陳振東 鄭濤 林秀香 林藝華 鄭少緣 蘇金強

摘 要 采用ISSR和RAPD分子標記技術對9個種44份野牡丹屬種質(zhì)資源進行了親緣關系分析。結果表明：11條ISSR引物共擴增出91條譜帶，其中多態(tài)性條帶90條，多態(tài)性條帶的比率為98.9%；16 條RAPD引物共擴增出113條譜帶，其中101條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為89.38%。2種分子標記相比較，ISSR分子標記檢測出的多態(tài)性比率更高。44份野牡丹屬種質(zhì)明顯聚為2組，種質(zhì)資源遺傳相似系數(shù)在0.61～0.88，平均相似系數(shù)0.75?；诓煌锏臈l帶組合構建了供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的ISSR和RAPD指紋圖譜，采用這2種指紋圖譜可對供試的所有野牡丹屬種質(zhì)資源進行鑒定。

關鍵詞 野牡丹屬；種質(zhì)；分子標記；親緣關系；指紋圖譜

中圖分類號 S682.39 文獻標識碼 A

野牡丹科（Melastomaceae）植物全世界約240個屬，共3 000余種[1]。野牡丹屬（Melastoma）屬于野牡丹科，大約有100個種，分布中心處于東南亞一帶，中國有9個種和1個變種，主要分布帶處于長江以南各個省區(qū)[2]。野牡丹屬植物花色有白色系、粉色系、紫色系，其花期長、花量大，株型從地被、灌木到小喬木均有分布，園林運用上可做到周年有花（花期：地菍、印度白花野牡丹四季開花，展毛野牡丹3～4月，紫毛、多花、細葉野牡丹、毛菍5～6月份，野牡丹、毛菍7～8月），具備良好的觀賞性狀；此外，該屬植物的藥用價值近來也有深入研究[3-4]，發(fā)展前景廣泛。目前，絕大多數(shù)的野牡丹屬植物仍未被人工開發(fā)利用，已在野牡丹屬種質(zhì)資源的收集及評價[5-9]、栽培技術[10]、脫毒育苗[11-13]、傳粉特性[14-15]以及種子發(fā)育[16]等方面進行了研究。

目前，針對野牡丹屬的分類研究主要集中于宏觀形態(tài)學[16]、細胞遺傳學[17]、孢粉學[18]、細胞學[19]、表型多樣性[20-21]等方面，利用分子標記對野牡丹種質(zhì)資源的遺傳性進行研究還比較少。鄭濤等[22]利用ISSR分子標記對福建省33份野牡丹屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行研究，聚類分析表明，34份材料可劃分為3個類群5個亞類，主坐標散點分析可分為4個類群，這與根據(jù)形態(tài)學劃分的結果基本一致。野牡丹屬因為分布范圍廣、自然雜交類型豐富，一些野生種質(zhì)的分類尚未十分明確，給人工雜交親本選擇帶來了不少困擾。因此，本研究在前期研究的基礎上擴大了取樣范圍，以中國的44份野牡丹屬種質(zhì)為研究對象， 利用ISSR和RAPD分子標記技術，再次從分子水平上探討野牡丹屬內(nèi)的親緣關系，為有效利用分子標記評價野牡丹屬種質(zhì)資源遺傳多樣性及遺傳基礎提供理論依據(jù)，同時，利用篩選出的通用引物構建44份野牡丹屬野生種質(zhì)資源的RAPD、ISSR指紋圖譜，為野牡丹屬野生種質(zhì)資源快速鑒定及后期人工選育種親本選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試材料為野牡丹屬野生種質(zhì)資源共9個種44份材料，來源于福建、廣東、廣西、海南、云南5個省份。采集新鮮葉片凍于液氮，保存在-80 ℃。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用前期試驗確定的改良CTAB法提取野牡丹基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度法定量后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 ISSR-PCR反應體系的建立：DNA模板（30 ng/μL）0.7 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.6 μL，引物（10 μmol/L）0.8 μL，Taq酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH2O定容20 μL。反應程序：反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min；53 ℃退火40 s；72 ℃延伸2 min。

PAPD-PCR反應體系的建立：DNA模板（20 ng/uL）1.5 μL，10×Taq Green Buffer（含Mg2+）2 μL，引物（10 μmol/L）0.7 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O定容20 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，38 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，45個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3 引物篩選 從116條ISSR、100條RAPD隨機引物中分別篩選出11條、16條多態(tài)性好、條帶清晰的引物供PCR反應（表2、表3）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)2種分子標記方法通過PCR反應擴增出的條帶圖片，對同一引物所擴增出遷移率相同的條帶計為1個位點，有條帶的位置計為“1”，無條帶位置計為“0”，所得數(shù)據(jù)輸入Excel 2003工作表建成原始“0/1”數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYS聚類分析軟件進行聚類分析。針對所有供試品種，對11條ISSR引物和16條RAPD引物擴增出的條帶進行比對，選出鑒別能力較強的引物，然后對由這些引物經(jīng)PCR反應跑出的電泳條帶進行形象化處理，同一位點上記為“1”的電泳條帶用黑色方塊表示，記為“0”的條帶用白色方塊表示，據(jù)此構建出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 ISSR分子標記結果與分析

本研究以前期試驗篩選出的11條ISSR隨機引物對供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源進行DNA多態(tài)性檢測[16]，總共擴增出91條清晰度好，重復性高的譜帶，其中多態(tài)性譜帶有90 條，多態(tài)性條帶比例為98.9%（表2）。擴增結果表明，擴增位點最多的引物為UBC857 、UBC811和CW32506，位點數(shù)均為12個。其中引物UBC857對44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴增圖譜見圖1。

2.2 RAPD標記結果與分析

16條RAPD引物共擴增出113條譜帶，其中101條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為89.38%。擴增產(chǎn)物大小集中在2 00～2 000 bp。擴增位點最多的引物是S1、S19、S43，位點數(shù)均為9。其中引物S19對44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴增圖譜見圖2。

2.3 44份野牡丹屬種質(zhì)親緣關系分析

綜合44份野牡丹屬種質(zhì)ISSR和RAPD擴增條帶數(shù)做聚類分析，聚類結果見圖3?？蓪⒐┰囈澳档俜N質(zhì)資源分為2大類群。3號毛菍與其他各地的地菍聚為Ⅰ類；其他36份野牡丹屬種質(zhì)聚類Ⅱ類。Ⅱ類野牡丹屬種質(zhì)較多，可細分為3組，1組為1號、2號、4號、5號、6號、7號、8號、10號、9號、12號、11號、18號、13號、19號、21號、20號、33號；2組為30號、31號、32號、34號、35號、36號、37號、38號、39號、40號、41號、43號、44號、；3組為14號、27號、28號、29號福建多花野牡丹與42號云南普洱的多花野牡丹。44份野牡丹屬種質(zhì)資源遺傳相似系數(shù)在0.61～0.88，平均相似系數(shù)為0.75，表明44份野牡丹屬種質(zhì)之間的親緣關系較近。

2.4 44份野牡丹屬種質(zhì)指紋圖譜的建立

由于ISSR引物的多態(tài)性，同一引物擴增出的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的條帶有明顯差異。比對結果表明：利用引物UBC811可以鑒別出38份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物UBC851可以鑒別出42份野牡丹屬種質(zhì)資源，而采用引物UBC811和UBC857組合可以鑒別出供試的44份野牡丹種質(zhì)資源。

從篩選16條ARAPD引物中選擇多態(tài)性好、鑒別效率高的核心引物S19和S43，建立44份野牡丹屬種質(zhì)資源的指紋圖譜（圖5）。利用引物S19可以鑒別出30份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物S43可以鑒別出29份野牡丹種質(zhì)資源，而采用引物S19和S43組合可以鑒別出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源。由圖5可知，利用2條RAPD核心引物可建立44份野牡丹種質(zhì)資源的指紋圖譜，每個品種都有唯一的指紋圖譜。

3 討論與結論

3.1 分子標記用于野牡丹種質(zhì)的遺傳變異研究

采用ISSR分子標記研究44份野牡丹種質(zhì)的遺傳變異情況，10條ISSR引物共擴增出91條帶，其中多態(tài)性條帶90條，多態(tài)性比率98.9%；采用RAPD分子標記對44份野牡丹種質(zhì)的遺傳變異進行研究，16條PAPD引物共擴增出113條帶，其中多態(tài)性條帶101條，多態(tài)性比率89.38%?？梢?，2種分子標記均可檢測出野牡丹種質(zhì)資源間較為豐富的遺傳變異；但比較起來，ISSR分子標記檢測出的多態(tài)性比率比RAPD分子標記檢測出的高。采用ISSR分子標記研究野牡丹屬種質(zhì)間的遺傳變異，其多態(tài)性位點的百分率為98.9%，高于新疆紅花（Canluumts tinctorius）[21]品種間的93.77%、菊花（Dendranthema×grandi flora）[22]品種間的92.5%和君子蘭[23]（Clivia）品種間的81.95%；采用RAPD標記研究野牡丹種質(zhì)的遺傳變異，其多態(tài)性位點的百分率僅為89.38%，接近于亞麻（Linum usitatissimum）[24]品種間的90.49%，高于石蒜（Lycoris Herb.）[25]品種間的70%，低于紅花（Canluumts tinctorius）[21]品種間92.31%。2種分子標記遺傳相似性分析結果表明，野牡丹屬種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)0.61～0.88之間，表明44份野牡丹屬種質(zhì)資源之間親緣關系較近。

3.2 野牡丹屬種質(zhì)的遺傳變異分析

與之前的研究結果[22]對比，本研究擴大了取樣范圍，從外觀形態(tài)上判斷，增加了《福建植物志》以外的3個種（紫毛、印度、大野牡丹）進行比較分析，得到較為全面的分析數(shù)據(jù)。本研究2種分子標記方法都將地菍單獨聚為一類，這與先前的研究結果[22]相同，表明地菍與其它種間的親緣關系相對較遠，在自然雜交過程中的參與度較低；4號印度白花野牡丹是印度野牡丹（Melastoma malabathricum，粉色花）的變異種，研究結果將其與5號廣州多花野牡丹聚在一起，說明二者在親緣關系上非常接近。研究結果也發(fā)現(xiàn)，通過形態(tài)學觀測很難準確的將野牡丹屬中的幾個種進行區(qū)分，甚至發(fā)生錯誤分類，例如，44號大野牡丹葉片、花瓣顯著大于其他樣品，形態(tài)特征與大野牡丹類似，通過形態(tài)學分類很容易將其歸為大野牡丹類，而標記結果則表明其應為多花野牡丹類群；32號云南版納的多花野牡丹應為野牡丹類群；37號云南版納的野牡丹，與38、39親緣關系最近，兼有野牡丹、展毛野牡丹的特征，因此將其歸為展毛野牡丹更為準確。另外，野牡丹屬親緣關系遠近不但與種的類別有關也與地域分布存在一定關系，相同來源地的野牡丹屬植物因種間差異可能親緣關系較遠，如10號與12、/13號，而不同來源地的植物因種間差異較小可能被聚為一類，如30、/31號，這也說明多花野牡丹種內(nèi)存在比較明顯的基因分離現(xiàn)象，遺傳背景比較復雜。從本研究的樣品分析來看，地菍具有較強的遺傳穩(wěn)定性，其余野牡丹屬種間、不同來源地的同種植物存在明顯的基因交叉，再次證明了前期研究得到的野牡丹屬植物“遺傳背景復雜、自然雜交類型豐富、親緣關系總體較近”的結論。

本研究分別篩選出2條特異引物建了供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的ISSR和RAPD指紋圖譜，采用這2種指紋圖譜可對供試的所有野牡丹屬種質(zhì)行鑒定，為利用分子標記技術快速、準確地鑒定野牡丹屬資源奠定基礎。

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