-呋喃果糖苷酶活性變化不明顯，維持在80.00 U/mg左右，從第3 d開(kāi)始酶活性開(kāi)始逐漸升高，第5 d的酶活性最高（158.82 U/mg），隨后酶活性逐漸降低，到熟蠶期降至最低（39.25 U/mg）。

3 討論

家蠶基因組中存在兩個(gè)β-呋喃果糖苷酶基因（BmSuc1和BmSuc2），其中，BmSuc1基因在家蠶中腸組織中特異性表達(dá)，且具有完全酶學(xué)功能；BmSuc2基因在家蠶中腸表達(dá)量極低，序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，BmSuc2基因缺少酶活性位點(diǎn)，故推測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物不具有β-呋喃果糖苷酶活性（Daimon et al.，2008）。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到BmSuc1基因在5齡家蠶中腸組織均有一定的表達(dá)量，其中在5齡起蠶和盛食期的表達(dá)量相對(duì)較高；而B(niǎo)mSuc2基因在整個(gè)5齡期表達(dá)量都非常低，幾乎檢測(cè)不到。據(jù)此推測(cè)，BmSuc1作為一種蔗糖水解酶在家蠶中腸組織消化吸收蔗糖營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。

家蠶中腸主要是負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，桑葉中的大分子如糖類(lèi)、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)物質(zhì)首先在中腸消化液的作用下分解成小分子化合物，經(jīng)中腸上皮細(xì)胞吸收，再通過(guò)血液運(yùn)輸?shù)狡渌M織器官，從而為其生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng)提供能量（屠杰和王國(guó)基，2005；侯勇等，2007；張賽，2011）。蔗糖是許多昆蟲(chóng)喜好的主要糖類(lèi)營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，昆蟲(chóng)中腸組織的β-呋喃果糖苷酶可將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，為機(jī)體提供糖源（Krasikov et al.，2001；Barp et al.，2011）。桑葉中的生物堿D-ABI和DNJ等是α-葡萄糖苷酶的強(qiáng)效抑制劑，對(duì)非食桑昆蟲(chóng)卷心菜蛾和蓖麻蠶等具有極高的毒性作用（Konno et al.，2006；Hirayama et al.，2007），家蠶卻以桑葉作為唯一的食物來(lái)源。已有研究表明，家蠶是利用β-呋喃果糖苷酶將桑葉中的蔗糖水解為可利用的單糖，供蠶體吸收利用（Daimon et al.，2008；張蕾，2014）。本研究結(jié)果顯示，β-呋喃果糖苷酶活性在家蠶的整個(gè)5齡期呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，其活性變化規(guī)律與該階段蠶體吸收利用桑葉糖營(yíng)養(yǎng)的生理進(jìn)程基本一致，5齡家蠶一般在第4～5 d達(dá)到盛食期，β-呋喃果糖苷酶活性即在第4～5 d相對(duì)較高，BmSuc1基因表達(dá)量也在第4 d最高。盛食期家蠶對(duì)桑葉及糖營(yíng)養(yǎng)的需求量很大，蠶體攝入大量桑葉，即需要更多蔗糖水解酶消化吸收蔗糖營(yíng)養(yǎng)，此時(shí)蔗糖水解酶基因大量表達(dá)，其酶活性維持在一個(gè)相對(duì)較高的水平。

4 結(jié)論

BmSuc1基因表達(dá)水平及β-呋喃果糖苷酶活性變化規(guī)律與5齡家蠶吸收利用桑葉蔗糖營(yíng)養(yǎng)的生理進(jìn)程基本一致，提示BmSuc1基因作為一種蔗糖水解酶基因在家蠶中腸組織消化吸收桑葉蔗糖營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）