李瑞茜　于丹　余仲東　曹支敏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

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落葉松-楊柵銹菌MKK基因的克隆與生物信息學(xué)分析1)

李瑞茜于丹余仲東曹支敏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

摘要利用同源克隆技術(shù)，從落葉松-楊柵銹菌(Melampsora larici-populina Kleb.)菌株Wh03中克隆得到釀酒酵母MKK1和MKK2的同源基因，命名為MlpMKK1/2-WH。測(cè)序結(jié)果顯示，MlpMKK1/2-WH基因的開放閱讀框長(zhǎng)度為1 218 bp，編碼405個(gè)氨基酸。MlpMKK1/2-WH蛋白具有保守的PKc_Pek1_like和Pkinase結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,MlpMKK1/2-WH與柄銹菌屬3種銹菌中的同源蛋白親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞落葉松-楊柵銹菌；MKK基因；同源克??；生物信息

分類號(hào)S718.81；S763.11

Cloning and Bioinformatical Analysis of MKK Gene fromMelampsoralarici-populina//

Li Ruixi, Yu Dan, Yu Zhongdong, Cao Zhimin

(Northwest A & F University, Yangling 712100, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(5)：84-87.

By using homology-based cloning method, the geneMlpMKK1/2-WH was cloned and sequenced fromMelampsoralarici-populina(Mlp) Chinese strain Wh03. The full-length ORF ofMlpMKK1/2-WH was 1 218 bp, encoding 405 amino acid residues. The deducedMlpMKK1/2-WH protein contains conserved PKc_Pek1_like and Pkinase domains. By phylogenetic analysis, MlpMKK1/2-WH had the closest relationship with the othologs from three rust fungi belonging to the genusPuccinia.

KeywordsMelampsora larici-populina； MKK gene； Homology cloning； Bioinformatical analysis

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑在適應(yīng)環(huán)境脅迫和形態(tài)調(diào)節(jié)方面具有重要的作用[1]。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有關(guān)鍵作用的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑在真核生物中普遍存在，一般包括依次被磷酸化而激活的3個(gè)相互關(guān)聯(lián)的蛋白激酶[2-3]，分別為絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK或MEKK)、絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK或MEK)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)。模式物種釀酒酵母中MAPK信號(hào)途徑研究的較為深入和全面，主要包含Kss1/Fus3類、Kss1類、Slt2類、Hog1類和Smk1類5種MAPK途徑[4]。其中，Bck1-MKK1/MKK2-Slt2類MAPK途徑調(diào)控釀酒酵母細(xì)胞壁完整性并促進(jìn)其細(xì)胞壁的生物合成[5]。在釀酒酵母中，任何一個(gè)MKK基因的缺失都沒(méi)有產(chǎn)生明顯的表型缺陷，而MKK1和MKK2基因同時(shí)缺失卻引起一種對(duì)溫度敏感但可被滲透壓穩(wěn)定劑抑制的細(xì)胞裂解缺陷[6]。研究表明，玉米黑粉病菌MKK1基因比較保守，參與了該物種細(xì)胞壁完整性的調(diào)控[7]。人類病原新型隱球菌MKK1基因是溫度敏感型相關(guān)基因，也在維持細(xì)胞壁完整性方面具有重要作用，同時(shí)該基因的缺失會(huì)導(dǎo)致病原菌黑色素產(chǎn)量的下降[8]。落葉松-楊柵銹菌是一種轉(zhuǎn)主寄生真菌，在世界范圍內(nèi)引起楊樹葉銹病，嚴(yán)重危害楊樹生產(chǎn)，從而造成重大經(jīng)濟(jì)損失[9-10]。本研究根據(jù)落葉松-楊柵銹菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中預(yù)測(cè)的MKK1和MKK2同源基因MKK1/2，同源克隆菌株Wh03中MKK1/2基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步明確目的基因在落葉松-楊柵銹菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過(guò)程中的作用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試驗(yàn)用Wh03(陜西渭河)為我國(guó)落葉松-楊柵銹菌單孢菌株，由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。用太白楊(Populuspurdomii)作為繁殖寄主在溫室人工擴(kuò)繁，參照曹支敏等的方法[11]進(jìn)行菌種活化及保存。

引物由上海生工合成，總RNA提取試劑盒來(lái)自QIAGEN公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq酶來(lái)自Thermo公司，TransStartFastPfu酶來(lái)自全式金公司，pMD19-T(simple)載體來(lái)自TAKARA公司，膠回收試劑盒來(lái)自Bioflux公司，測(cè)序由北京奧科公司完成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

落葉松-楊柵銹菌夏孢子總RNA提取參考QIAGEN公司Rneasy Plant Mini Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，分別用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量和濃度。參考Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2目的基因片段的克隆及測(cè)序

根據(jù)落葉松-楊柵銹菌標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.jgi.doe.gov/Mellp1/Mellp1.home.html)中Protein ID 38429基因序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，從該銹菌中國(guó)菌株Wh03夏孢子cDNA中PCR擴(kuò)增目的基因。

上游引物，MKK-F(5′ATGAATGGGATCGGAGGAAG3′)；下游引物，MKK-R(5′CTAAGAAGTAGTAGTAGTAGTAGA 3′)。用TransStartFastPfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系，5×TransStartFastPfuBuffer 10 μL、2.5 mmol·L-1dNTP 5 μL、引物各1 μL、模板(稀釋5倍)1.5 μL、TransStartFastPfu酶1 μL、加水補(bǔ)齊至50 μL。PCR擴(kuò)增條件，95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性20 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸38 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃保存。在PCR產(chǎn)物中加入0.6 μLTaq酶，72 ℃延伸30 min。

PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Bioflux)回收目的條帶。將回收產(chǎn)物連接至pMD19-T(simple)載體，利用電擊法轉(zhuǎn)化將重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子送至北京奧科公司測(cè)序。

1.2.3編碼蛋白生物信息學(xué)

利用Bioedit軟件推導(dǎo)氨基酸序列；利用ExPASy網(wǎng)站在線工具ProtParam分析氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量、殘基數(shù)目與組成、等電點(diǎn)和穩(wěn)定性等信息；利用NCBI網(wǎng)站Conserved domains數(shù)據(jù)庫(kù)分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；基因編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由SOPMA在線工具進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用Clustalx軟件對(duì)同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)，MEGA6分子進(jìn)化遺傳分析軟件通過(guò)鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹每個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以自展法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1 000次[12]。

2結(jié)果與分析

2.1目的基因克隆

利用釀酒酵母MKK1和MKK2的蛋白序列為誘餌，在落葉松-楊柵銹菌標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31和釀酒酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株S288c全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析，得到落葉松-楊柵銹菌標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31中的同源基因MKK1/2(Protein ID 38429)。提取落葉松-楊柵銹菌中國(guó)菌株Wh03夏孢子總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA為模板，根據(jù)38429基因序列設(shè)計(jì)特異引物，從中國(guó)菌株夏孢子cDNA中進(jìn)行同源克隆。

通過(guò)PCR擴(kuò)增，得到1條與預(yù)測(cè)結(jié)果較為一致的大約1 250 bp的條帶(圖1)。切膠回收目的條帶，TA克隆測(cè)序并進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示，該cDNA片段具有完整開放閱讀框(ORF)，長(zhǎng)度為1 218 bp，編碼405個(gè)氨基酸。因此，將落葉松-楊柵銹菌中國(guó)菌株中克隆獲得的該基因命名為MlpMKK1/2-WH。

M1.1kb ladder；M2.DS 2000；MKK1/2.落葉松-楊柵銹菌中國(guó)菌株MKK1/2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1落葉松-楊柵銹菌中國(guó)菌株MKK1/2基因PCR擴(kuò)增

2.2目的基因預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)

MlpMKK1/2-WH基因ORF序列及其推導(dǎo)的蛋白序列如圖2所示。預(yù)測(cè)的MlpMKK1/2-WH蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為44 810，親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.426，說(shuō)明它為親水性蛋白。預(yù)測(cè)蛋白負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)為50個(gè)，正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)41個(gè)。理論等電點(diǎn)為5.66，即偏酸性。預(yù)測(cè)蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為41.53，超過(guò)40，推測(cè)MlpMKK1/2-WH蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。利用NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(kù)分析MlpMKK1/2-WH蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白具有與釀酒酵母MKK1及MKK2蛋白一致的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為PKc_Pek1_like和Pkinase(圖3)。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)分子中重要的部件，用SOPMA軟件對(duì)MlpMKK1/2-WH蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，其包含33.09%的α-螺旋，9.88%的β-轉(zhuǎn)角，40.99%的無(wú)規(guī)則卷曲，16.05%的延伸鏈(圖4)。據(jù)此推測(cè)，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成了MlpMKK1/2-WH蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，無(wú)規(guī)則卷曲散布于整個(gè)蛋白中。

2.3目的基因進(jìn)化關(guān)系

利用NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和BROAD蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢索，將克隆得到的落葉松-楊柵銹菌MlpMKK1/2-WH蛋白序列與釀酒酵母、白色念珠菌、稻瘟菌、小麥赤霉菌、灰霉菌、雙色蠟?zāi)?、玉米黑粉菌、小麥條銹菌、小麥稈銹菌、小麥葉銹菌等模式物種MKK1和MKK2同源基因的蛋白序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示，子囊菌中的MKK1和MKK2聚為一類，擔(dān)子菌中的MKK1和MKK2歸為另一大類。MlpMKK1/2-WH與柄銹菌屬3種銹菌中的同源蛋白親緣關(guān)系最近，這與分類學(xué)中上述真菌同屬于銹菌目相一致。

圖2　MlpMKK1/2-WH基因ORF核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列(“*”代表終止子)

圖3　MlpMKK1/2-WH基因氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域

圖4　MlpMKK1/2-WH基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成

圖5　落葉松-楊柵銹菌MlpMKK1/2-WH系統(tǒng)進(jìn)化樹

3結(jié)論與討論

Bck1-MKK1/MKK2-Slt2信號(hào)通路在真菌中具有高度保守性。其中，起到承上啟下作用的絲裂原活化蛋白激酶激酶MKK1/MKK2參與了真菌細(xì)胞壁完整性和致病性等方面的調(diào)控過(guò)程，尤其在維持細(xì)胞壁完整性方面具有重要作用[6-8]。由專性寄生的落葉松-楊柵銹菌侵染引起的楊樹葉銹病是一種嚴(yán)重危害楊樹生產(chǎn)的世界性重大真菌病害。目前，該銹菌MKK1/MKK2基因的功能尚不清楚。筆者首次克隆到落葉松-楊柵銹菌中國(guó)菌株MKK1/MKK2同源基因，命名為MlpMKK1/2-WH，該基因開放閱讀框長(zhǎng)度為1 218 bp，生物信息學(xué)分析顯示該蛋白具有保守的結(jié)構(gòu)域，親緣關(guān)系與柄銹菌屬3種銹菌最近，從而為闡明目的基因在該銹菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過(guò)程中的作用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

以釀酒酵母MKK1和MKK2蛋白序列為誘餌進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，MKK1和MKK2在落葉松-楊柵銹菌標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31中的同源基因相同(Protein ID 38429)。因此，將該基因命名為MlpMKK1/2。根據(jù)落葉松-楊柵銹菌標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31中MlpMKK1/2的基因序列，同源克隆得到該銹菌中國(guó)菌株Wh03中的同源基因，因此，命名為MlpMKK1/2-WH。

供試中國(guó)菌株MlpMKK1/2-WH基因和標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31中的同源基因MlpMKK1/2(Protein ID 38429)的核苷酸序列的同源性達(dá)到99%，在7個(gè)位點(diǎn)上存在堿基的差異，并且前者堿基數(shù)量較后者多3個(gè)。氨基酸水平上，二者的同源性也達(dá)到99%，由于堿基數(shù)量的增加，前者比后者多1個(gè)蘇氨酸。這說(shuō)明在來(lái)自中國(guó)和歐洲的2個(gè)Mlp菌株中，該基因氨基酸序列變異較小，較為保守。

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，在進(jìn)化過(guò)程中釀酒酵母和白色念珠菌物種內(nèi)部發(fā)生復(fù)制；而所列的另外3種絲狀子囊菌及擔(dān)子菌中未發(fā)生復(fù)制，因此含有1個(gè)同源基因MKK1/2。

MlpMKK1/2-WH基因的成功克隆是研究其功能的基礎(chǔ)。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示該基因具有與釀酒酵母MKK1及MKK2蛋白一致的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。因此，該基因在落葉松-楊柵銹菌細(xì)胞壁完整性調(diào)控和致病過(guò)程方面是否具有保守的功能，還有待于進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]GUSTIN M C, ALBERTYN J, ALEXANDER M, et al. MAP kinase pathways in the yeastSaccharomycescerevisiae[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,1998,62(4):1264-1300.

[2]MAPK Group. Mitogen-activated protein kinase cascades in plants: a new nomenclature[J]. TRENDS in Plant Science,2002,7(7):301-308.

[3]WIDMANN C, GIBSON S, JARPE M B, et al. Mitogen-activated protein kinase: conservation of a three-kinase module from yeast to human[J]. Physiological Reviews,1999,79(1):143-180.

[4]HAMEL L P, NICOLE M C, DUPLESSIS S, et al. Mitogen-activated protein kinase signaling in plant-interacting fungi: distinct messages from conserved messengers[J]. The Plant Cell,2012,24(4):1327-1351.

[5]HEINISCH J J. Baker’s yeast as a tool for the development of antifungal kinase inhibitors-targeting protein kinase C and the cell integrity pathway[J]. Biochimica et Biophysica Acta,2005,1754(1/2):171-182.

[6]IRIE K, TAKASE M, LEVIN D E, et al.MKK1 andMKK2, which encodeSaccharomycescerevisiaemitogen-activated protein kinase-kinase homologs, function in the pathway mediated by protein kinase C[J]. Molecular and Cellular Biology,1993,13(5):3076-3083.

[8]GERIK K J, DONLIN M J, SOTO C E, et al. Cell wall integrity is dependent on thePKC1 signal transduction pathway inCryptococcusneoformans[J]. Molecular Microbiology,2005,58(2):393-408.

[9]張山林.青楊葉銹病損失量估計(jì)研究[J].甘肅林業(yè)科技,1990(2):29-33.

[10]STEENACKERS J, STEENACKERS M, STEENACKERS V, et al. Poplar diseases, consequences on growth and wood quality[J]. Biomass and Bioenergy,1996,10(5/6):267-274.

[11]曹支敏,李振岐,胡景江.落葉松-楊柵銹菌生理分化研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),1998,13(1):53-57.

[12]KUMAR S, TAMURA K, NEI M. MEGA: Molecular evolutionary genetics analysis software for microcomputers[J]. CABIOS,1994,10(2):189-191.

收稿日期：2015年11月1日。

第一作者簡(jiǎn)介：李瑞茜，女，1990年3月生，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail：lrx327@outlook.com。通信作者：曹支敏，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：zmcao@nwsuaf.edu.cn。

1)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31300544)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(QN2013014；2452015332)。

責(zé)任編輯：程紅。