王榮春，韓利文，陳錫強(qiáng)，何秋霞，王希敏，彭維兵，孫晨，韓建，劉可春

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

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【藥理與毒理】

利用斑馬魚(yú)模型研究蘆薈大黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞SiHa的抑制作用

王榮春，韓利文，陳錫強(qiáng)，何秋霞，王希敏，彭維兵，孫晨，韓建，劉可春*

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

摘要：通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)研究不同濃度蘆薈大黃素(Aloe emodin，AE)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞SiHa生長(zhǎng)的抑制作用，并將SiHa細(xì)胞注入48 hpf的斑馬魚(yú)胚胎卵黃囊，建立斑馬魚(yú)移植瘤模型，然后用不同濃度AE進(jìn)行處理，考察腫瘤細(xì)胞在斑馬魚(yú)體內(nèi)的增殖和遷移情況。結(jié)果顯示，AE對(duì)SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨濃度和作用時(shí)間的增加而呈明顯上升趨勢(shì)，表現(xiàn)出一定的濃度-時(shí)間-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明AE對(duì)斑馬魚(yú)移植瘤的增殖和轉(zhuǎn)移具有抑制作用。本研究表明，AE具有開(kāi)發(fā)成抗宮頸癌藥物的潛能，同時(shí)斑馬魚(yú)移植瘤模型也可以成為宮頸癌研究和藥物評(píng)價(jià)的重要模型。

關(guān)鍵詞：蘆薈大黃素；斑馬魚(yú)；宮頸癌細(xì)胞；SiHa；移植瘤模型

蘆薈大黃素(Aloe emodin，AE)是蘆薈和大黃的重要有效成分，是一種蒽醌衍生物的單體化合物，化學(xué)名稱(chēng)為1，8-二羥基-3-羥甲基蒽醌，分子式為C15H10O5，分子質(zhì)量270.23，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)文獻(xiàn)[1]。AE具有多種藥理學(xué)作用，如抗菌、免疫抑制、瀉下和降脂減肥等，同時(shí)藥理研究發(fā)現(xiàn)，大黃蒽醌衍生物、大黃酸、大黃素和AE均有明顯的抗癌作用，能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，抗腫瘤活性明顯[2-4]。

AE能抑制白血病細(xì)胞HL-60的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞、人舌鱗癌細(xì)胞和人肺癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制涉及PKC的激活及caspase的活化[4-6]。但AE對(duì)宮頸癌增殖和轉(zhuǎn)移的影響，尚缺乏深入研究。

斑馬魚(yú)是近年來(lái)藥物篩選和安全評(píng)價(jià)普遍使用的新型模式生物，其在基因水平上與人類(lèi)具有87%的同源性，而且具有繁殖周期短、胚胎透明易于觀察、遺傳操作簡(jiǎn)單以及飼養(yǎng)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，很快成為分子發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科的模式生物[6-8]。近幾年斑馬魚(yú)移植瘤動(dòng)物模型在國(guó)際藥理學(xué)研究領(lǐng)域迅速興起，在腫瘤增殖和遷移機(jī)制的研究方面成為廣泛接受的模型[9-12]。本文以斑馬魚(yú)為動(dòng)物載體，建立斑馬魚(yú)移植瘤模型，并研究了AE對(duì)SiHa細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1實(shí)驗(yàn)材料

人宮頸癌細(xì)胞SiHa，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃和CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為AB野生型斑馬魚(yú)品系，魚(yú)種由山東省科學(xué)院斑馬魚(yú)藥物篩選平臺(tái)保存。斑馬魚(yú)在14 h光照/10 h黑暗的光周期、28 ℃ 的條件下培養(yǎng)。采卵時(shí)，取健康性成熟的斑馬魚(yú)按♀:♂=1: 1的比例放入交配缸內(nèi)，次日9～10 h獲取受精卵。對(duì)受精卵進(jìn)行消毒和洗滌后，移入斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)用水(含5.0 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4)中，置于28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.3藥品和儀器

DMEM培養(yǎng)基、新鮮胎牛血清和質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素鈉與鏈霉素購(gòu)自上海生工生物科技有限公司；麻醉劑三卡因、噻唑藍(lán)(MTT)和DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；脫膜劑Pronase E購(gòu)自Solarbio公司；CM DiL活細(xì)胞染色劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；微量注射儀購(gòu)自力鈞生物科技有限公司；激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000)購(gòu)自日本Olympus公司；無(wú)菌操作臺(tái)SWCJ2購(gòu)自蘇州Airtech公司；5840R離心機(jī)購(gòu)自Eppendof公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀為美國(guó)Biotek產(chǎn)品；體視熒光顯微鏡購(gòu)自重慶光學(xué)儀器公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的胰蛋白酶消化SiHa細(xì)胞，用含100 ml/L胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度5×104cells/mL，每孔100 μL接種于96孔板，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸盡培養(yǎng)基，每孔依次加入100 μL對(duì)照和AE樣品(終濃度分別為0.5、1、2.5、5、10 μg/mL)，每個(gè)劑量設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次，加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃ 繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，搖床振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，波長(zhǎng)為490 nm。測(cè)定各孔的吸光度值(A值)，按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率(IR)=(1-用藥組A值/對(duì)照組A值)×100%，并以每個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，以時(shí)間為橫軸，抑制率為縱軸繪制生長(zhǎng)抑制曲線。

2.2顯微注射

2.2.1斑馬魚(yú)胚胎的獲得

當(dāng)受精卵發(fā)育至24 h，使用1 mg/mL的Pronase E溶液脫去卵膜。在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎，備用。無(wú)菌條件下將培養(yǎng)瓶中SiHa細(xì)胞除去培養(yǎng)基，PBS清洗2次后，加入質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的胰蛋白酶消化，然后加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心后換新的培養(yǎng)基，每毫升細(xì)胞懸液加入活細(xì)胞染色劑CM DiL 10 μL，37 ℃孵育5 min，然后在冰箱4 ℃孵育15 min，1 500 g離心5 min后去除上清液，PBS清洗2次后，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鏡下調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)到1×107cells/mL。

2.2.2微量注射

微量注射條件參照文獻(xiàn)[13]，選用新配制的質(zhì)量濃度為0.3 μg/mL的苯硫脲(抑制色素形成)孵育48 hpf的斑馬魚(yú)胚胎準(zhǔn)備微量注射，用質(zhì)量濃度為200 μg/mL的三卡因輕度麻醉，放置在體視顯微鏡下，用上述調(diào)整好濃度的SiHa細(xì)胞進(jìn)行注射。

6 h后將死亡斑馬魚(yú)吸出，隨機(jī)分為對(duì)照組與用藥組(0.25、0.5、1 μg/mL AE)，每組不少于10條。分別處理48 h后，將幼魚(yú)麻醉后在激光掃描共聚焦顯微鏡下拍照。

2.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

移植瘤遷移評(píng)價(jià)方法參照文獻(xiàn)[13-14]，以斑馬魚(yú)卵黃囊注射點(diǎn)為原點(diǎn)，按照周邊移植瘤劃出最遠(yuǎn)遷移直線距離，利用Image J軟件測(cè)量腫瘤遷移最遠(yuǎn)距離和面積，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。各組幼魚(yú)逐條檢測(cè)剔除失敗樣本。

2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求均值，并進(jìn)行樣本均數(shù)間多重比較。

3結(jié)果及分析

圖1　AE對(duì)SiHa細(xì)胞增殖的影響Fig.1　Anti-proliferative effect of AE on SiHa

3.1AE對(duì)人宮頸癌細(xì)胞SiHa增殖的影響

MTT法檢測(cè)AE對(duì)人宮頸癌細(xì)胞SiHa的生長(zhǎng)抑制作用，從圖1可見(jiàn)，AE對(duì)SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨濃度和作用時(shí)間的增加而呈明顯上升趨勢(shì)，表現(xiàn)出一定的濃度-時(shí)間-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。同時(shí)，可以看出在濃度5 μg/mL時(shí)抑制效率明顯增強(qiáng)，當(dāng)濃度加倍至10 μg/mL時(shí)，抑制作用加強(qiáng)，但并未表明加倍。因此，可以選擇5 μg/mL的AE作為參考濃度值。

3.2AE對(duì)斑馬魚(yú)移植瘤的影響

3.2.1人宮頸癌細(xì)胞SiHa斑馬魚(yú)移植瘤模型的特點(diǎn)

人宮頸癌細(xì)胞SiHa經(jīng)CM Dil染色后，每個(gè)斑馬魚(yú)胚胎注射約200個(gè)腫瘤細(xì)胞，然后熒光顯微鏡下挑選注射部位和細(xì)胞數(shù)量一致的斑馬魚(yú)進(jìn)行藥物處理。48 h以后細(xì)胞主要集中于卵黃部并向卵黃延伸部生長(zhǎng)和遷移(圖2)。

3.2.2AE抑制斑馬魚(yú)移植瘤的增殖和轉(zhuǎn)移

模型組在藥物處理48 h后，激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)SiHa紅色腫瘤細(xì)胞在胚胎中的分布，較集中于卵黃部、卵黃延伸部。用藥組(0.5、1 μg/mL)與對(duì)照組相比較，紅色腫瘤灶面積減少(圖3)，而且最大遷移距離也減小(圖4)(P<0.05)。說(shuō)明蘆薈大黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移有抑制作用。

A 對(duì)照組；B 0.25 μg/mL AE；C 0.5 μg/mL AE；D 1 μg/mL AE圖2　斑馬魚(yú)移植瘤模型的構(gòu)建與藥物AE處理Fig.2　Establishment of zebrafish xenograft model and drug AE treatment

與對(duì)照組相比，*P<0.05圖3　AE處理對(duì)斑馬魚(yú)移植瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.3Anti-proliferative effect of AE treatment on SiHa in zebrafish xenograft model

與對(duì)照組相比，*P<0.05。圖4　AE處理對(duì)斑馬魚(yú)移植瘤細(xì)胞遷移的影響Fig.4Anti-migration effect of AE treatment on SiHa in zebrafish xenograft model

4討論

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是女性第二大常見(jiàn)惡性腫瘤。全世界每年約有50萬(wàn)新發(fā)病例，25萬(wàn)人死亡，其中大部分發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，中國(guó)宮頸癌的發(fā)病率世界第一，每年新發(fā)病例接近13萬(wàn)。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。人子宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa，該細(xì)胞系建自一個(gè)日本病人的外科手術(shù)的原位組織樣品。電鏡觀察表明在細(xì)胞連接處有典型的橋粒，在胞質(zhì)中有豐富的張力絲。在裸鼠中，此細(xì)胞能形成低分化的表皮樣癌(三級(jí))，癌蛋白PRB和P53呈陽(yáng)性[15]。

我國(guó)具有豐富的中藥資源，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的先進(jìn)技術(shù)，研究中藥成分的藥理學(xué)作用和相關(guān)的分子、細(xì)胞機(jī)制，能夠?yàn)橹兴帉W(xué)的發(fā)展和進(jìn)步提供更多的支持。大黃是具有全球影響的十幾種傳統(tǒng)藥物之一，對(duì)大黃有效成分特別是蒽醌類(lèi)化合物的藥理作用研究應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)。AE能抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231體外侵襲能力，其作用機(jī)制可能與下調(diào)FAK的表達(dá)和減少M(fèi)MP-9的分泌有關(guān)[16]，但其在宮頸癌方面的研究尚需要進(jìn)一步深入。目前，斑馬魚(yú)作為模式動(dòng)物，越來(lái)越多地用于腫瘤相關(guān)基因功能的研究和抗腫瘤藥物的篩選研究。小鼠/大鼠模型仍然是最經(jīng)典的動(dòng)物疾病模型，但是其成本高、周期長(zhǎng)且操作繁瑣。斑馬魚(yú)移植腫瘤模型具有成本較低、實(shí)驗(yàn)周期短(4～6 d)，受精后1周內(nèi)無(wú)明顯免疫系統(tǒng)排異反應(yīng)，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞清晰可見(jiàn)等優(yōu)點(diǎn)[17-19]。因此，本研究利用斑馬魚(yú)作為動(dòng)物模型研究AE對(duì)人宮頸癌SiHa細(xì)胞的抑制作用。

本研究通過(guò)MTT法檢測(cè)AE對(duì)人宮頸癌細(xì)胞SiHa的抑制作用，結(jié)果顯示AE對(duì)SiHa細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且生長(zhǎng)抑制率隨濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的濃度-時(shí)間-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。同時(shí)我們建立了宮頸癌斑馬魚(yú)移植瘤模型，利用該模型，我們發(fā)現(xiàn)1.0、0.5 μg/mL的AE對(duì)斑馬魚(yú)移植瘤具有抑制作用，腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移能力明顯降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AE具有開(kāi)發(fā)成抗宮頸癌藥物的潛能，同時(shí)斑馬魚(yú)移植瘤模型也可以成為宮頸腫瘤研究和藥物評(píng)價(jià)的重要模型。

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Inhibitory effect of aloe emodine on cervical cancer cell line SiHa with zebrafish xenograft model

WANG Rong-chun，HAN Li-wen，CHEN Xi-qiang，HE Qiu-xia，WANG Xi-min，PENG Wei-bing，SUN Chen，HAN Jian，LIU Ke-chun*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors, Biology Institute,Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶We employ MTT to investigate inhibitory effect of different concentrations of aloe emodin (AE) on the proliferation of cervical cancer cell SiHa. We further establish zebrafish xenograft model by injecting SiHa into the yolk sac of 48 hpf zebrafish. The zebrafish is then treated with different concentrations of AE to investigate proliferation and migration of cancer cell in zebrafish. Results show that growth inhibition rate of AE on SiHa significantly increases with the increase of AE concentration and action time, a certain concentration-time-effect dependence. In vivo experiment shows that AE has inhibitory effect on the proliferation and metastasis of zebrafish xenograft. Our research indicates that AE has the potential of cervical anticancer drug. The zebrafish xenograft model can also be an important model of cervical cancer research and its drug assessment.

Key words∶ aloe emodine; zebrafish; cervical cancer cell; SiHa; xenograft model

中圖分類(lèi)號(hào)：R965.1;R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-4026(2016)02-0014-05

作者簡(jiǎn)介：王榮春(1983-)，男，博士，研究方向?yàn)槟[瘤生物學(xué)。1wangrongchun@163.com*通訊作者，劉可春(1964-)，男，博士，研究方向?yàn)樗幬锖Y選。Email:hliukch@sdas.org

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31400979)；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專(zhuān)項(xiàng)(2014ZZCX02105)；山東省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(2015GSF121021)

收稿日期：2016-02-04

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.02.004