林春花 董瑛 劉文波 繆衛(wèi)國 鄭服叢

摘 要 橡膠樹炭疽病是橡膠樹上一種重要葉部病害，已知病原菌有膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌，它們是復(fù)合種群，群下種類多，遺傳多樣性豐富。利用ITS、GAPDH、CHS-1和ACT基因的部分序列，對來自海南省橡膠樹不同植膠地點(diǎn)的16株炭疽菌，進(jìn)行基因譜系比較分析。結(jié)果顯示，采用單基因部分序列和4基因拼接序列都能將供試菌株分為兩大類群：膠孢炭疽菌復(fù)合群和尖孢炭疽菌復(fù)合群。其中，來自于儋州HN06、樂東志仲HN02和保亭大本HN16的3個菌株聚類于尖孢炭疽菌復(fù)合群，其余13個菌株聚類于膠孢炭疽菌復(fù)合群。4基因拼接序列分析還可以看出，膠孢炭疽菌復(fù)合群下參試的9個菌株都屬于分支Musae Clade。但是采用單基因或4基因拼接序列均不能將海南橡膠炭疽菌鑒定到復(fù)合群下的具體種。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；炭疽病菌；多基因序列分析法；遺傳多態(tài)性

中圖分類號 S763.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum acutatum had been reported as the pathogens of the Rubber anthracnose， which is one of the main leaf diseases of rubber tree in China. But both of C. gloeosporioides and C. acutatum are Colletotrichum species complex with multiple species or subspecies and abundant genetic diversity. In the study， 16 strains of rubber anthracnose pathogen were isolated from different rubber tree patations in Hainan Province， and the molecular phylogenetic tree of them was analyzed comparatively based on partial sequences of single gene and concatenated sequences of the ITS， ACT， CHS-1 and GAPDH genes. The results showed that the phylogenetic tree of the isolates from rubber trees were divided into two class groups of C. gloeosporioides complex and C. acutatum complex， no matter the trees were built using single gene or combinations of 4 genes. Among them， three of the 16 isolates were species within the C. acutatum complex and others were species within the C. gloeosporioides complex. In the group of C. gloeosporioides complex， all of 9 isolates of rubber anthracnose pathogen analyzed belonged to cluster of“Musase Clade”. However， the isolates cannot be identified as detail species within C. gloeosporioides complex or C. acutatum complex on account of the low bootstrap support values.

Key words Rubber tree； Colletotrichum spp.； Multiple-gene phylogeny； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.015

炭疽菌（Colletotrichum spp.）真菌引起的炭疽病是世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)生最為普遍、危害較重的植物病害[1]。炭疽菌種類繁多，遺傳多態(tài)性豐富，其較為常見的致病種是膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌，都具有集合種群和復(fù)合種的特征，復(fù)合群下可分為多個種，并且種間菌株間變異大，有多個?；突蛏硇》N[2-3]。ITS序列作為真菌通用條形碼基因?qū)?fù)合菌研究有用，但因膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌復(fù)合種群中，種之間ITS序列基因堿基變化小，因此在解決膠孢炭疽菌復(fù)合種內(nèi)的遺傳關(guān)系上不可靠[1]。2012年英國與新西蘭科學(xué)家采用多基因序列分析法對前期鑒定為膠孢炭疽菌（約400株）和尖孢炭疽菌（331株）進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)2個種均可以分為多個亞群，并且重新鑒定獲得多個新種，這些新種具有膠孢炭疽菌或者尖孢炭疽菌的形態(tài)特征，但多基因序列間存在較大差異[2-3]。近年來，越來越多的科學(xué)家傾向于利用多個基因序列來開展炭疽菌的鑒定和遺傳多樣性分析。

橡膠炭疽病在中國普遍發(fā)生，已知病原菌有尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌[4-6]?，F(xiàn)已有的研究結(jié)果表明，2種炭疽菌在生物學(xué)特性、抗藥性和菌落形態(tài)上都存在較大差異[7-8]。關(guān)于橡膠樹2種炭疽菌的分子鑒定和遺傳多態(tài)性也有研究，分子鑒定主要采用核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）單基因序列分析[4，10]， 遺傳多態(tài)性分析也主要基于rDNA-ITS和隨機(jī)擴(kuò)增DNA多樣性（RAPD）等進(jìn)行。如鄭肖蘭等用RAPD法對來自海南橡膠、香蕉等17個炭疽菌進(jìn)行分析[9]。劉先寶等利用ISSR和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對來自海南、廣東、廣西和云南等墾區(qū)橡膠樹的21株尖孢炭疽菌進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析[10]。研究結(jié)果均顯示炭疽菌具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性，種內(nèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而利用多基因序列法分析中國橡膠炭疽菌種群關(guān)系尚未見報(bào)道。因此，筆者利用ITS（Internal transcribed spacer）、CHS-1（Chitin

synthase）、GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和ACT（Actin）基因的部分序列對16株分離自海南橡膠墾區(qū)的炭疽菌進(jìn)行基因譜系比較分析，比較4個單基因和拼接序列分析分別可獲悉的炭疽菌種群情況，該結(jié)果可了解引起海南橡膠炭疽病病原菌所屬類群，揭示復(fù)合種群下的遺傳多態(tài)性。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠炭疽病菌的采集、分離和致病力測定；于2014年12月在海南省橡膠墾區(qū)隨機(jī)采集炭疽病葉帶回實(shí)驗(yàn)室，從病葉的病健交界處剪取約5 mm×5 mm病組織；用70%乙醇消毒45～60 s，然后轉(zhuǎn)入0.1%升汞消毒1～2 min，再用無菌水沖洗3～4次，用滅菌濾紙吸干水分后放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離獲得的菌株經(jīng)單孢純化，室溫下培養(yǎng)并保存。將各菌株利用科赫氏法則進(jìn)行致病力鑒定，分離出具有致病力的炭疽菌有16株。具體詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 菌絲收集和基因組DNA提取 參照林春花等[4]的方法收集菌絲和提取DNA。

1.2.2 基因克隆 分別利用ITS、CHS-1、GAPDH和ACT基因的部分序列引物對16株橡膠樹炭疽菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列、退火溫度、延伸時間等詳見表2。每個PCR體系總體積為25 μL，包括0.1 μL Taq聚合酶（5 U/μL），2.5 μL PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTPs，引物（10 μmol/L）各1 μL，1 μL模板DNA， 以滅菌ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)分析片段大小，目的片段經(jīng)回收、克隆后送華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.3 橡膠炭疽菌菌類分析 選用2012年Damm 等[3]所述的尖孢炭疽菌復(fù)合群里29個種和2012年Weir等[2]報(bào)道的膠孢炭疽菌復(fù)合群里的24個種為參考菌株，依據(jù)參考文獻(xiàn)提供序列登錄號，并從GenBank中下載相應(yīng)的ITS、CHS-1、GAPDH和ACT基因序列。膠孢炭疽菌復(fù)合群參考菌種有：C. fructicola（strain_C1275.7）、C. nupharicola（strain_

C1275.25）、C. alienum（strain_C824）、C. musae（strain_

CBS_116870）、C. aenigma（strain_C1253.4）、C. siamense（syn.C. hymenocallidis）（strain_C1316.5）、C. aeschynomenes（strain 3-1-3）、C. tropicale（strain_

5101）、C. queenslandicum（strain_ICMP_1778）、C. salsolae（strain_C1314）、C. gloeosporioides（strain_

IMI_356878）、C. alatae（strain_C1275.5）、C. theobromicola（syn.C. gloeosporioides f. stylosanthis（strain_C1270.1）、C. xanthorrhoeae（strain_C1271）、C. horii（strain_C1180.1 ）、C. aotearoa（strain_C1282.4）、C. ti（strain_ICMP4832）、C. kahawae subsp.kahawae（strain_C1266.1）、Glomerella cingulata“f.sp.camelliae”（strain_ICMP10643）、C. clidemiae（strain_C1317.1）、C. psidii（strain_CBS145.29）、C. cordylinicola（strain_

C1315.1）、C. theobromicola（strain_C1316.13）、C. asianum（IC MP_18580）；尖孢炭疽菌復(fù)合群參考菌種有：C.lupini（CBS_109225）、C. tamarilloi（CBS_

129814）、C.costaricense（CBS：330.75）、C. cuscutae （IMI：304802）、C. limetticola（CBS：114.14）、C. nymphaeae（CBS：515.78）、C. scovillei（CBS：126529）、C. guajavae （IMI：350839）、C. cosmic（CBS：853.73）、C. simmondsii （CBS：122122）、C. laticiphilum（CBS：112989）、C. fioriniae （CBS：128517）、C. acutatum（CBS：112996）、C. godetiae（CBS：133.44）、C. pyricola（CBS_128531）、C. rhombiforme（CBS：129953）、C. salicis（CBS_607.94）、C. kinghornii（CBS：198.35）、C. acerbum（CBS：128530）、C. austral （CBS_116478）、C. brisbanense（CBS_292.67）、C. chrysanthemi（IMI_364540）、C. indonesiense（CBS_

127551）、C. johnstonii（IMI_357027）、C. melonis（CBS_

159.84）、C. paxtonii（IMI_165753）、C. phormii（CBS_

118194）、C. sloanei（IMI_364297）、C. walleri（CBS_

125472）。并采用C. orchidophilum（CBS：632.80）和C. pseudoacutatum（CBS_436.77）的相應(yīng)序列作為參考外群[2-3]。

將測序所得的基因部分序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得序列號（見表1）。用MEGA 6.0軟件經(jīng)“W”功能比對并校正后，采用bootstrap test（1 000重復(fù)）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，遺傳距離用Neighbor-Joining法進(jìn)行計(jì)算。對各菌株分別進(jìn)行ITS、ACT、CHS-1、和GAPDH單基因聚類分析。同時，將各菌株的基因按照ITS-ACT-CHS-1-GAPDH順序進(jìn)行序列拼接后，用上述方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析單基因與多基因序列拼接聚類結(jié)果的異同及橡膠樹炭疽菌種群差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及致病力測定

從海南瓊中、樂東、白沙、儋州、瓊中、屯昌、澄邁、文昌、瓊海、萬寧、保亭橡膠林中（含苗圃）采集橡膠樹炭疽病病樣，經(jīng)分離純化獲得形態(tài)特征疑似炭疽菌的菌株16株，回接試驗(yàn)表明，這16株真菌都能引起類似癥狀，說明參試菌株為橡膠樹炭疽菌致病菌。這16株炭疽菌的地理分布和致病能力見表1。來自瓊中加釵農(nóng)場的菌株HN01和來自保亭新星農(nóng)場的HN14菌株在致病力回接時表現(xiàn)為弱致病力，在葉片上形成的菌落較??；來自澄邁紅光農(nóng)場的HN12和萬寧山根HN10菌株表現(xiàn)出強(qiáng)致病力；其余菌株表現(xiàn)中等致病力。

2.2 ITS、ACT、GAPDH和CHS-1單基因部分序列聚類分析

16株橡膠炭疽病菌用ITS基因部分序列引物ITS1/ITS4、ACT基因部分序列引物ACT-512F/ACT-783R、CHS-1部分序列引物CHS-79F/CHS-354R、GAPDH部分序列引物GDF/GDR分別擴(kuò)增出1條大小為574～583 bp、272～282 bp、297～298 bp和272～280 bp的條帶。序列克隆測序后，與參考基因進(jìn)行比對，截取同樣位點(diǎn)的序列提交給NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得序列號（表1）。

根據(jù)ITS、ACT、CHS-1和GAPDH部分序列分別做聚類分析，結(jié)果見圖1～4。除了用GAPDH和ACT部分序列不能很好的將外群菌株（CBS：632.80）區(qū)分在外，4個基因都能將參考菌株和參試菌株聚成2大分支：膠孢炭疽菌復(fù)合群（分支Ⅰ）和尖孢炭疽菌復(fù)合群（分支Ⅱ）。并且4個基因聚類結(jié)果都能將來自于儋州HN06、樂東志仲HN02和保亭大本HN16的3個菌株聚類于尖孢炭疽菌復(fù)合群，其余13個菌株聚類于膠孢炭疽菌復(fù)合群。該結(jié)果說明了采用4個單基因部分序列聚類分析方法都能用來區(qū)分橡膠炭疽菌是否歸屬于膠孢炭疽菌復(fù)合類群或尖孢炭疽菌復(fù)合類群。

但4個基因聚類圖各分支情況也有不同，并不能將各復(fù)合類群中的種區(qū)分開來，且各分支間的支持率也不高。尤其是在ACT（圖2）和GAPDH（圖3）聚類圖中，甚至不能將外群菌株（CBS：632.80）很好的區(qū)分在外?；贗TS部分序列聚類圖中（圖1），膠孢炭疽菌復(fù)合群中可以將HN01、HN04、HN05、HN11和HN13與膠孢炭疽菌C. gloeosporioides菌株IMI_356878聚為一類（支持率為34%）， 但HN03、HN09、HN14、HN15與C.fructicola（菌株C1275.7）和C. aeschynomenes（strain 3-1-3）聚為一類，其余菌株也是與多個參考菌株聚于一類。在尖孢炭疽菌復(fù)合群中，3株橡膠炭疽菌不能與尖孢炭疽菌的多菌種區(qū)分開來。

基于ACT部分序列聚類圖中（圖2），來自海南的16株炭疽菌無論是在膠孢炭疽菌復(fù)合群中，還是在尖孢炭疽菌復(fù)合群中，都不能與某些種較好的聚在一起，他們分散在各個種間。

基于GAPDH部分序列聚類圖中（圖3），膠孢炭疽菌復(fù)合群中HN01、HN04、HN05、HN07、HN08、HN13與參考菌株strain_3-1-3（C. aeschynomenes）和strain_C1316.5遺傳距離較近（支持率為39%），其他菌株與多個種聚在一起。在尖孢炭疽菌復(fù)合群中，3個菌株序列很相近，92%的支持度單獨(dú)聚為一類，與其他種間聚類的支持度都較低。

基于CHS-1部分序列聚類圖中（圖4），在膠孢炭疽菌復(fù)合群中，HN12、HN08、HN05與ICMP_18580聚為一類，支持率有67%；HN03、HN09、HN14、HN15這4個菌株與Strain_C1275.7聚在一起，其余菌株與多個種區(qū)分不開。在尖孢炭疽菌復(fù)合群中的3個橡膠菌株與CBS：515.78遺傳距離最近，支持度為33%。

因此，利用ITS、ACT、GAPDH和CHS-1單個基因序列都可以將橡膠樹炭疽菌歸屬于膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌復(fù)合類群中，但不能將各復(fù)合類群中的種區(qū)分開來。

2.3 ITS-ACT-CHS-1-GAPDH四基因聚類分析

根據(jù)ITS-ACT-CHS-1-GAPDHS這4個基因序列拼接后聚類，結(jié)果見圖5，與各單基因類似，除了外群參考菌株C. pseudoacutatum（CBS436.77）和 C. orchidophilum（CBS632.80）外，參考菌株和參試菌株分聚為2大分支，且HN02、HN06和HN12菌株隸屬于尖孢炭疽菌復(fù)合群，其他菌株屬于膠孢炭疽菌復(fù)合群。

在尖孢炭疽菌復(fù)合群中，根據(jù)這4個基因部分序列拼接聚類結(jié)果，在所有參試的尖孢炭疽菌種中，雖然各分支的支持度不高，但是各個種分布情況與Damm等[3]文章中利用6個基因（ITS，ACT，TUB2，CHS-1，GAPDH，HIS3）部分序列比對結(jié)果基本相似。因此，采用這4個基因部分序列基本能反應(yīng)尖孢炭疽菌復(fù)合群下各種的遺傳情況。根據(jù)聚類圖可以看出，HN02、HN06和HN12的3個菌株與C. scovillei（CBS：126529），C. guajavae（IMI：350839）和C. chrysanthemi（IMI_364540）聚在1個小分支上，遺傳距離最近，而與C. acutatum（CBS_112996）距離較遠(yuǎn)。

在膠孢炭疽菌復(fù)合群中，雖然各分支的支持度不高，但群下各種的遺傳聚類圖與Weir等[2]文章中利用8個基因（ACT、TUB2、CAL、CHS-1、GAPDH、GS、ITS和SOD2）部分序列比對結(jié)果相似，都將膠孢炭疽菌復(fù)合群下的種分為2大分支：Musae Clade和Kahawae clade。因此，采用這4個基因部分序列基本能反應(yīng)膠孢炭疽菌復(fù)合群下各種的遺傳情況。從聚類圖中可以看出，來自橡膠樹9株炭疽菌與C. fructicola（strain_1275.7）、C. nupharicola（strain_

1275.25）、C. alienum（strain_C824）、C. aenigma（strain_

1253.4）、C. siamense（strain_1316.5）、C. tropicale（strain_

5101）、C. aeschynomenes（strain_3-1-3）和C. asianum（ICMP_18580）聚為一起，這些種都屬于Musae Clade。因此可以說明來自橡膠樹的9個炭疽菌都屬于Musae Clade分支。并且，從圖5可以看出，HN03、HN14和HN15與菌株C. fructicola（ICMP_1275.7）遺傳距離最近，支持度有61%，HN05、HN04和HN13與C. aeschynomenes（strain_3-1-3）聚在1個小分支中，推測海南橡膠樹膠孢炭疽菌中可能有C. fructicola和C. aeschynomenes種。

3 討論與結(jié)論

炭疽菌屬下許多種的形態(tài)差異微小，例如分生孢子、附著胞形態(tài)相似，且形態(tài)特征易受環(huán)境因子的影響等，這些不穩(wěn)定性都給炭疽菌單純依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行分類鑒定造成了很大困難。隨著分子生物學(xué)手段的運(yùn)用，尤其是ITS序列被作為真菌通用條形碼基因以來[12]，許多炭疽病菌的病原菌都采用ITS序列鑒定。但由于ITS在該屬系統(tǒng)性研究中的局限性，如對多數(shù)近緣種，構(gòu)建的系統(tǒng)樹在一些關(guān)鍵進(jìn)化節(jié)點(diǎn)的支持率低，不能有效進(jìn)行識別[13]。有學(xué)者認(rèn)為利用ITS序列不能有效的用于種的識別，可能會導(dǎo)致錯誤的結(jié)論[14]。Taylor等[15]主張采用多基因序列分析法研究物種進(jìn)化，且提出了phylogenetic species的概念。多基因序列綜合分析技術(shù)的使用，使人們對炭疽菌屬真菌的認(rèn)識更為深刻、更為準(zhǔn)確。2012年新西蘭和英國科學(xué)家采用多基因序列對前期認(rèn)為是膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的菌株進(jìn)行全面分析，成功的將近500株菌株重新準(zhǔn)確鑒定，將原來認(rèn)為是膠孢炭疽菌的156個菌株鑒定為22種和1個亞種，尖孢炭疽菌的331個菌株鑒定為31個種，并且發(fā)現(xiàn)了一些新種[2-3]。研究結(jié)果顯示，膠孢炭疽菌和尖孢炭疽具有復(fù)合種群的特征，種內(nèi)遺傳分化多樣，形態(tài)特征相似或相同的膠孢炭疽菌或尖孢炭疽菌復(fù)合群菌株間基因序列堿基存在較大差異，采用多基因序列分析法可以將膠孢炭疽菌復(fù)合群和尖孢炭疽菌復(fù)合群中的菌株鑒定到種。因此在炭疽菌種群分類上，根據(jù)不同需求可采用不同基因數(shù)量進(jìn)行分析。

前期通過形態(tài)學(xué)方法鑒定或基于ITS序列的分子鑒定結(jié)果表明[4-5，10]，中國橡膠樹病原菌有膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌2種，并且以膠孢炭疽菌為主[4]。隨著膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌是復(fù)合群的提出，橡膠樹炭疽病病原菌具體是屬于復(fù)合群下哪個種，采用單基因序列和少數(shù)幾個基因拼接序列分析可獲得哪些種群關(guān)系等成為疑問。本研究對來源于海南橡膠墾區(qū)的16個炭疽菌株，比較分析ITS、GAPDH、ACT、CHS-1單基因部分序列或拼接序列的聚類結(jié)果。結(jié)果顯示：無論是利用ITS、GAPDH、ACT和CHS-1基因單基因序列還是拼接序列都能區(qū)分膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌復(fù)合群；采用4個基因拼接序列還可看出，海南膠孢炭疽菌復(fù)合群下橡膠樹炭疽菌都屬于Musae Clade分支。該結(jié)果說明采用本文中的4個基因單基因序列均能很好的將橡膠炭疽菌鑒定到復(fù)合群水平，采用ITS、GAPDH、ACT和CHS-1基因拼接序列還可進(jìn)一步將膠孢炭疽菌鑒定到Musae Clade類群。

Damm等[3]采用了6個基因分析尖孢炭疽菌復(fù)合群，Weir等[2]采用8個基因分析膠孢炭疽菌復(fù)合群。本文無論是單個基因序列或4個基因拼接序列聚類，都無法將菌株與具體單個菌株進(jìn)行很好的聚類。雖然分析的基因數(shù)量少于參考菌株的來源文章，各分支支持度不高，但本文所示聚類樹狀圖總體分布情況與參考文章所列相似，說明本研究結(jié)果具有可靠性。研究并未將參試的橡膠菌株歸類于復(fù)合群下具體的種類，可能是由于測定基因數(shù)量不足。如要更好的鑒定橡膠炭疽菌所屬種群，需要進(jìn)一步測定更多的保守基因進(jìn)行分析。

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