鄧春閩，鐘天翼，左保齊

(1.蘇州大學 現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州唯特工程咨詢有限公司，江蘇 蘇州 215104)

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絲素/泊洛沙姆復合水凝膠的藥物緩釋研究

鄧春閩1,2，鐘天翼2，左保齊1

(1.蘇州大學 現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州唯特工程咨詢有限公司，江蘇 蘇州 215104)

摘要：選定不同分子量的表面活性劑泊洛沙姆，分別將它們與絲素溶液以不同的比例混合形成復合水凝膠，考察其對阿司匹林與吲哚美辛兩種藥物的體外緩釋性。利用掃描電鏡對絲素/泊洛沙姆水凝膠緩釋前后的形態(tài)結構進行了檢測，以及用紫外分光光度計分析不同條件下的藥物緩釋曲線。結果表明通過改變水凝膠的共混比例、泊洛沙姆的分子量和鏈段比可以調節(jié)兩種藥物的釋放速率，以達到藥物緩釋的目的。絲素/泊洛沙姆有望作為一種新的遞送載體用于藥物緩釋。

關鍵詞：絲素；泊洛沙姆；水凝膠；藥物緩釋

藥物的控制釋放是一門新的交叉學科，起源于20世紀60年代，隨著科學技術發(fā)展，藥物控制釋放已成為國內外熱門研究領域之一。將藥物與載體制成制劑，通過適當?shù)男问娇刂扑幬镌谌梭w內釋放的過程就是藥物控制釋放技術。從方法上說，它可以分為時間控制釋放和分布控制釋放兩種，即一定的時間范圍內在體內以一定的模式釋放與在指定部位釋放。和傳統(tǒng)給藥方式相比，藥物控釋體系降低了藥物的毒副作用，減少了給藥次數(shù)，從而提高了藥物的療效，減少了病人痛苦。從劑型上分，藥物控制釋放可分為高分子包囊體系、凝膠體系、膠束體系、電紡絲超細纖維體系及脂質體體系，本研究選用凝膠體系。

絲素蛋白來源于蠶絲，富含甘氨酸(G1y)、丙氨酸(Ala)和絲氨酸(Ser)等20種氨基酸[1]，無毒、無刺激，另外還具有優(yōu)良的物理機械性能[2]、降解性能[3]，并且降解產物不會引起炎癥反應[4]。絲素水凝膠中含有大量水分的三維網絡狀結構使其具有良好的可透性和可塑性，可以被廣泛研究應用于藥物和生長因子緩釋載體，骨填充材料和細胞培養(yǎng)支架等方面。而泊洛沙姆具有無毒、無抗原性、無致敏性、無刺激性、化學性質穩(wěn)定、不溶血和可控的親疏水性等優(yōu)點，在組織工程中，尤其是在骨組織工程和生長因子的釋放上有著明顯的優(yōu)勢。本文通過不同分子量泊洛沙姆與絲素制成共混水凝膠，考察其對阿司匹林與吲哚美辛的體外緩釋性，為其進一步研究用于組織工程中生長因子的釋放做準備。

1實驗部分

1.1實驗材料

無水碳酸鈉(Na2CO3)(化學純，上海興達化學試劑廠)；溴化鋰(LiBr·H2O)(化學純，上海恒信化學試劑有限公司)；桑蠶絲(浙江湖州)；不同分子量泊洛沙姆：泊洛沙姆P188(分子量1 800，聚氧乙烯80%)，泊洛沙姆P338(分子量3 300，聚氧乙烯80%)，泊洛沙姆P407(分子量4 000，聚氧乙烯70%)(Sigma，美國)。

吲哚美辛(C19H16ClNO4，鄭州益康藥業(yè))；

阿司匹林(C9H8O4，鄭州益康藥業(yè))；

無水乙醇(C2H6O，AR，國藥集團化學試劑有限公司)；

十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H2O，AR，國藥集團化學試劑有限公司)；

磷酸二氫鉀(KH2PO4，AR，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2實驗儀器

DKZ-2型恒溫振蕩水槽(上海精宏實驗設備有限公司) ；

DZF-1B型真空干燥烘箱(上海賀德實驗股份有限公司)；

FD-1A-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；

ISO 9001型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；

UV-2550型紫外分光光度計(日本Shimadzu公司)；

PB-10型精密pH計(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；

Hitach S-480掃描電子顯微鏡(日本Hitach公司)。

1.3實驗方法與測試

1.3.1絲素蛋白溶液

桑蠶絲用0.5%(質量比)的碳酸鈉溶液脫膠，浴比1∶20，在沸水中煮30min，然后用去離子水洗滌，如此反復進行3次。

將脫膠的桑蠶絲溶于LiBr∶C2H5OH=40∶60(質量比)溶液中，恒溫(80±2)℃水浴攪拌溶解獲得再生絲素溶液，經冷卻以后，將絲素溶液注入8 000～14 000道爾頓的透析袋中，用自來水流動透析1d，再用去離子水透析2d，得到純SF水溶液。最后將絲素水溶液調控到3%濃度。

1.3.2載藥Poloxamer/SF水凝膠的制備

將泊洛沙姆與絲素溶液分別以P188∶SF=1∶1；P338∶SF=1∶1；P407∶SF=1∶1；P188∶SF=1∶3；P188∶SF=3∶1共混，再稱取0.005g的阿司匹林粉末，分別加入的Poloxamer/SF共混溶液中，充分攪拌混合均勻后分裝至10mL離心管，每個離心管含2mL載藥共混溶液，置于37℃水浴中待其完全形成凝膠，得到載藥量2.5mg/mL的載藥水凝膠。吲哚美辛載藥水凝膠的制備與阿司匹林相同。

1.3.3磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制

分別稱取1/15mol/L濃度的Na2HPO4溶液和KH2PO4溶液，按照81.8∶18.2的比例混合，在37℃下，使用稀鹽酸和氯化鈉溶液微調，待溶液穩(wěn)定后，用精密pH計測量得到pH=7.4、濃度為0.1mol/L的PBS緩沖液，最后密封室溫保存。

1.3.4藥物標準曲線的繪制

精密稱取0.5g阿司匹林，然后放到50mL容量瓶中，加50mL無水乙醇溶解，得到10mg/mL的溶液；然后吸取這5mL的濃溶液于50mL容量瓶中，加磷酸鹽的緩沖液50mL得到1mg/mL標準溶液；用同樣的方法，再精密稱量適量標準溶液，加磷酸鹽緩沖液，濃度分別為1，5，10，20，30，50，100μg/mL。吲哚美辛標準溶液的配制和阿司匹林的方法相同。用紫外分光光度計分別測定吸光度(阿司匹林λ=302nm，吲哚美辛λ=320nm)，然后進行回歸計算，得到兩種藥物的藥物的標準曲線方程[5-6]，以質量濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，如圖1。

圖1　吲哚美辛和阿司匹林的標準曲線

1.3.5載藥Poloxamer/SF水凝膠的體外緩釋

分別加入8mL的PBS緩沖液到裝有2mL載藥共混水凝膠的離心管中，再將離心管放到燒杯中，37℃下在恒溫振蕩水槽中振蕩(頻率設為60r/min)，隔一段時間從離心管中取出4mL的釋放液，同時向離心管中加入4mL的PBS緩沖液。再用紫外分光光度計分別測定阿司匹林藥物λ=302nm，吲哚美辛藥物λ=320nm釋放液的吸光度，根據(jù)標準曲線方程，計算釋放液的釋藥量及藥物濃度，隨著時間的增長，計算累積釋藥百分率，并繪制累積釋藥曲線。

2結果與討論

2.1載藥Poloxamer/SF水凝膠的研究

圖2　阿司匹林和吲哚美辛的分子式結構

阿司匹林又稱乙酰水楊酸(圖2)。至今它仍是世界上應用最廣泛的解熱，鎮(zhèn)痛及抗炎藥，是作為比較和評價其他藥物的標準制劑。其性狀為白色針狀或板狀結晶或粉末。熔點135℃，無臭或微帶醋酸臭，味微酸，在干燥空氣中穩(wěn)定，在潮濕空氣中緩緩水解成水楊酸和乙酸，微溶于水，在水里的溶解度大概為3.3mg/mL[7]。吲哚美辛(圖2)又名消炎痛，是一種白色或者微黃色的結晶性粉末，幾乎無臭，無味。在丙酮中溶解，在甲醇、乙醇、氯仿或乙醚中略溶，在苯中微溶，在甲苯中極微溶解，在水中幾乎不溶[8]。適用于活血化瘀、消腫止痛，可用于風濕性、痛風性關節(jié)炎及一些癌性疼痛，也可用于滑囊炎、腱鞘炎及關節(jié)囊炎等。根據(jù)兩種藥物在水里的溶解度，載阿司匹林藥物的釋放時間選定為20h，載吲哚美辛藥物的釋放時間選定為19d。

阿司匹林是一種偏酸性的藥物(圖3)。選擇P188、P338、P407三種不同分子量的非離子表面活性劑泊洛沙姆分別與SF以1∶1比例混合載阿司匹林得到共混水凝膠，如圖3(A)(B)(C)所示SEM圖，對載阿司匹林藥物后共混水凝膠的形貌進行對比研究。與載藥前相比，加入阿司匹林藥物后，不同分子量的泊洛沙姆，其載藥后的水凝膠都為大的片層結構。纖維之間的縫隙減少，變的較為致密。我們知道，絲素蛋白是一種含有大量正負電荷的兩性蛋白質，其在水中的等電點約為4.5。在等電點時，蛋白質分子以雙極離子存在，總凈電荷為零，顆粒無電荷間的排斥作用，易凝集成大顆粒，因而最不穩(wěn)定，溶解度也最小，易沉淀析出。而阿司匹林偏酸性，其結構中含有大量的羧酸根(-COO-)，當阿司匹林加入泊洛沙姆/絲素共混溶液中后，其溶解于水中，會釋放出大量的羧酸根，降低了溶液的pH值并接近等電點，從而絲素分子之間的電荷排斥作用減弱，聚集作用變強，進而影響了水凝膠的結構，片層結構會變得更加緊密。圖3中(D)、(E)和(F)所示，是載阿司匹林藥物緩釋120h后水凝膠截面的SEM圖像，水凝膠變得脆弱且易碎，可以看出泊洛沙姆/絲素水凝膠表面孔壁均存在大量的細小孔洞。這是由于阿司匹林在PBS溶液中的不斷溶解釋放，而絲素分子中存在大量的極性氨基酸殘基，易與阿司匹林之間生成氫鍵結合，這些結合的位置就形成了細小的孔洞。

A、P188/SF 1∶1,B、P338/SF 1∶1,C、P407/SF 1∶1載阿司匹林藥物緩釋前；D、P188/SF 3∶1, E、P338/SF 1∶1, F、P407/SF 1∶1載阿司匹林藥物緩釋后圖3　共混水凝膠的掃描電鏡圖

圖4是載吲哚美辛緩釋前后的水凝膠形貌圖，其中A、B、C是載吲哚美辛后的水凝膠SEM圖像，與載阿司匹林后的水凝膠對比，不同分子量的泊洛沙姆載吲哚美辛后的水凝膠也是均勻的多片層結構。不過這種片層變得更脆弱易斷，這可能是因為吲哚美辛是一種疏水性藥物難溶于水，由于泊洛沙姆的存在，增加了吲哚美辛的溶解性，泊洛沙姆中的疏水性基團將其包裹聚集在一起。但是這些疏水性藥物會使疏水性基團的作用力減弱，從而這些片層結構會更加脆弱。D、E、F為吲哚美辛緩釋14D后水凝膠截面的SEM圖像，可以觀察到膜的表面存在許多微小的孔洞。E是對水凝膠孔壁的進一步放大的SEM圖像，這些大小不一的納米孔洞直徑分布約10～400nm。結合緩釋吲哚美辛前水凝膠的形態(tài)，可能是隨著時間的增加，吲哚美辛逐漸釋放出來形成的。

A、P188/SF 1∶1, B、P338/SF 1∶1, C、P407/SF 1∶1載吲哚美辛藥物緩釋前;D、P188/SF 3∶1, E、P338/SF 1∶1,F、P407/SF 1∶1載吲哚美辛藥物緩釋后;圖4　共混水凝膠的掃描電鏡圖

2.2不同種類泊洛沙姆對水凝膠體外緩釋行為的影響

圖5為不同分子量Poloxamer/SF水凝膠相同比例混合在37℃、pH=7.4的磷酸鹽中緩沖液的藥物釋放累積曲線?？梢钥闯鲚d阿司匹林水凝膠釋藥過程是先快后慢地釋放，而載吲哚美辛水凝膠釋藥過程是先快后慢再快地釋放。

A和C圖分別為P188、P338、P407載阿司匹林和吲哚美辛水凝膠的釋藥累積速率?？梢钥闯?，載阿司匹林和吲哚美辛水凝膠的釋藥累積速率略有不同，對阿司匹林藥物來說，P407累計釋放藥物最少最快，而P338累計釋放藥物最多最慢。這可能是因為阿司匹林偏酸性，其與絲素形成氫鍵，而P407的分子量最大，而親水性最弱，其在一定程度上減弱了氫鍵作用，所以藥物釋放會最快。而對于大多數(shù)藥物緩釋系統(tǒng)來說，主要涉及擴散和降解溶蝕兩種作用。結合之前對載阿司匹林水凝膠的研究，阿司匹林與Poloxamer/SF共混水凝膠形成了致密的大片層結構，阿司匹林擴散到共混水凝膠中間，而釋放液不易進入孔壁內部，孔壁內部的阿司匹林需通過擴散作用到達孔壁表面再釋放，而P407與絲素溶液最快最容易形成水凝膠，所以阿司匹林也會更最不容易釋放，其累計釋放量也會最少。對于吲哚美辛藥物來說，藥物釋放速率差不多，不過P407的藥物釋放量最多，而P188的藥物釋放量最少。我們知道，泊洛沙姆具有增溶作用，分子量越大，疏水性作用越大，泊洛沙姆與吲哚美辛的結合也越容易，但隨著時間的增加，由于PBS緩沖液的加入，吲哚美辛藥物要釋放。而增溶作用藥物與泊洛沙姆結合的并不是那么緊密，所以會有更多藥物釋放出來。

a、P188∶SF=1∶1,b、P338∶SF=1∶1,c、P407∶SF=1∶1A、阿司匹林，C、吲哚美辛圖5　不同分子量Plolxamer/SF共混水凝膠的體外藥物釋放累積曲線

圖6為相同分子量不同共混比例P188/SF水凝膠在37℃、pH=7.4的磷酸鹽中緩沖液的藥物釋放累積曲線?？梢钥闯鲚d阿司匹林水凝膠釋藥過程也是先快后慢地釋放，而載吲哚美辛水凝膠釋藥過程也是先快后慢再快地釋放。

圖6中的B、D圖為同種泊洛沙姆與絲素以不同比例混合的釋藥累積速率?？梢钥闯?，隨著P188含量的的增加，載阿司匹林和吲哚美辛水凝膠的釋藥累積速率都會有不同程度的降低。這是因為隨著載藥量的增加，材料與藥物分子之間的相互作用增強，阿司匹林與絲素之間存在氫鍵作用，吲哚美辛與泊洛沙姆存在增溶作用，兩者均會使釋藥累積一定程度的下降。

a、P188:SF=1:1, b、p188:SF=1:3, c、p188:SF=3:1B、阿司匹林，D、吲哚美辛圖6　相同分子量Poloxamer/SF共混水凝膠的體外藥物釋放累積曲線

3結論

(1)當阿司匹林加入共混溶液中后，會釋放出大量的羧酸根，降低了溶液的 pH值，使其接近絲素的等電點，同時易于和絲素之間以氫鍵結合，進而影響了水凝膠的形態(tài)結構，形成了大量大片層水凝膠。

(2)藥物吲哚美辛加入共混溶液中后，泊洛沙姆會對其發(fā)生增溶作用，形成含有大量載藥多片層水凝膠，但這種片層結構比較脆弱。

(3)載阿司匹林水凝膠釋藥過程是先快后慢地釋放，而載吲哚美辛水凝膠釋藥過程則是先快后慢再快地釋放。隨著共混比例中絲素比例的下降或P188含量的的增加，載阿司匹林和吲哚美辛水凝膠的釋藥累積速率都有不同程度的降低。

(4)對不同分子量的泊洛沙姆P188、P338、P407來說，載阿司匹林和吲哚美辛水凝膠的釋藥累積速率則略有不同；對阿司匹林藥物來說，P407累計釋放藥物最少最快，而P338累計釋放藥物最多最慢；對于吲哚美辛藥物來說，藥物釋放速率差不多，但是P407的藥物釋放量最多，而P188的藥物釋放量最少。

因此，可以通過改變共混比例、泊洛沙姆的分子量和鏈段比例，使載藥水凝膠能夠定量勻速的向外釋放藥物，從而達到控釋的目的。

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收稿日期：2016-01-05