趙秋芳 董晨 決登偉 陳宏良

摘 要 泛素結(jié)合酶（E2s）促進(jìn)底物泛素化或者與E3s鏈接，是靶蛋白泛素化的關(guān)鍵酶，在泛素-蛋白酶體途徑中起重要作用。利用可可（Theobroma cacao L.）全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，共鑒定出45個(gè)E2s基因家族成員，包括39個(gè)UBC和6個(gè)UEV基因。通過生物信息學(xué)方法，對(duì)可可E2s家族的基本理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位、進(jìn)化關(guān)系等方面進(jìn)行初步分析。結(jié)果表明：可可E2s基因CDS長(zhǎng)度在441（TcUEV3）～3 651 bp（TcUBC7）之間，對(duì)應(yīng)的編碼蛋白氨基酸數(shù)目在146（TcUEV3）～1 216 aa（TcUBC7）之間，編碼蛋白分子量在16.39～134.71 ku之間。E2s基因外顯子在1～11之間，多數(shù)基因外顯子數(shù)目在5～7之間。E2s基因在10條染色體上均有分布，1號(hào)染色體為7個(gè)，數(shù)量最多；6號(hào)染色體2個(gè)基因，數(shù)量最少?？煽蒃2s蛋白大多為不穩(wěn)定蛋白，且均為親水性蛋白，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主要構(gòu)成元件。大多數(shù)可可E2s蛋白定位在細(xì)胞核，少數(shù)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者細(xì)胞質(zhì)。進(jìn)化樹分析表明：可可E2s蛋白被分為20個(gè)亞家族，包括 16個(gè)UBC亞家族和4個(gè)UEV亞家族，第Ⅵ亞家族E2s數(shù)目最多為9個(gè)；E2s家族蛋白在物種進(jìn)化過程中具有高度保守性。

關(guān)鍵詞 可可；泛素結(jié)合酶（E2s）；基因家族；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào) S571.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和降解必須保持平衡，才能維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和正常功能。泛素-蛋白酶體途徑（Ubiqutin-proteasome pathway， UPP）是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)過程，尤其在維持細(xì)胞功能、細(xì)胞衰老、胚胎發(fā)育、光形態(tài)建成、組織分化、晝夜節(jié)律控制、花器官發(fā)育、激素信號(hào)響應(yīng)、抵御生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用[1-9]。泛素化過程主要由泛素活化酶（ubiquitin-activating enzymes， E1s）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzymes， E2s）和泛素連接酶（ubiquitin-protein ligases， E3s）3種主要的酶來完成[10]。其中E2s是蛋白泛素化的中間環(huán)節(jié)，在泛素化系統(tǒng)中，負(fù)責(zé)將E1s激活的泛素分子轉(zhuǎn)移至底物或者E3s，調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白聚泛素鏈的形成，并與E3s共同確定底物的特異性[11-13]。

E2s蛋白在真核生物中廣泛存在，所有E2s蛋白均包含由150左右的氨基酸組成保守催化結(jié)構(gòu)域，稱為UBC domain，內(nèi)含有1個(gè)高度保守的半胱氨酸活性位點(diǎn)[14-15]。另外還存在一類UEV（ubiqutin E2 variants）蛋白[16]，該蛋白家族在序列和結(jié)構(gòu)上與E2s相似，但是缺少半胱氨酸催化位點(diǎn)，其功能也與典型的E2s蛋白有所不同[17-18]。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于E2s蛋白所具有的高度保守的UBC結(jié)構(gòu)域，E2s家族已在多個(gè)真核生物中被鑒定出來，如酵母[15]、線蟲[19]、人類[20]、擬南芥[21]、水稻[13]、番茄[22]、香蕉[23]、玉米[24]等。但目前對(duì)E2s蛋白家族的功能研究仍然偏少，僅在擬南芥上有較為深入的研究。如研究表明擬南AtUBC1和AtUBC2參與葉片發(fā)育和植物成花抑制基因的激活，atubc1-1 atubc2-1的雙突變體表現(xiàn)出擬南芥蓮座葉減少和花期明顯提前的突變表型[5]；AtUBC13在DNA復(fù)制后修復(fù)以及N-末端序列的蛋白降解方面發(fā)揮著重要作用[25]；另外COP10作為擬南芥的UEV蛋白，其在植物的光形態(tài)建成中起著重要作用[26]。

可可（Theobroma cacao L.）與咖啡、茶一同被稱為世界三大飲料作物，原產(chǎn)于亞馬遜河上游熱帶雨林，主要分布在南北緯10°以內(nèi)地帶。可可的營(yíng)養(yǎng)豐富，滋味醇香，具有興奮與滋補(bǔ)作用，主要被用來制作飲料、巧克力、糕點(diǎn)等高檔食品，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[27-28]。目前，世界上有超過50個(gè)國(guó)家進(jìn)行規(guī)模種植[29]。隨著可可全基因組的測(cè)序成功，更多的可可基因資源可供挖掘利用，也為鑒定可可E2s基因提供數(shù)據(jù)支持。本研究從可可全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中分析篩選E2s家族基因，并利用生物信息學(xué)的方法，對(duì)篩選到的E2s家族進(jìn)行理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、系統(tǒng)進(jìn)化等方面進(jìn)行初步分析，以期為后續(xù)開展可可E2s家族基因相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以熱帶特色作物可可（Theobroma cacao L.）為研究對(duì)象，基因數(shù)據(jù)來源于Cacao Genome Database數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.cacaogenomedb.org/）及Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥、水稻和可可E2s家族基因序列的獲取

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/）和水稻RAP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）中分別提取48個(gè)擬南芥[19]和48個(gè)水稻[20]E2s基因的CDS序列和蛋白序列，以FASTA格式保存。用擬南芥的E2s蛋白序列在Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中，通過基因查找和序列比對(duì)，查找可可基因組中所有E2s基因的CDS和蛋白序列，并利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線分析軟件對(duì)候選基因的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定，凡是含有UBC保守結(jié)構(gòu)域的蛋白即為E2s家族成員。

1.2.2 可可E2s基因結(jié)構(gòu)分析 利用Gene Structure Display Server GSDS在線軟件（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)可可的E2s基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行作圖，可可編碼區(qū)序列（CDS）與基因組DNA序列來自Phytozome（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.3 可可E2s蛋白的氨基酸序列屬性分析 將獲得的可可E2s蛋白的氨基酸序列投入Ex-PAsy （http：//www.expasy.org/）站點(diǎn)，利用其中的Prot-Param軟件在線分析E2s蛋白的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和疏水性等物理屬性。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用在線SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html），所有參數(shù)均為默認(rèn)值。亞細(xì)胞定位采用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）進(jìn)行分析。

1.2.4 可可和擬南芥、水稻E2s家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用Clustal W對(duì)可可、擬南芥和水稻中所有E2s蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)合MEGA6.06軟件構(gòu)建可可、擬南芥及水稻E2s蛋白家族的無(wú)根進(jìn)化樹，進(jìn)化樹生成采用鄰接法（neighbor joining，NJ），參數(shù)設(shè)置：使用neighbor-joining法則的P-距離（P-distance）模型構(gòu)建，選擇了成對(duì)刪除（pairwise deletion）空位（gap）的選項(xiàng)，Bootstrap method取值1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 可可E2s家族基因鑒定和基因相關(guān)信息分析

E2s蛋白均包含高度保守的催化結(jié)構(gòu)域（UBC domain），根據(jù)其UBC結(jié)構(gòu)域，通過基因查找和序列比對(duì)，最終確定45個(gè)可可E2s基因，其中包含39個(gè)UBC和6個(gè)UEV基因，為了描述方便，將篩選到的E2s基因根據(jù)其在染色體上的位置，分別命名為TcUBC1-39和TcUEV1-6（見表1）。由表1可以看出，可可E2s家族基因序列在轉(zhuǎn)錄后會(huì)產(chǎn)生1～5個(gè)可變剪接，其中TcUBC7和TcUBC23的可變剪接數(shù)為5個(gè)，數(shù)量最多?？勺兗艚颖徽J(rèn)為是導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能多樣性的重要原因之一，使一個(gè)基因可編碼多個(gè)不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白產(chǎn)物，已有研究表明，可變剪接在產(chǎn)生受體多樣性、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育等方面起決定性作用[30]。鑒于較多的可可E2s基因存在可變剪接，在分析基因結(jié)構(gòu)特征時(shí)，僅選擇最主要的可變剪接體進(jìn)行分析（詳見Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋）。已鑒定到的可可E2s基因CDS長(zhǎng)度在441（TcUEV3）～3 651 bp（TcUBC7）之間，跨度較大，對(duì)應(yīng)的編碼蛋白氨基酸數(shù)目在146（TcUEV3）～1 216 aa（TcUBC7）之間，編碼蛋白分子量在16.39～134.71 ku之間。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分析結(jié)果表明可可E2s蛋白包含酸性、中性、堿性3種蛋白，其中等電點(diǎn)小于6.5的蛋白有19個(gè)，顯酸性；6.5～7.5之間的蛋白有4個(gè)，顯中性；大于7.5的蛋白個(gè)數(shù)有23個(gè)，顯堿性。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)可可E2s蛋白大多數(shù)屬于不穩(wěn)定蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)>40；TcUBC7/10/19/20/21/24/30和TcUEV2/3/4/5共10個(gè)E2s蛋白為穩(wěn)定蛋白。疏水性分析顯示平均疏水性（GRAVY）在-0.894（TcUBC33）～-0.07（TcUEV5）之間，表明所有可可E2s蛋白均為親水性蛋白。可可E2s蛋白脂肪系數(shù)（AI）在62.78（TcUBC6）～91.49（TcUBC14）之間（表1）。

可可E2s家族基因在10個(gè)染色體上均有分布，但分布并不均勻（圖1）。1號(hào)染色體數(shù)量最多為7個(gè)；2號(hào)、3號(hào)和9號(hào)染色體上有6個(gè)基因；8號(hào)染色體有5個(gè)基因；10號(hào)染色體有4個(gè)；4、5和7號(hào)染色體均分布有3個(gè)E2s基因；6號(hào)染色體分布有2個(gè)基因，數(shù)量最少?？煽蒃2s基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示：E2s基因含1個(gè)（TcUBC20、TcUEV6）至11（TcUBC23）個(gè)外顯子，而多數(shù)基因的外顯子數(shù)目在5～7之間（表1和圖2）。

2.2 可可E2s蛋白的二級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及UBC結(jié)構(gòu)域分析

可可E2s蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示?？煽蒃2s蛋白均由α-螺旋、擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲4種形式組成，以無(wú)規(guī)則卷曲為主的蛋白有24個(gè)，所占百分比在33.3%～47.66%之間，以α-螺旋為主要構(gòu)成元件蛋白有19個(gè)，所占百分比在33.72%～53.09%之間，另外TcUBC15和TcUBC17α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占百分比一致，均為40.54%?？煽蒃2s蛋白擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角所占百分比例較小，說明可可E2s蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。

蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)可可E2s蛋白大多定位于細(xì)胞核中，少數(shù)蛋白被定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者細(xì)胞質(zhì)中，如TcUBC11、TcUBC13、TcUBC22和TcUBC27定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，TcUBC36定位在細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而TcUBC18和TcUBC38僅定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

盡管E2s蛋白均含有一個(gè)由150個(gè)氨基酸組成的高度保守的UBC結(jié)構(gòu)域，但是N端和C端的大小和結(jié)構(gòu)上仍然存在很大差別，而這些側(cè)翼序列參與底物的選擇，二聚反應(yīng)和其他相關(guān)過程，往往導(dǎo)致E2s蛋白間的功能差異[31-32]。根據(jù)是否具有N端和C端延長(zhǎng)鏈，將E2s蛋白分為4大亞類，ClassⅠ僅含有UBC/UEV結(jié)構(gòu)域，ClassⅡ包含UBC/UEV結(jié)構(gòu)域和C端延長(zhǎng)的蛋白序列，ClassⅢ包含UBC/UEV結(jié)構(gòu)域和N端延長(zhǎng)的蛋白序列，ClassⅣ包含UBC/UEV結(jié)構(gòu)域、N端和C端延長(zhǎng)的蛋白序列[33]。通過SMART程序分析可可E2s蛋白的UBC結(jié)構(gòu)域（圖3）?？煽蒃2s蛋白UBC結(jié)構(gòu)存在4大亞類，其中屬于ClassⅣ亞類的E2s蛋白為16個(gè)，數(shù)量最多，其氨基酸數(shù)目在159～1 216 aa之間（表1）；其次為ClassⅠ亞類，為14個(gè)，氨基酸數(shù)目在148～166 aa之間（表1），ClassⅡ和ClassⅢ亞類分別包含9個(gè)和6個(gè)E2s蛋白，氨基酸數(shù)目分別在161～276 aa和172～517 aa之間（表1）。ClassⅠ亞類僅含有UBC結(jié)構(gòu)，因此其氨基酸數(shù)目相對(duì)較少；ClassⅢ亞類僅包含C端延長(zhǎng)和UBC結(jié)構(gòu)域，而TcUBC34（517 aa）長(zhǎng)于ClassⅣ亞類中除了TcUBC7（1 216 aa）和TcUBC26（661 aa）之外的所有蛋白，E2s蛋白結(jié)構(gòu)域之間的差異也導(dǎo)致其功能間的差異。

2.3 可可E2s蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了分析可可E2s家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用可可45個(gè)E2s蛋白，模式植物擬南芥48個(gè)E2s蛋白[21]和水稻48個(gè)E2s蛋白[13]（均包括其UEV蛋白）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），并參照擬南芥E2s蛋白亞家族分類[21]。進(jìn)化分析將45個(gè)可可E2s蛋白分為20個(gè)亞家族，包括16個(gè)UBC亞家族和4個(gè)UEV亞家族。各亞家族所含E2s蛋白數(shù)量差異較大，其中Ⅵ亞家族包含可可E2s蛋白為9個(gè)，數(shù)量最多，分別是TcUBC1/5/8/15/17/25/31/32/37；其次為Ⅺ家族，包含6個(gè)E2s蛋白，分別為TcUBC7/10/19/20/24/26。而Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ、ⅩⅢ、ⅩⅤ、ⅩⅥ共6個(gè)亞家族中，僅包含一個(gè)E2s蛋白，分別為TcUBC33、TcUBC21、TcUBC14、TcUBC30、TcUBC27、TcUBC34。另外，Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、ⅩⅣ共5個(gè)亞家族均含有2個(gè)E2s蛋白。TcUBC4和TcUBC28屬于Ⅰ亞家族，TcUBC3和TcUBC9屬于Ⅱ亞家族，TcUBC36和TcUBC38屬于Ⅴ亞家族，TcUBC35和TcUBC39屬于Ⅷ亞家族，TcUBC18和TcUBC23屬于ⅩⅣ亞家族。TcUBC11/12/13屬于Ⅲ亞家族。6個(gè)UEV蛋白被分為ⅩⅦ、ⅩⅧ、ⅩⅨ和ⅩⅩ四個(gè)亞家族，其中TcUEV1和TcUEV6屬于ⅩⅦ亞家族；TcUEV2和TcUEV3屬于ⅩⅧ亞家族；TcUEV4和TcUEV5分別屬于ⅩⅨ和ⅩⅩ亞家族。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可以用來識(shí)別不同物種間直系同源基因和物種內(nèi)旁系同源基因，通常直系同源基因的發(fā)生會(huì)促使新物種的形成，而旁系同源基因產(chǎn)生則是新功能的來源[34]。進(jìn)化樹分析鑒定出6對(duì)旁系同源蛋白，分別為TcUBC2和TcUBC29、TcUBC3和TcUBC9、TcUBC4和TcUBC28、TcUBC35和TcUBC39、TcUEV2和TcUEV3、TcUEV1和TcUEV6?？煽蒃2s蛋白與擬南芥和水稻均存在直系同源蛋白，校驗(yàn)參數(shù)（bootshap）>90%的分別有10對(duì)和8對(duì)，其中TcUBC14、TcUBC18、TcUBC23、TcUBC33、TcUEV4在擬南芥和水稻中均存在其直系同源蛋白。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的不斷提高，越來越多的植物完成全基因組的測(cè)序工作，這也促使相關(guān)基因家族研究快速發(fā)展。E2s家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育方面起著非常重要的作用，而目前僅在擬南芥[21]、水稻[13]、番茄[22]、玉米[24]等模式植物中有部分研究，許多作物仍然亟待開展E2s基因家族的相關(guān)研究。本研究通過對(duì)可可全基因組全面查找、各種軟件和在線工具分析，共鑒定出45個(gè)E2s基因，其中包括39個(gè)UBC基因和6個(gè)UEV基因，其E2s基因數(shù)目與水稻（48）和擬南芥（48）相似。E2s基因家族在生物演變過程中不斷擴(kuò)大，低級(jí)真核生物的E2s基因數(shù)目少于高級(jí)真核生物[20]。已有報(bào)道低級(jí)真核生物酵母中發(fā)現(xiàn)13個(gè)[15]，線蟲中20個(gè)[19]，綠藻中19個(gè)（數(shù)據(jù)未發(fā)表）；而在高級(jí)植物和動(dòng)物中E2s基因數(shù)目較多，比如在人類中發(fā)現(xiàn)37個(gè)[20]，番茄中52個(gè)[22]，香蕉中74個(gè)[23]，玉米中75個(gè)，其中69個(gè)UBC基因和6個(gè)UEV基因[24]。

為了揭示可可E2s家族的進(jìn)化關(guān)系，將擬南芥、水稻和可可共141個(gè)E2s蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進(jìn)化分析將可可E2s蛋白分為20個(gè)亞家族，各亞家族所含蛋白數(shù)目差別很大，Ⅵ亞家族包含9個(gè)E2s蛋白，Ⅺ亞家族為6個(gè)。擬南芥和水稻的Ⅵ和Ⅺ亞家族也包含較多的E2s蛋白，但在數(shù)目上有差別，如二者Ⅵ亞家族均包含8個(gè)E2s蛋白，而Ⅺ亞家族中包含4個(gè)和9個(gè)E2s蛋白?？煽稍趤喖易澧ⅱ?、Ⅻ、ⅩⅢ、ⅩⅤ、ⅩⅥ僅有1個(gè)E2s蛋白，擬南芥[21]和水稻[35]這些亞家族也包含較少E2s蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的亞家族包含擬南芥、水稻和可可3個(gè)物種，而少數(shù)亞家族僅包括1個(gè)或2個(gè)物種。如ⅩⅢ和ⅩⅦ亞家族包括擬南芥和可可2個(gè)物種；而ⅩⅩ亞家族僅包含可可E2s蛋白（TcUEV5），這表明該蛋白可能是生物進(jìn)化過程中可可所特有的E2s蛋白。以往研究發(fā)現(xiàn)水稻和擬南芥E2s蛋白亞家族非常相似，揭示在單子葉和雙子葉植物分化之前E2s家族已經(jīng)存在。本研究發(fā)現(xiàn)可可與擬南芥和水稻間均存在直系同源蛋白，也進(jìn)一步證明植物E2s蛋白具有共同的起源，進(jìn)化過程高度保守。另外，同一亞家族E2s在基因結(jié)構(gòu)和UBC結(jié)構(gòu)域上往往具有較高的相似性[24]。在可可Ⅵ亞家族中TcUBC8/15/25/31/32均含有5個(gè)外顯子，基因結(jié)構(gòu)相似；且TcUBC1/5/8/15/17/25/31/37UBC結(jié)構(gòu)域也相似，均屬于ClassⅠ亞類。同一亞家族的E2s蛋白在功能上往往也較為相似，進(jìn)化分析表明TcUEV4和AtCOP10之間校驗(yàn)參數(shù)（bootshap）達(dá)98%，因此根據(jù)前人研究可以推測(cè)TcUEV4可能對(duì)可可的光形態(tài)建成起著重要作用，但其具體功能仍需后續(xù)驗(yàn)證。

可可屬于典型的熱帶作物，適宜在高溫、高濕且較為蔭蔽的環(huán)境下種植，但我國(guó)熱區(qū)面積有限，適宜可可種植區(qū)域較少，且在生產(chǎn)上容易遭受低溫和干旱等逆境脅迫，影響可可產(chǎn)業(yè)發(fā)展。泛素結(jié)合酶作為泛素化途徑中的關(guān)鍵酶，在調(diào)控植物生長(zhǎng)、發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。而目前，可可E2s家族基因相關(guān)研究仍未見報(bào)道。本研究對(duì)可可E2s基因家族進(jìn)行了初步分析，為將來深入研究該基因家族的表達(dá)調(diào)控、結(jié)構(gòu)和功能等提供參考，也為進(jìn)一步揭示該基因家族參與可可生長(zhǎng)、發(fā)育的調(diào)控以及響應(yīng)逆境脅迫的機(jī)制提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Vierstra R D. Proteolysis in plants： mechanisms and functions[J]. Plant Molecular Biology， 1996， 32（1-2）： 275-302.

[2] Welchman R L， Gordon C， Mayer R J. Ubiquitin and ubiquitin-like proteins as multifunctional signals[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2005， 6（8）： 599-609.

[3] Sadanandom A， Bailey M， Ewan R， et al. The ubiquitin-proteasome system： central modifier of plant signaling[J]. New Phytologist， 2012， 196（1）： 13-28.

[4] Dreher K， Callis J. Ubiquitin， hormones and biotic stress in plants[J]. Annals of Botany， 2007， 99（5）： 787-822.

[5] Xu L， Ménard R， Berr A， et al. The E2 ubiquitin-conjugating enzymes， AtUBC1 and AtUBC2， play redundant roles and are involved in activation of FLC expression and repression of flowering in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal， 2009， 57： 279-288.

[6] Cui F， Liu L， Zhao Q， et al. Arabidopsis ubiquitin conjugase UBC32 is an ERAD component that functions in brassinosteroid-mediated salt stress tolerance[J]. The Plant Cell， 2012（24）： 233-244.

[7] Smalle J， Vierstra R D. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway[J]. Plant Biology， 2004， 55： 555-590.

[8] Santner A， Estelle M. The ubiquitin-proteasome system regulates plant hormone signaling[J]. The Plant Journal， 2010， 61： 1 029-1 040.

[9] Park C， Chen S， Shirsekar G， et al. The Magnaporthe oryzae effector AvrPiz-t targets the RING E3 Ubiquitin Ligase APIP6 to suppress pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity in rice[J]. The Plant Cell， 2012 （24）： 4 748-4 762.

[10] Glickman M H， Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway： destruction for the sake of construction[J]. Physiological Reviews， 2002， 82（2）： 373-428.

[11] Bae H， Kim W T. The N-terminal tetra-peptide（IPDE）short extension of the U-box motif in rice SPL11 E3 is essential for the interaction with E2 and ubiquitin-ligase activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2013， 433（2）： 266-271.

[12] Ye Y， Rape M. Building ubiquitin chains： E2 enzymes at work[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2009， 10： 755-764.

[13] Bae H， Kim W T. Classification and interaction modes of 40 rice E2 ubiquitin-conjugating enzymes with 17 rice ARM-U-box E3 ubiquitin ligases[J]. Biochemical and Biophysical Research Communication， 2014， 444（4）： 575-580.

[14] Criqui M C， de Almeida Engler J， Camasses A， et al. Molecular characterization of plant ubiquitin-conjugating enzymes belonging to the UbcP4/E2- C/UBCx/UbcH10 gene family[J]. Plant Physiology， 2002，130： 1 230-1 240.

[15] Michelle C， Vourc'h P， Mignon L， et al. What was the set of ubiquitin and ubiquitin-like conjugating enzymes in the eukaryote common ancestor？[J]. Journal of Molecular Evolution， 2009， 68（6）： 616-628.

[16] Thomson T M， Lozano J J， Loukili N， et al. Fusion of the human gene for the polyubiquitination coeffector UEV1 with Kua， a newly identified gene[J]. Genome Research， 2000， 10（11）： 1 743-1 756.

[17] Kerscher O， Felberbaum R， Hochstrasser M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins[J]. Cell Development Biology， 2006， 22： 159-180.

[18] Hochstrasser M. All in the ubiquitin family[J]. Science， 2000， 289（5479）： 563-564.

[19] Jones D， Crowe E， Stevens T A， et al. Functional and phylogenetic analysis of the ubiquitylation system in Caenorhabditis elegans： ubiquitin-conjugating enzymes， ubiquitin-activating enzymes， and ubiquitin-like proteins[J]. Genome Biology， 2001， 3（1）： 0002.1-0002.15.

[20] van Wijk S J L， Timmers H T M. The family of ubiquitin-conjugating enzymes（E2s）： deciding between life and death of proteins[J]. The Faseb Journal， 2010， 24（4）： 981-993.

[21] Kraft E， Stone S L， Ma L， et al. Genome analysis and functional characterization of the E2 and RING-type E3 ligase ubiquitination enzymes of Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2005， 139（4）： 1 597-1 611.

[22] Wang Y， Wang W， Cai J， et al. Tomato nuclear proteome reveals the involvement of specific E2 ubiquitin-conjugating enzymes in fruit ripening[J]. Genome Biology， 2014， 15（12）： 548.

[23] Dong C， Hu H， Jue D， et al. The banana E2 gene family： genomic identification， characterization， expression profiling analysis[J]. Plant Science， 2016， 245： 11-24.

[24] Jue D， Sang X， Lu S， et al. Genome-wide identification， phylogenetic and expression analyses of the ubiquitin-conjugating enzyme gene family in maize[J]. PloS One， 2015， 10（11）： 21-35.

[25] Broomfield S， Hryciw T， Xiao W. DNA postreplication repair and mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae[J]. Mutation Research/DNA Repair Reports， 2001， 486（3）： 167-184.

[26] Lau O S， Deng X W. Effect of Arabidopsis COP10 ubiquitin E2 enhancement activity across E2 families and functional conservation among its canonical homologues[J]. Biochemical Journal， 2009， 418（3）： 683-690.

[27] Buamah R， Dzogbefia V P， Oldham J H. Pure yeast culture fermentation of cocoa（Theobroma cacao L）： effect on yield of sweatings and cocoa bean quality[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 1997， 13（4）： 457-462.

[28] Beavan M， Kligerman A， Droniuk R， et al. Production of microbial cocoa butter equivalents[M]. Industrial Applications of Single Cell Oils. AOCS Press： Champaign， 1992： 156-184.

[29] 李付鵬， 秦曉威， 伍寶朵， 等. 可可蔗糖磷酸合成酶基因家族進(jìn)化及組織表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2015， 36（9）： 1 608-1 613.

[30] Tack D C， Pitchers W R， Adams K L. Transcriptome analysis indicates considerable divergence in alternative splicing between duplicated genes in Arabidopsis thaliana[J]. Genetics， 2014， 198（4）： 1 473-1 481.

[31] Arrigoni A， Grillo B， Vitriolo A， et al. C-terminal acidic domain of ubiquitin-conjugating enzymes： A multi-functional conserved intrinsically disordered domain in family 3 of E2 enzymes[J]. Journal of Structural Biology， 2012， 178（3）： 245-259.

[32] Schumacher F R， Wilson G， Day C L. The N-terminal extension of UBE2E ubiquitin-conjugating enzymes limits chain assembly[J]. Journal of Molecular Biology， 2013， 425（22）： 4 099-4 111.

[33] Bachmair A， Novatchkova M， Potuschak T， et al. Ubiquitylation in plants： a post-genomic look at a post-translational modification[J]. Trends in Plant Science， 2001， 6（10）： 463-470.

[34] Thornton J W， De Salle. Gene family evolution and homology： Genomics meets phylogenetics[J]. Annual Review of Genomics and Human Genetics， 2000， 1（1）： 41-73.

[35] Zhiguo E， Zhang Y， Li T， et al. Characterization of the ubiquitin-conjugating enzyme gene family in rice and evaluation of expression profiles under abiotic stresses and hormone treatments[J]. PloS One， 2015， 10（4）： 1-24.