朱晉恒　戚繼艷　肖小虎　唐朝榮

摘 要 割膠顯著刺激新開割橡膠樹膠乳產量，前期的比較蛋白質組學的研究中，已通過雙向電泳的方法分離到一個隨割膠下調的葡萄糖/核糖醇脫氫酶（GRDH，glucose/ribitol dehydrogenase）。通過搜索本實驗室的橡膠樹EST數據庫和PCR擴增得到該蛋白點對應的全長cDNA序列并命名為HbGRDH1。序列分析顯示，cDNA的編碼序列（CDS）為882 bp，推測編碼294個aa，分子量大小為32.2 ku，等電點為5.18，基因組序列包含4個外顯子和3個內含子。通過Realtime PCR和Solexa高通量轉錄組測序分析發(fā)現，HbGRDH1主要在膠乳和雌花中表達，在葉片發(fā)育穩(wěn)定期呈現明顯的下調表達趨勢；在新開割樹膠乳中，前4刀該基因表達變化不明顯，而第5刀開始呈現上調表達趨勢；在膠乳中，乙烯利處理對該基因表達前12 h無明顯影響，在24 h時呈明顯的下調表達。本研究結果有助于進一步闡明橡膠樹中HbGRDH1基因的功能，特別是其參與橡膠樹膠乳再生調控的分子機理。

關鍵詞 巴西橡膠樹；葡萄糖和核糖醇脫氫酶；表達分析；割膠；乙烯利；葉片發(fā)育

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract Tapping has a significant impact on latex production of rubber trees. In a previous study，two-dimensional proteomics analysis allowed us to isolate a tapping-depressed protein spot in the c-serum of latex，which was identified by tandem mass-spectrometry as a glucose/ribitol dehydrogenase（GRDH）. By searching the H. brasiliensis EST database in our laboratory and PCR amplification，we obtained the full-length cDNA sequence corresponding to the GRDH protein spot，and named as HbGRDH1. Sequence analysis revealed that the length of coding domain sequence（CDS）was 882 bp that encoded a protein of 294 amino acids with a molecular weight of 32.2 ku and an isoelectric point of 5.18. The genomic sequence of HbGRDH1 contains four exons and three introns. By fluorescence quantitative RT-PCR and Solexa-sequencing transcriptomes of H. brasiliensis，expressional analyses were conducted. HbGRDH1 was mainly expressed in latex and female flowers，and showed an expression decrease in the fourth process of leaf development. The expression of HbGRDH1 in latex was up-regulated by tapping of virgin rubber trees although not significant for the first four tappings. Ethephon treatment affected little on HbGRDH1 expression in the first 12 hours but decreased obviously later. The results of this study will be beneficial to further studies on the functions of HbGRDH1 in the regulation of latex regeneration.

Key words Hevea brasiliensis； Glucose/ribitol dehydrogenase； Expression； Tapping； Ethephon； Leaf development

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.011

天然橡膠（Hevea brasiliensis）是一種重要的工業(yè)原料，而巴西橡膠樹是天然橡膠的主要商業(yè)來源[1]。長期以來中國天然橡膠的生產遠遠不能滿足消費的需求，隨著對天然橡膠需求的日益增長，如何進一步提高天然橡膠產量已成為中國天然橡膠行業(yè)亟待解決的重大課題。

雙向電泳技術已被廣泛運用于植物蛋白質組學研究[2-3]。本實驗室利用雙向蛋白質凝膠電泳系統(tǒng)，對未開割橡膠樹開割前5刀膠乳c-乳清蛋白質組進行比較分析時，分離得到一個在割膠過程中表達水平發(fā)生明顯變化的蛋白點。通過二級質譜分析，得到該蛋白的部分氨基酸序列，并注釋為葡萄糖/核糖醇脫氫酶（GRDH，glucose/ribitol dehydrogenase）。通過搜索本實驗室的膠乳EST數據庫，獲得了目標基因的拼接序列，并對該基因進行了全長cDNA克隆并命名為HbGRDH1。目前，很少有文獻報道GRDH基因，僅王啟磊等[4]報道了玉米的葡萄糖和核糖醇脫氫酶基因ZmGRDH的克隆和表達分析，功能預測顯示其編碼的蛋白具有一個標準的激活位點及一個甘氨酸富集區(qū)NAD結合位點，該蛋白家族主要參與氧化還原反應，碳水化合物代謝等過程。割膠是天然橡膠生產的主要方式，對橡膠樹而言也是一種機械傷害，隨著割膠大量細胞質流出體外，需要消耗大量的原料來進行膠乳的再生[5]。在未開割橡膠樹開割過程中，割膠可以在一定程度上提高膠乳產量，有報道割膠能促進內源乙烯的釋放[6-7]。乙烯利作為人工合成的能夠釋放乙烯的植物生長調節(jié)劑已被廣泛應用于橡膠樹割膠生產，可顯著提高膠乳產量[8]。乙烯利刺激能夠誘導乳管中的一些生化反應，例如蔗糖裝載、水分吸收和一些保護性蛋白的合成，這涉及到很多乙烯應答基因。無論是割膠產生的內源乙烯還是乙烯利處理后釋放的外源乙烯，都能誘導乳管產生相應的生化反應[9]。為初步確定HbGRDH1基因的功能，本研究利用Solexa測序和Realtime PCR分析了割膠和乙烯利刺激對其表達的影響及其在不同組織和葉片不同發(fā)育時期中的表達模式，首次克隆了橡膠樹葡萄糖/核糖醇脫氫酶基因，研究了該基因的表達模式，以期進一步揭示該類基因在橡膠樹膠乳再生調控中的生理功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 不同組織中的膠乳、樹皮、樹葉、種子、雌花和雄花材料來自中國熱帶農業(yè)科學院試驗場三隊種植10 a、割膠3 a的熱研7-33-97橡膠樹；由于橡膠樹一般通過芽接的方式進行繁殖，為保證不同組織材料的遺傳一致性，根取自于熱研7-33-97橡膠樹組培苗。不同發(fā)育時期的葉片采自中國熱帶農業(yè)科學院橡膠所種質資源圃，為1年生的熱研7-33-97芽接苗。乙烯利處理選用上述不同組織采集所用的橡膠樹，割膠處理采用中國熱帶農業(yè)科學院試驗場二隊種植8 a、達開割標準的熱研7-33-97橡膠樹。

1.1.2 菌株與試劑 Escherichia coli JM109菌株由本實驗室保存。植物總RNA提取試劑盒購自Biotech公司；逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司；克隆載體pMDR18-T vector和Realtime PCR熒光染料試劑SYBRⅡ premix購自TaKaRa公司；HiFi DNA polymerase購自TransGen公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Omega公司；引物合成和測序由華大基因生物技術有限公司完成；其他生化試劑和常規(guī)試劑均為進口或國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 乙烯利處理未開割樹3、12、24 h，以0 h為對照。乙烯利處理和割膠具體方法參照文獻[7]進行。

1.2.2 核酸的提取與cDNA合成 橡膠樹膠乳總RNA的提取參照Tang等[10]方法進行，其他不同組織RNA的提取方法參照Kiefer[11]；cDNA第一條鏈合成采用Fermentas公司逆轉錄試劑盒，操作步驟按照說明書進行。

1.2.3 巴西橡膠樹GRDH基因的克隆 利用蛋白點二級質譜分析所得到肽段對本實驗室EST數據庫進行搜索，得到一個與目標肽段完全吻合的EST拼接序列并設計全長引物，對含完整讀碼框（Open Reading Frame， ORF）的cDNA進行PCR擴增。反應體系如下：稀釋10×的cDNA第一鏈模板1 μL、10×PCR Buffer 5 μL、HiFi DNA Polymerase （5 U/L）1 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 37 μL，共50 μL體系。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增程序結束后，配制1.0%瓊脂糖凝膠跑電泳檢測并切取目的片段，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段后連接pMD18-T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞并挑取陽性克隆送往公司測序。

1.2.4 生物信息學分析 利用生物軟件Genetyx（version 5.0.4）和DNAMAN對全長cDNA序列進行比對分析以及閱讀框ORF的預測。利用MEGA 4.0軟件對來自巴西橡膠樹（HbGRDH1），楊樹（gi|224123214），水稻（gi|108885236），擬南芥（gi|75309952），苜蓿（gi|357441633），大豆（gi|356505868），蓖麻（gi|255552291），葡萄（gi|147801315），玉米（gi|414590803）在內的10種植物GRDH氨基酸序列進行聚類分析，用Neighbor-Joining分析方法進行分子系統(tǒng)學分析，并進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學檢驗。

1.2.5 基于Solexa測序的表達分析 利用本實驗室現有Solexa轉錄組數據，對HbGRDH1在不同組織、葉片不同發(fā)育時期和乙烯利刺激膠乳中的表達模式進行分析：以所克隆HbGRDH1的編碼序列（Coding sequence，CDS）作為參考序列，利用程序BWA[12]將各樣品fastq格式的EST數據mapping到參考序列上，得到sam文件，然后從服務器將sam文件下載到個人電腦，利用軟件Tablet [http：//bioinf.scri.ac.uk/tablet/]對sam文件的結果進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 實時Realtime PCR分析 利用實時Realtime PCR技術對HbGRDH1基因在割膠處理下的表達模式進行分析并對Solexa測序的結果進行了驗證：提取不同刀次膠乳、不同組織、不同發(fā)育時期葉片和乙烯利處理不同時間膠乳的RNA進行逆轉錄合成cDNA，以YLS8作為內參進行Realtime PCR分析，HbGRDH1和內參的引物序列分別是：

全長cDNA擴增引物：HbGRDH1 F：5′-TAG

AATTCAGAATTTGAGTCTC-3′；HbGRDH1 R：5′-AATTATTATGCTATAAGAGGAC-3′。

實時Realtime PCR引物：HbGRDH1 F：5′-GTGAATAATGCCGCCGAACA-3′；HbGRDH1 R：5′-GTCCAGCAACCCTGAATAGCC-3′；YLS8 F：5′-CCTCGTCGTCATCCGATTC-3′；YLS8 R：5′-CAG

GCACCTCAGTGATGTC-3′。

標準曲線的制作以及對該基因在樣品的表達分析主要參照Li等[13]方法進行。具體反應體系為：cDNA模板1 μL、上下游引物混合物0.6 μL、2×SYBRII Premix 10 μL、ddH2O 7.8 μL，總體系20 μL；反應程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性5 s，68 ℃退火及延伸10 s，共40個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 HbGRDH1基因的克隆與序列分析

通過對未開割樹膠乳c乳清蛋白質組進行比較分析，分離得到一個隨著割膠刀次蛋白表達水平明顯變化的蛋白點（圖1）。再通過二級質譜分析得到對應蛋白點的肽段氨基酸序列，然后利用該肽段序列對本實驗室橡膠樹EST數據庫進行檢索，得到與之匹配的EST序列，通過對所得到的EST進行拼接，得到一個注釋為GRDH的拼接序列（contig）。通過基因克隆得到了包含完整ORF的該基因全長cDNA序列，命名為HbGRDH1，并提交GenBank獲得序列登錄號KU323797。序列分析顯示，該基因的編碼序列（CDS）為882 bp，推測編碼294個氨基酸（圖2），分子量大小為32.2 ku，等電點為5.18。用HbGRDH1的cDNA序列blast NCBI橡膠樹基因組數據庫，搜索并下載到HbGRDH1的基因組序列（gi|447939060|）。利用在線軟件GSDS2.0分析HbGRDH1基因組序列結構，結果顯示該基因包含4個外顯子和3個內含子（圖3）。

2.2 HbGRDH1蛋白的系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 4.0軟件對HbGRDH1與其他9種植物的GRDH蛋白進行多序列比對，并構建系統(tǒng)進化樹（圖4）。所選10種植物的GRDH蛋白可以明顯分為2個大的類群，其中橡膠樹、蓖麻和大豆的GRDH聚在一起，其它植物的聚在一起，另外橡膠樹和蓖麻的GRDH蛋白共同聚在一個小的分支上，這和2種植物同為大戟科的分類一致。

2.3 HbGRDH1在割膠處理下的表達模式分析

在未開割樹開割前5刀中HbGRDH1蛋白的表達水平有明顯的下降趨勢（圖5），為了探明HbGRDH1在mRNA水平的表達是否也具有同樣的趨勢，本研究進一步利用Realtime PCR技術分析了割膠對HbGRDH1基因表達的影響。結果表明，在未開割樹開割的前8刀中HbGRDH1的表達呈現上升趨勢，表明HbGRDH1在mRNA和蛋白的表達模式不同，推測HbGRDH1基因的表達存在轉錄后調控模式。

2.4 HbGRDH1的組織特異性表達模式分析

利用Solexa轉錄組數據對HbGRDH1基因在不同組織中的表達特性進行了分析，并用Realtime PCR技術進行了驗證，兩者結果一致（p<0.01）。分析結果顯示（圖6），HbGRDH1在所檢測的7種組織中均有表達，其中在膠乳中的表達豐度最高，雌花次之，而在樹皮和根中基本不表達。

2.5 HbGRDH1在乙烯利處理下的表達模式分析

割膠可以促進膠乳的再生提高膠乳的產量，乙烯利處理同樣可以明顯提高橡膠樹膠乳的產量，為此進一步利用Solexa轉錄組數據分析了乙烯利刺激對HbGRDH1表達的影響，并用Realtime PCR技術進行了驗證，兩者結果一致（p<0.05）。結果顯示，乙烯利處理對HbGRDH1基因的表達影響較?。▓D7），僅在處理24 h時HbGRDH1表達量有明顯的下降趨勢。

2.6 HbGRDH1在葉片發(fā)育過程中的表達模式分析

橡膠樹葉片是橡膠生物合成原料蔗糖合成的場所，為了研究HbGRDH1基因表達是否參與橡膠樹葉片發(fā)育，本研究利用Solexa轉錄組數據對HbGRDH1在葉片4個發(fā)育階段（古銅、變色、淡綠和穩(wěn)定）中的表達模式進行了分析（圖7），并用Realtime PCR技術進行了驗證，兩者結果一致（p<0.05）。結果表明，在葉片發(fā)育的穩(wěn)定期，HbGRDH1呈明顯下調表達。

3 討論

GRDH是一種以NAD+或NADP+為受體作用于供體CH-OH基團的氧化還原酶，主要參與葡萄糖和核糖醇的代謝[14]。本研究通過對未開割橡膠樹開割前5刀膠乳c-乳清的蛋白質組進行比較分析，發(fā)現一個隨著割膠表達水平明顯降低、二級質譜鑒定為GRDH的蛋白點。通過本地EST數據庫搜索以及PCR擴增得到該蛋白點對應的全長cDNA，命名為HbGRDH1。通過對來自不同植物的GRDH蛋白序列進行多序列比對及進化分析發(fā)現，所選10種植物的GRDH氨基酸序列主要聚為兩類，其中橡膠樹、蓖麻和大豆聚在一起，且橡膠樹和蓖麻的距離最近，這和2種植物同屬大戟科植物是一致的。Realtime PCR技術分析顯示，在未開割樹中HbGRDH1基因的表達隨割次增加呈現上調表達的模式，與蛋白質組分析的結果不一致。造成這種結果的原因可能有2個，其一可能是該基因的表達存在明顯的轉錄后調控機制，其二是所克隆的基因不是蛋白質組研究中那個GRDH蛋白點所對應的基因，而是具較高同源性的另一個家族成員。雖然HbGRDH1基因在所檢測的7種橡膠組織中都有表達，但表達豐度存在顯著差異，在膠乳中表達量最高，雌花次之，樹皮和根中基本不表達。在橡膠樹葉片發(fā)育過程中，隨葉片發(fā)育進程HbGRDH1呈下調表達。在里氏木霉菌[15]中克隆grd1（glucose-ribitol dehydrogenase 1），并發(fā)現該基因產物是纖維素酶基因表達的增強子，能夠調控纖維素酶的表達，而纖維素是細胞壁構成和再生的重要組分。橡膠樹葉片發(fā)育從古銅期到淡綠期，葉片表面積在不斷增大，細胞體積增大，細胞壁的一直處于延伸狀態(tài)，雖然HbGRDH1的表達量在變色期有所下降，但仍然維持較高的表達豐度，而在淡綠期以后，葉片表面積基本停止增長，細胞壁停止延伸，可能不再需要過多的GRDH蛋白調控細胞壁的延伸，所以在穩(wěn)定期HbGRDH1表達量有顯著的下降，推測在橡膠葉片發(fā)育過程中HbGRDH1可能參與葉片發(fā)育調控。乙烯利雖然能夠增加膠乳產量，但是絕大多數與橡膠生物合成相關基因的表達卻被其抑制或者無明顯變化[16-18]，可能與其能延長損傷乳管的閉合時間而增加膠乳排出量，進而促進橡膠的合成代謝有關[19-20]。王旭初等[21]的最新研究指出乙烯利刺激調控膠乳產量不僅表現在基因水平也表現在蛋白水平上，其中轉錄后修飾在控制橡膠生物合成相關酶的功能上可能發(fā)揮重要作用。在乙烯利刺激下HbGRDH1的表達在12 h內沒有明顯變化，在24 h時卻有明顯的下調，在膠乳中的表達受到了抑制，但考慮到該基因的表達調控可能存在明顯的轉錄后調控機制，以及該類基因參與纖維素合成調控的事實，因而目前尚不能完全排除該基因參與乙烯利刺激的膠乳再生調控。

參考文獻

[1] D′auzac J， Jacob J， Prévot J， et al. The regulation of cis-polyisoprene production（natural rubber）from Hevea brasiliensis[J]. Recent Research Developments in Plant Physiology， 1997， 1： 273-332.

[2] Wade L J， Ghareyazie B， Bennett J. Proteomic analysis of rice leaves during drought stress and recovery[J]. Proteomics， 2002， 2： 1 131-1 145.

[3] Hajheidari M， Eivazi A， Buchanan B B， et al. Proteomics uncovers a role for redox in drought tolerance in wheat[J]. Journal of proteome research， 2007， 6（4）： 1 451-1 460.

[4] 王啟磊， 董永彬， 薛曉靜. 玉米葡萄糖和核糖醇基因ZmGRDH的克隆及表達分析[C]. 2012年全國玉米遺傳育種學術研討會暨新品種展示觀摩會論文及摘要集， 2012.

[5] Pirrello J， Leclercq J， Dessailly F， et al. Transcriptional and post-transcriptional regulation of the jasmonate signalling pathway in response to abiotic and harvesting stress in Hevea brasiliensis[J]. BMC Plant Biology， 2014， 14（1）： 341.

[6] Pakianathan S， Tata S， Chon L F， et al. Certain aspects of physiology and biochemistry of latex production[J]. Developments in Crop Science， 1992， 23： 298-323.

[7] Tang C R， Huang D B， Yang J H， et al. The sucrose transporter HbSUT3 plays an active role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity in exploited trees of Hevea brasiliensis （para rubber tree）[J]. Plant Cell And Environment， 2010， 33（10）： 1 708-1 720.

[8] Jetro N N， Simon G M. Effects of 2-chloroethylphosphonic acid formulations as yield stimulants on Hevea brasiliensis[J]. African Journal of Biotechnology， 2007， 6（5）： 523-528.

[9] Putranto R A， Duan C， Kuswanhadi T C， et al. Ethylene response factors are controlled by multiple harvesting stresses in Hevea brasiliensis[J]. PloS one， 2015， 10（4）： e0123 618.

[10] Tang C R， Qi J Y， Li H P， et al. A convenient and efficient protocol for isolating high-quality RNA from latex of Hevea brasiliensis（para rubber tree）[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods， 2007， 70（5）： 749-754.

[11] Kiefer E， Heller W， Ernst D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2000， 18（1）： 33-39.

[12] Li H， Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform[J]. Bioinformatics， 2009， 25（14）： 1 754-1 760.

[13] Li H， Qin Y， Xiao X， et al. Screening of valid reference genes for real-time RT-PCR data normalization in Hevea brasiliensis and expression validation of a sucrose transporter gene HbSUT3[J]. Plant Sci， 2011， 181（2）： 132-139.

[14] Jany K D， Ulmer W， Froschle M， et al. Complete amino acid sequence of glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium[J]. FEBS Letters， 1984， 165（1）： 6-10.

[15] Schuster A， Kubicek C P， Schmoll M. Dehydrogenase GRD1 represents a novel component of the cellulase regulon in Trichoderma reesei（Hypocrea jecorina）[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2011， 77（13）： 4 553-4 563.

[16] Yeang H， Arif S a M， Yusof F， et al. Allergenic proteins of natural rubber latex[J]. Methods， 2002， 27（1）： 32-45.

[17] Zhu J， Zhang Z. Ethylene stimulation of latex production in Hevea brasiliensis[J]. Plant Signaling & Behavior， 2009， 4（11）： 1 072-1 074.

[18] Adiwilaga K， Kush A. Cloning and characterization of cDNA encoding farnesyl diphosphate synthase from rubber tree（Hevea brasiliensis）[J]. Plant Molecular Biology， 1996， 30（5）： 935-946.

[19] Yip E， Chin H. Latex flow studies. X. Distribution of metallic ions between phases of Hevea latex and the effects of yield stimulation on this distribution[J]. Journal of the Rubber Research Institute of Malaysia， 1977， 25（1）： 31-49.

[20] Tungngoen K， Kongsawadworakul P， Viboonjun U， et al. Involvement of HbPIP2； 1 and HbTIP1； 1 aquaporins in ethylene stimulation of latex yield through regulation of water exchanges between inner liber and latex cells in Hevea brasiliensis[J]. Plant Physiology， 2009， 151（2）： 843-856.

[21] Wang X， Wang D， Sun Y， et al. Comprehensive proteomics analysis of laticifer latex reveals new insights into ethylene stimulation of natural rubber production[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 13 778.