何云鳳,郭晉霞，范　開

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶　400054;2.重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶　400050)

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重組精氨酸脫亞胺酶的制備工藝

何云鳳1,郭晉霞1，范開2

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶400054;2.重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶400050)

摘要：研究了重組精氨酸脫亞胺酶(rADIES)的30 L規(guī)模發(fā)酵、制備工藝及其生物學(xué)活性。將構(gòu)建好的工程菌先進(jìn)行搖瓶活化獲得種子液，轉(zhuǎn)入30 L發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行高壓勻漿破菌、包涵體洗滌、溶解稀釋復(fù)性后經(jīng)DEAE陰離子交換層析柱和Butyl疏水層析柱純化；通過SDS-PAGE和RP-HPLC等方法檢測(cè)表達(dá)和純度；用體外測(cè)活法檢測(cè)活性。將工程菌進(jìn)行放大培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了相對(duì)分子質(zhì)量在46 kDa的rADIES。重組蛋白表達(dá)量占總蛋白的25%以上，經(jīng)制備工藝獲得的rADIES純度高于95%，酶活性為42 IU。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該工藝具有可行性，可以獲得較高活性的重組精氨酸脫亞胺酶。

關(guān)鍵詞：精氨酸脫亞胺酶；發(fā)酵；復(fù)性；分離純化

精氨酸脫亞胺酶(rginine deiminase,ADI，EC3.5.3.6)是一種可以將L-精氨酸不可逆分解為L(zhǎng)-瓜氨酸和氨的酶[1]，最先在支原體Mycoplasmaarginini中發(fā)現(xiàn)。目前研究得最多、最深入的也是來源于支原體的ADI，此后，在其他細(xì)菌和少數(shù)低等真核生物中也有發(fā)現(xiàn)[2]。研究證實(shí)，ADI可以抑制很多精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型腫瘤細(xì)胞(如肝細(xì)胞癌、黑色素瘤細(xì)胞、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞癌等)的生長(zhǎng)，而對(duì)正常人體細(xì)胞沒有影響[3-4]。其抑制機(jī)制主要包括兩方面：其一是降低血清中的精氨酸，正常細(xì)胞和組織中存在精氨酸琥珀酸合成酶(ASS) 和精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)兩種酶，經(jīng)尿素循環(huán)可以自身合成精氨酸，而精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型腫瘤細(xì)胞自身不能表達(dá)ASS，必須從血液中獲得精氨酸合成自身需要的蛋白質(zhì)，ADI一旦降解血清中的精氨酸，最終將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[5-6]；其二是可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的合成，減少腫瘤新生血管的生成[7]。因此，ADI具有開發(fā)成抗腫瘤藥的潛力。

目前在制備ADI時(shí)主要從支原體中提取[8]或采取基因工程方法在大腸桿菌中表達(dá)和制備[9-12]。美國(guó)polaris公司正在制備的臨床II-III期抗腫瘤的PEG化ADI(PEG-ADI20)是兩個(gè)突變的支原體ADI(ADIES)。本研究主要探討該突變ADI(ADIES)放大制備工藝和活性，為進(jìn)一步進(jìn)行PEG修飾和臨床研究并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

攜帶有質(zhì)粒pET-ADIES的BL21工程菌種(pET-ADIES/ BL21)為重慶派金生物科技有限公司構(gòu)建保存；中分子蛋白標(biāo)準(zhǔn)來自TIANGEN公司；Bio-Rad Universal 電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad；TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自北京普析；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自日本日立；DEAE Sepharose Fast Flow和Butyl Sepharose 4 Fast Flow層析填料(General Electric Company)；TSK-GEL G3000SWxL Column購(gòu)自TOSOH公司；Waters Symmetry 300 C18購(gòu)自沃特世公司；Superdex 100 Column (General Electric Company)；Agillent 1200 型高效液相色譜儀(Agilent Technologies)；LB培養(yǎng)基和M9-YT培養(yǎng)基均參照Novagen公司pET操作手冊(cè)配置；其余化學(xué)試劑均為常規(guī)試劑。

1.2方法

1.2.1重組ADIES的表達(dá)

將工程菌種(pET-ADIES/ BL21)從-80 ℃冰箱中取出迅速融化，接種于250 mL/瓶含氨芐青霉素100 μg/mL LB培養(yǎng)基中，共接種4瓶。于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)過夜，直至OD值達(dá)到1左右即可獲得種子液。將2 L種子液全部接入18 L M9-YT培養(yǎng)基開始發(fā)酵，pH值維持在7.0左右，通氣量維持在10 L/min。加入種子液后pH值和溶氧開始下降，待培養(yǎng)基中葡萄糖消耗完畢后溶氧瞬間升至最高點(diǎn)，pH值開始上升，此時(shí)流加補(bǔ)料。流加補(bǔ)料1.5 h后OD值達(dá)10左右，加入終濃度為1 mmol/L的 IPTG開始誘導(dǎo)。此時(shí)停止加補(bǔ)料，0.5 h后開始流加補(bǔ)料(溶氧維持在40%)，誘導(dǎo)4 h后下罐，離心收集菌體。將收集的菌體留樣通過SDS-PAGE分析檢測(cè)表達(dá)量，其余菌體凍存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2重組ADIES高壓勻漿破菌

按1∶10(m/V)的比例將菌體溶于破菌緩沖液(50 mmol/L PB、pH值為8.0的1 mmol/L EDTA)中以200～300 r/min室溫?cái)嚢杈鶆蚝?，?0，40，70 MPa壓力條件下各循環(huán)1次進(jìn)行低溫高壓勻漿。采用顯微鏡觀察破菌效果，當(dāng)破菌率達(dá)95%以上即可用高速冷凍離心機(jī)在8 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，收集沉淀。

1.2.3重組ADIES包涵體的洗滌

本研究采用高壓勻漿破菌法破菌后分別按照以下洗滌方式各洗滌一次。洗滌緩沖方式1：50 mmol/L PB、1mmol/L EDTA、1%Triton X-100、pH值為8.0；洗滌緩沖方式2：50 mmol/L PB、1 mmol/L DTT、2 mol/L Urea、0.15 mol/L NaCL 、pH值為8.0；洗滌緩沖方式3：50 mmol/L PB、1 mmol/L DTT、pH值為8.0。按以上條件洗滌后經(jīng)高速冷凍離心機(jī)在 8 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，收集沉淀。

1.2.4包涵體變性溶解及復(fù)性

按照1∶10(m/V)的比例將包涵體沉淀溶解于變性溶解緩沖液(20 mmol/L PB、6 mol/L鹽酸胍、10 mmol/L DTT、pH值為8.0)中。磁力攪拌(300 r/min)助溶過夜。高速冷凍離心機(jī)8 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，棄沉淀收集上清。采用稀釋復(fù)性法復(fù)性，按照1∶20 (V/V)的比例將收集的上清液稀釋到復(fù)性液(50 mmol/L PB、0.1% PEG4000、20 mmol/L NaCL、pH值為7.0)中，并于4℃復(fù)性48 h。

1.2.5重組ADIES蛋白純化

1) DEAE柱純化。填裝DEAE Sepharose Fast Flow填料500 mL，按照常規(guī)方法清洗柱子。用平衡液(20 mmol/L PB、pH值為7.0)平衡2～3個(gè)柱體積，蠕動(dòng)泵50 r/min快速上樣，在用平衡液進(jìn)行復(fù)平衡2～3個(gè)柱體積后，改用洗脫液1 (20 mmol/L PB、0.1 mol/L NaCL、pH值為7.0)沖洗雜蛋白，用洗脫液2(20 mmol/L PB、0.3 mol/L NaCl、pH值為7.0)洗脫目的蛋白。

2) Butyl柱純化。填裝Butyl Sepharose 4 Fast Flow填料400 mL，常規(guī)方法清洗柱子。用平衡緩沖(20 mmol/L PB、2 mol/L NaCL、pH值為7.0)平衡2～3個(gè)柱體積后，將DEAE洗脫目的蛋白樣補(bǔ)加終濃度為2 mol/L NaCl后上樣，平衡緩沖(20 mmol/L PB、2 mol/L NaCL、pH值為7.0)進(jìn)行復(fù)平衡2～3個(gè)柱體積至電導(dǎo)平穩(wěn)為止，改用洗脫液1(20 mmol/L PB、0.5 mol/L NaCL、pH值為7.0)洗去雜蛋白，用洗脫液2(20 mmol/L PB、0.1 mol/L NaCL、pH值為7.0)收集目的蛋白。

1.2.6酶活性測(cè)定

1) L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。取1 mmol/L 的L-瓜氨酸溶液，用0.1 moL/L PB、pH值為7.0的緩沖液稀釋成0，50，100，150，200，250，300，350，400，450，500 μmol/L梯度溶液。

2) 樣品的處理：用0.1 mol/L PB分別稀釋成1 μg/mL和2 μg/mL溶液。在試管中加入上述稀釋好的溶液1 600 mL,用0.1 mol/L PB緩沖液200 μL 混勻。每個(gè)樣做1個(gè)平行復(fù)孔。放置于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min。加入0.1 mol/L精氨酸200 μL混勻，置37 ℃水浴鍋中精確反應(yīng)5 min，再于100 ℃金屬浴中停止反應(yīng)5 min，取出降至室溫。

3) 顯色：在標(biāo)準(zhǔn)曲線和處理后的樣品試管中依次加入3 mL混合酸-鐵溶液，混勻。再加入0.5 mL/管的顯色液混勻，立即放入100 ℃金屬浴中反應(yīng)10 min。每管平行操作20 s。反應(yīng)結(jié)束后取出在自來水中降至室溫，等待測(cè)定。

4) 活性測(cè)定：取150 μL反應(yīng)溶液于酶標(biāo)板內(nèi)，波長(zhǎng)490 nm測(cè)定其吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，繪制L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品比活性。

2結(jié)果與分析

2.1工程菌的發(fā)酵

本實(shí)驗(yàn)通過前期已構(gòu)建的工程菌種(Pet-ADIES/BL21)進(jìn)行30 L放大培養(yǎng)，收獲濕菌體550 g，成功實(shí)現(xiàn)了精氨酸脫亞胺酶以包涵體形式在大腸桿菌中高表達(dá)。從圖1可以看出：工程菌在放大培養(yǎng)過程中呈大腸桿菌的桿狀。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析可得目標(biāo)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為46 kDa，位置與理論值一致。通過凝膠成像掃描軟件分析，目標(biāo)蛋白占全菌蛋白的25%以上，如圖2所示。

圖1　誘導(dǎo)3 h后顯微鏡分析

1.未誘導(dǎo)全菌; 2.IPTG誘導(dǎo)1 h全菌; 3.IPTG誘導(dǎo)2 h全菌;

2.2高壓勻漿破菌

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，精氨酸脫亞胺酶菌體均采用超聲破菌，而在工業(yè)上這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并不能滿足工業(yè)需求。本研究初次采用效率較高的高壓勻漿法破菌，破菌率達(dá)95%以上。

2.3重組蛋白的純度檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)通過兩步柱純化，純化產(chǎn)物用SDS-PAGE和RP-HPLC方法分析純度， 用SEC-HPLC方法分析高分子含量。其中SDS-PAGE采用12%的分離膠，考馬斯亮藍(lán)染色，用凝膠成像系統(tǒng)分析。RP-HPLC分析條件：分析柱采用Waters Symmetry 300 C18柱，以含0.1%的三氟乙酸為流動(dòng)相A液，以95%的乙腈溶液為流動(dòng)相B液，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，流速1 mL/min，分析時(shí)間30 min。SDS-PAGE分析結(jié)果見圖3，RP-HPLC分析結(jié)果見圖4。主峰ADIES在C18柱上的保留時(shí)間為20.442 min，純度為99.6%。 SEC-HPLC分析條件：采用Superdex100柱子，以20 mmol/L PB、 pH值為7.0作為流動(dòng)相，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，分析時(shí)間30 min，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果如圖5所示，只出現(xiàn)目的條帶單峰，目的蛋白的保留時(shí)間為16.446 min，未檢測(cè)目的峰意外的其他峰。

1.DEAE柱洗脫主峰; 2.DEAE柱洗脫雜峰;

圖4　純化ADIES的PR-HPLC圖譜

圖5　純化ADIES的SEC-HPLC圖譜

2.4酶活性測(cè)定

酶活性定義：在最適反應(yīng)溫度為37 ℃、pH值為7.0條件下，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmoL L-瓜氨酸所需的酶量稱為一個(gè)國(guó)際單位(IU，又稱U)。

測(cè)活原理：精氨酸在精氨酸脫亞胺酶的作用下生成L-瓜氨酸，根據(jù)L-瓜氨酸在強(qiáng)酸性溶液中與二乙酰一肟的專一性顯色反應(yīng)及反應(yīng)復(fù)合物在490 nm處吸光度與L-瓜氨酸濃度呈線性梯度關(guān)系的特點(diǎn)，建立一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、靈敏的重組蛋白活性測(cè)定方法。

經(jīng)過純化后的ADIES樣品，采用本文所述的方法進(jìn)行測(cè)活。L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，依據(jù)該曲線繪制的線性方程為y=0.003 3x=0.007 5(x代表瓜氨酸濃度，y代表對(duì)應(yīng)OD值)，R2= 0.999 7，線性結(jié)果較為理想。待測(cè)活樣品按照本文所述方法進(jìn)行測(cè)活，代入公式計(jì)算，獲得的酶活性為42 IU。

圖6　L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3結(jié)束語

某些營(yíng)養(yǎng)缺陷型腫瘤細(xì)胞(如肝細(xì)胞癌、黑色素瘤細(xì)胞、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞癌等)的生長(zhǎng)對(duì)精氨酸具有依賴性，而正常細(xì)胞沒有這種依賴性，精氨酸脫亞胺酶通過降解體內(nèi)精氨酸達(dá)到治療腫瘤的目的[13]。

本研究前期，已構(gòu)建出表達(dá)目的蛋白的工程菌，通過30 L體系發(fā)酵培養(yǎng)，采取IPTG誘導(dǎo)方式獲得目標(biāo)蛋白的包涵體，可獲得約550 g的濕菌體。SDS-PAGE分析結(jié)果表明：目標(biāo)基因能夠在E.Coli中獲得高效表達(dá)，產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量在46 kDa左右，與理論分子量一致。由于重組ADIES蛋白是以包涵體的形式表達(dá)，在包涵體中除了含有目的ADIES蛋白外，仍含有大量宿主菌蛋白和核酸類雜質(zhì)。通過對(duì)包涵體進(jìn)一步洗滌提純，不僅能有效提高蛋白復(fù)性效率、降低純化工藝難度，而且能顯著提高目的蛋白回收率。本工藝每100 g濕菌菌體經(jīng)高壓勻漿法破菌后可獲得約25 g包涵體沉淀。包涵體經(jīng)洗滌后，每25 g可獲得10 g純度較高的包涵體沉淀。經(jīng)復(fù)性、DEAE Sepharose Fast Flow和Butyl Sepharose 4 Fast Flow等工藝流程，可獲得SDS-PAGE和RP-HPLC純度均不低于95%的目標(biāo)蛋白，每100 g可獲得1 g以上的重組精氨酸脫亞胺酶。經(jīng)過體外測(cè)活法進(jìn)行測(cè)活，測(cè)得的酶活性高達(dá)42 IU。

目前由美國(guó)polaris公司開發(fā)的聚乙二醇修飾精氨酸脫亞胺酶(ADI-PEG 20)正在進(jìn)行臨床3期的研究實(shí)驗(yàn)。這種酶是一種外源蛋白，用于人體會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫原性。目前普遍采用的方式是進(jìn)行PEG修飾，降低免疫原性和延長(zhǎng)半衰期[14]。本實(shí)驗(yàn)通過中試規(guī)模的制備放大研究，獲得了高純度高產(chǎn)量的精氨酸脫亞胺酶，為后期進(jìn)一步PEG修飾研究、藥理和藥效學(xué)研究等奠定了基礎(chǔ)，具有一定的實(shí)際應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯何杰玲)

Study of Preparation Technology of Recombinant Arginine Deiminase

HE Yun-feng1, GUO Jin-xia2, FAN Kai2

(1.College of Pharmacy and Biological Engineering, Chongqing University of Technology,Chongqing 400054, China; 2. Fagen Techenology Inc., Chongqing 400050, China)

Abstract:The 30 L scale fermentation, preparation technology and biological activities of recombinant arginine deiminase (rADI-ES) were investigated. The seed solution was obtained by shaking flask activation of the constructed engineering bacteria, and then transferred it to 30 L fermenter for enlarging cultivation, and IPTG was used for its induction expression. The expression products broke bacterium by high-pressure homogenizer, and inclusion bodies were washed by buffer, and after dissolved refolding, the product was purified with DEAE anion exchange chromatography and Butyl hydrophobic interaction chromatography column, and we detected its expression and purity by SDS-PAGE and RP-HPLC analysis. The activity of rADI-ES was determined in vitro. We successfully amplified and induced expression of the engineering bacteria, and obtained the rADIES with the molecular weight of 46 kDa. The expression quantity of recombinant protein counts about more than 25% total protein, and the purity of the purified rADI-ES is more than 95% and its enzymatic activity is 42 IU. The expeiment show that the process is feasible to obtain a higher purity and activity of recombinant arginine deiminase.

Key words:arginine deiminase; fermentation; refold; purification

文章編號(hào)：1674-8425(2016)04-0073-06

中圖分類號(hào)：Q3441.13

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.04.013

作者簡(jiǎn)介：何云鳳(1987—)，男，重慶云陽人，碩士研究生，主要從事基因工程制藥研究。

收稿日期：2016-01-11

引用格式：何云鳳,郭晉霞，范開.重組精氨酸脫亞胺酶的制備工藝[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2016(4):73-78.

Citation format：HE Yun-feng, GUO Jin-xia, FAN Kai.Study of Preparation Technology of Recombinant Arginine Deiminase[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2016(4):73-78.