毛久鳳， 夏　茜， 吳　鐳， 楊　紅， 周成菊， 方　藝， 董　強*

(1.貴州醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院 口腔修復學教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 口腔內(nèi)科， 貴州 貴陽　550004； 3.貴陽市口腔醫(yī)院， 貴州 貴陽　550004； 4.貴州醫(yī)科大學 病理學教研室， 貴州 貴陽　550004)

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不同表面處理方法對鈦表面成骨細胞膜片ALP活性的影響*

毛久鳳1**， 夏茜2， 吳鐳1， 楊紅3， 周成菊3， 方藝4， 董強1***

(1.貴州醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院 口腔修復學教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 口腔內(nèi)科， 貴州 貴陽550004； 3.貴陽市口腔醫(yī)院， 貴州 貴陽550004； 4.貴州醫(yī)科大學 病理學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討不同表面處理方法對鈦表面的成骨細胞膜片堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。方法： 原代培養(yǎng)大鼠成骨細胞，通過形態(tài)學及ALP鑒定成骨細胞；以機械拋光處理的鈦片為對照組，以棕剛玉顆粒噴砂材料處理的鈦片為噴砂酸蝕(SLA)組，分別構(gòu)建成骨細胞膜片，膜片連續(xù)培養(yǎng)1周或2周時，測量成骨細胞膜片中反映成骨效應的ALP活性的改變。結(jié)果： 原代培養(yǎng)細胞ALP陽性，經(jīng)形態(tài)及特性鑒定為成骨細胞；連續(xù)培養(yǎng)1周或2周時，SLA組ALP活性均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；各組膜片ALP活性第1周高于第2周，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論： 鈦表面性質(zhì)能夠影響成骨細胞膜片的成骨分化能力。

[關鍵詞]細胞膜片； 鈦； 表面處理； 堿性磷酸酶； 細胞培養(yǎng)； 大鼠，Sprague Dawley

目前，利用組織工程技術促進骨再生是口腔種植研究領域的熱點之一。細胞膜片技術(cell sheet technology，CST)作為組織工程技術的一種新方法，已應用于重建角膜、心肌、腎臟、血管、及骨等多種組織[1-3]。鈦及其合金已廣泛用于口腔種植領域，這些材料可以和骨組織之間形成直接接觸，即所謂的“骨整合”。鈦種植體的表面特性是影響骨整合的關鍵因素之一，粗糙鈦表面能誘導成骨細胞增殖，增加堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)活性，增強細胞的分化能力[4-5]。噴砂酸蝕(sand blasted,larged-grit,acid-etched,SLA)技術是鈦表面改性中較常用的方法，能使鈦表面成骨細胞的ALP活性以及培養(yǎng)液中的骨鈣素的含量增加。鈦表面性質(zhì)是否影響細胞膜片的成骨功能，目前尚不清楚。本實驗通過在機械拋光和SLA處理的鈦表面分別構(gòu)建成骨細胞膜片，觀察成骨細胞膜片中ALP的活性變化，初步研究成骨細胞膜片在不同鈦表面的成骨效應。

1材料方法

1.1主要試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone，美國)、胎牛血清(杭州四季青)、青鏈霉素(美國)、胰蛋白酶(HyClone，美國)、Ⅰ型膠原酶(Gibco，美國)、抗壞血酸(Solarbio，Sigma Ultra，美國)、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、離心機、倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)、24孔培養(yǎng)板(Corning-Costar，美國)、鈦片(西安泰金工業(yè)電化學技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1鈦片的制備采用二級工業(yè)純鈦片(厚1 mm，直徑15 mm)，用500、800及1 200號的金相砂紙打磨，使用丙酮清洗鈦片180 s。實驗分為對照組和SLA組。對照組采用機械拋光處理，噴砂酸蝕(SLA)組以棕剛玉顆粒為噴砂材料，120 v電壓作用于鈦表面，噴砂完成后，0.11 mol/L的氫氟酸和0.09 mol/L硝酸溶液室溫下作用10 min，超聲清洗。各組試件均用去離子水沖洗，依次經(jīng)丙酮、75%酒精、蒸餾水(dH2O)處理15 min，室溫干燥1 h高壓滅菌備用。

1.2.2成骨細胞培養(yǎng)和鑒定取新生24 h的 SD大鼠乳鼠顱骨，用含雙抗的預冷PBS洗3次，刮凈骨膜結(jié)締組織，剪碎骨片。加入含0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化15 min后棄消化液，使用0.1%Ⅰ型膠原酶37 ℃消化骨碎片約20 min，重復3次，收集消化液，1 000 r/min離心5 min，差數(shù)貼壁法獲取成骨細胞，純化并傳代。取第3代細胞，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、同時行ALP染色(鈣鈷法)，鑒定成骨細胞。

1.2.3細胞膜片的構(gòu)建以1×106個/孔細胞數(shù)將第3代成骨細胞分別接種于24孔板內(nèi)的對照組和SLA組鈦表面。DMEM完全培養(yǎng)基(15%的胎牛血清、50 mg/L維生素C、1 000 U/L青霉素-鏈霉素)連續(xù)培養(yǎng)；每2 d換液1次。分別于培養(yǎng)第7天和第14天時檢測成骨細胞的ALP活性。

1.2.4ALP活性使用ALP測試盒(酶標儀法)參照試劑盒說明書檢測膜片的ALP活性。分別收集已連續(xù)培養(yǎng)1周或2周時接種于鈦片上的成骨細胞培養(yǎng)液，1 500 r/min，離心10 min，取上清進行測定，依次加入緩沖液、基質(zhì)液50 μL，充分混勻后37 ℃水浴1 min。加入顯色劑150 μL，輕輕混勻，于490 nm酶標儀測定各孔吸光度吸光度(OD)值，按公式計算ALP活性(以100 mL液體在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1mg酚為1個金氏單位)[7]。

ALP活力(金氏單位/100 mL)=測定OD值-空白OD值/標準OD值-空白OD值×酚標準品濃度×100 mL×樣本測定前稀釋倍數(shù)

1.3統(tǒng)計學分析

2實驗結(jié)果

2.1成骨細胞鑒定

倒置顯微鏡下可見分離、接種的細胞4～5 h時細胞開始貼壁。原代培養(yǎng)7～8 d時細胞單層融合貼壁生長，呈長梭形、星形及多角形(圖1A)。對細胞進行純化傳代，細胞保持較強的增殖活性，形態(tài)均一，呈短梭形或三角形，可見大的細胞核(圖1B)。ALP染色后顯微鏡下見細胞質(zhì)中呈灰黑色顆粒、塊狀、條狀沉淀，核呈紫色 (圖1C-D)。

2.2細胞膜片

細胞刮可從鈦表面獲得白色膜狀物，具有一定的韌性，可卷縮成團(圖2A)。倒置顯微鏡下觀察膜片由細胞與細胞外基質(zhì)構(gòu)成，細胞與細胞間連接緊密(圖2B)。

注：A為成骨細胞原代培養(yǎng)第8天(100×) ，B為成骨細胞第三代培養(yǎng)第4天(100×)，C、 D為成骨細胞第三代培養(yǎng)后ALP染色(C:100×; D:200×)圖1　成骨細胞形態(tài)和ALP染色Fig.1　The morphology and ALP staining of osteoblasts

注：A為肉眼，B為倒置顯微鏡(100×)圖2　成骨細胞膜片F(xiàn)ig.2　osteoblast cell sheet

2.3ALP活性

連續(xù)培養(yǎng)1周或2周時，SLA組ALP活性均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；1周形成膜片ALP活性高于2周，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1　兩組膜片中ALP活性

(1)與對照組比較P<0.05，(2)與1周比較P<0.05

3討論

鈦及其合金作為口腔種植及骨科植入材料，由于鈦本身具有的機械強度、耐腐蝕性等優(yōu)點，具有良好的生物相容性。鈦表面存在大量細胞外基質(zhì)蛋白有助于細胞的黏附[8]。組織工程細胞膜片的應用能夠避免外源支架引起的炎癥反應、細胞利用率低等問題，近年來利用CST促進骨組織再生的方法成為人們研究的熱點。可以通過溫度反應培養(yǎng)皿法、膠原凝膠法、物理刮取法等方法構(gòu)建的細胞膜片，它保留細胞自身分泌的細胞外基質(zhì)，為細胞的生存、功能的發(fā)揮提供較穩(wěn)定的微環(huán)境[9-12]。細胞膜片不僅保留了細胞與細胞間的連接、還有細胞與細胞外基質(zhì)的連接來維持著細胞的功能表型及結(jié)構(gòu)的完整性。完整的細胞與細胞外基質(zhì)對調(diào)控細胞的黏附、增殖、分化能力具有重要作用。

鈦表面性質(zhì)對種植體與宿主骨之間的生物作用有影響。粗糙度的增加有助于成骨細胞的黏附、增殖及成骨相關基因的表達[7]。鈦表面的濕潤度是增強細胞黏附的重要因素之一，有研究發(fā)現(xiàn)，鈦表面濕潤度增加促進了鈦種植體與周圍組織的整合。作為細胞礦化、骨化的標志酶，ALP活性不僅能反映細胞的生長狀況，還能作為細胞成骨分化的早期標志[7]。本研究中，采用無支架成骨細胞膜片骨組織工程方法，在兩種鈦表面構(gòu)建成骨細胞膜片，光滑鈦表面形成的細胞膜片可通過物理刮取法分離，而SLA組通過噴砂處理后的鈦表面粗糙度增加，增加了與細胞膜片的接觸面積；進一步酸蝕使噴砂后表面的雜質(zhì)去除的同時，強酸的作用使鈦表面形成微孔隙，親水性鈦表面增加了鈦的濕潤度，粗糙的表面、濕潤度的增加最終促進細胞膜片的黏附、增殖及分化。因此，本研究對鈦表面成骨細胞膜片的ALP活性檢測時發(fā)現(xiàn)，組內(nèi)比較時，1周形成的成骨細胞膜片ALP含量較2周ALP含量高，提示隨著培養(yǎng)時間的延長，ALP會有所降低，進一步證實了ALP是細胞成骨分化的早期標志；而在組間比較時，SLA組ALP含量較光滑對照組ALP含量明顯增高，提示鈦表面形成的膜片層結(jié)構(gòu)內(nèi)成骨細胞可能處于分化早期向細胞分化、成熟階段過渡。綜上，鈦表面改性增強了細胞膜片的黏附及分化能力，SLA的鈦表面能夠有效的黏附細胞膜片，觸發(fā)細胞膜片早期分化，有關的作用機制有待進一步的研究。

4參考文獻

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(2016-01-05收稿，2016-03-26修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 趙毅

Active Changes of ALP of Osteoblasts Cell Sheet with Different Treated Titanium Surfaces

MAO Jiufeng1, XIA Qian2, WU Lei1, YANG Hong3, ZHOU Chengju3, FANG yi4, DONG qiang1

(1.DepartmentofProsthodontics,theSchoolofStomatology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofOralMedicine,theStomatologicalHospitalAffiliatedtoGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To study the ontogenesis of osteoblasts cell sheets with different treated surface of titanium. Methods: Primary cultured rat osteoblasts were identified through morphology observation, alkaline phosphatase staining. Mechanically polished titanium sheets served as control group. The cell sheets were treated with brown fused alumina material as SLA group. Constructing osteoblast cell sheets respectively, and cultured successively for 1 or 2 weeks. Then, measuring changes of ALP activity. Results: Primary cultured cell ALP was positive, the morphology of cells conformed to the characteristics of osteoblasts. The alkaline phosphatase activity of the SLA group was higher than that of control group when cultured successively for 1 or 2 weeks, differences were statistically significant (P<0.05). The alkaline phosphatase activity of the cell sheets formed in 1stweek was higher than that of 2ndweek, differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion: The surface properties of titanium could affect the osteogenic capacity of cell sheet.

[Key words]cell shee; titanium; surface treatment; alkaline phosphatase; cell culture; rats, Sprague-Dawley

[中圖分類號]R783； R318.021

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0410-04

*[基金項目]貴州省科技廳省校合作協(xié)議項目[黔科合LH字(2014)7115]； 貴陽市科技計劃項目[筑科合同(2014)100139]

**貴州醫(yī)科大學2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:dongq666@163.com

網(wǎng)絡出版時間：2016-04-20網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1817.024.html