陳添華, 周萍萍, 李志樑

(1.井岡山大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 江西 吉安　343000； 2.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院， 江西 吉安　343000； 3.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院， 廣東 廣州　510280)

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黃芪多糖對(duì)血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥因子的影響*

陳添華1, 周萍萍2, 李志樑3

(1.井岡山大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 江西 吉安343000； 2.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院， 江西 吉安343000； 3.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院， 廣東 廣州510280)

[摘要]目的： 觀察黃芪多糖(APS)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大及炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用。方法: 原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞，分為對(duì)照組、AngⅡ(10-6mol/L)刺激組、APS低溶度干預(yù)組、APS中濃度干預(yù)組和APS高濃度干預(yù)組，APS各干預(yù)組分別加入25 mg/L、50 mg/L及100 mg/L APS孵育30 min后加入10-6mol/L AngⅡ；Real-time PCR及ELISA方法測(cè)定各組心肌細(xì)胞Toll樣受體4(TLR4)、心房利鈉多肽(ANP)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α) mRNA表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α濃度； Bradford法測(cè)定心肌細(xì)胞總蛋白含量。結(jié)果: 與AngⅡ刺激組比較，不同濃度APS干預(yù)后，心肌細(xì)胞TLR4、ANP、TNF-α mRNA表達(dá)減少，心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α濃度下降，心肌細(xì)胞總蛋白含量減少，隨著干預(yù)濃度的升高，這種作用逐慚增強(qiáng)。結(jié)論: APS對(duì)AngⅡ刺激引起的心肌細(xì)胞肥大及炎癥反應(yīng)有良好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制TNF-α等炎癥因子實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]中藥； 黃芪多糖； 心肌細(xì)胞； 血管緊張素Ⅱ； 腫瘤壞死因子-α； 大鼠，Sprague-Dawley

黃芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)是中藥黃芪最主要的活性成分，具有提高心肌成活率，抑制細(xì)胞凋亡，并對(duì)缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞有保護(hù)作用[1]。炎癥在心血管病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，腎素-血管血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)與心血管病炎癥有關(guān)，血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)與其受體結(jié)合后，可激活多種炎癥因子，參與炎癥損傷[2]。本實(shí)驗(yàn)采用Ang II誘導(dǎo)SD乳鼠心肌細(xì)胞肥大及炎癥反應(yīng)，檢測(cè)心肌細(xì)胞Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)、心房利鈉多肽(atrial natriuretic peptide，ANP)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)mRNA的變化，探討黃芪多糖對(duì)心肌細(xì)胞肥大及炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

出生2～3 d的SD大鼠乳鼠，雌雄不拘，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCKK(粵)2006-0015；黃芪多糖(天津賽諾制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20040086)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%；AngⅡ?yàn)槊绹鳶igma公司產(chǎn)品，Trizol試劑盒為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，大鼠TNF-α ELISA試劑盒為美國BD Biosciences公司產(chǎn)品。

1.2心肌細(xì)胞培養(yǎng)

無菌條件下開胸取出SD乳鼠心臟，分離左室心肌，用眼科剪剪成0.5～1 mm3的組織塊后用胰蛋白酶分次消化，差速貼壁法分離成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109cells/L，接種到培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d可見細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則、整體協(xié)調(diào)一致的搏動(dòng)。

1.3分組

常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞72 h后，將心肌細(xì)胞分為5組:對(duì)照組,不做任何處理；Ang Ⅱ刺激組，用10-6mol/L AngⅡ處理；APS低濃度干預(yù)組，用25 mg/L APS孵育乳鼠心肌細(xì)胞30 min后，再加入10-6mol/L AngⅡ；APS中濃度干預(yù)組，用50 mg/L APS孵育乳鼠心肌細(xì)胞30 min后，再加入10-6mol/L AngⅡ；APS高濃度干預(yù)組，用100 mg/L APS孵育乳鼠心肌細(xì)胞30 min后，再加入10-6mol/L AngⅡ。各組細(xì)胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1mRNA心肌細(xì)胞TLR4、ANP及TNF-α的表達(dá)采用Real-time PCR法，各組心肌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，Trizol試劑盒抽提各組心肌細(xì)胞的總RNA后，取4 μL RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)條件：37 ℃ 1 h，95 ℃ 3 min。擴(kuò)增內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物序列為5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；擴(kuò)增TLR4上游引物序列為5′-GAATCTCAGCAAAATCCCTCA-3′，下游引物序列為5′-TCCTGGGGAAAAACTCTTGAT -3′；擴(kuò)增ANP上游引物序列為5′-TGAGCCGAGACAGCAAACATC-3′，下游引物序列為5′-AGGCCAGGAAGAGGAAGAAGC-3′；擴(kuò)增TNF-α上游引物序列為5′-CATGGATCTCAAAGACAACCAA-3′，下游引物序列為5′-CTCCTGGTATGAAATGGCAAAT-3′。最后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物運(yùn)用ABI7500型定量PCR儀檢測(cè)基因的表達(dá)，反應(yīng)條件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 15 s、55 ℃ 25 s、72 ℃ 25 s、共40循環(huán)。結(jié)果以拷貝數(shù)進(jìn)行分析，考慮到各個(gè)樣本總RNA濃度的差異，最終計(jì)算結(jié)果按目的基因/內(nèi)參基因比值換算。

1.4.2總蛋白含量心肌細(xì)胞繼續(xù)孵育24 h后，收集各組心肌細(xì)胞， D-hanks沖洗3次后，加入SDS細(xì)胞裂解液使心肌細(xì)胞裂解，Bradford法測(cè)定各組心肌細(xì)胞總蛋白含量。

1.4.3培養(yǎng)液中TNF-α濃度各組心肌細(xì)胞繼續(xù)孵育24 h后，收集上清液，-80 ℃保存。TNF-α采用ELISA試劑盒測(cè)定濃度，按照試劑盒操作說明進(jìn)行操作。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0作數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1心肌細(xì)胞TLR4、ANP及TNF-αmRNA表達(dá)

采用Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激組心肌細(xì)胞TLR4、ANP及TNF-α mRNA表達(dá)增加(P<0.05)；不同溶度APS干預(yù)后心肌細(xì)胞TLR4、ANP及TNF-α mRNA表達(dá)較AngⅡ刺激組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著APS干預(yù)濃度的升高，TLR4、ANP及TNF-αmRNA表達(dá)逐慚下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2心肌細(xì)胞蛋白含量

與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激組心肌細(xì)胞蛋白含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同溶度APS干預(yù)后心肌細(xì)胞蛋白含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著APS干預(yù)濃度的升高，心肌細(xì)胞蛋白含量逐慚下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3TNF-α濃度

與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激組上清液TNF-α濃度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同溶度APS干預(yù)后上清液TNF-α濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著APS干預(yù)濃度的升高，TNF-α濃度逐慚下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表1　各組心肌細(xì)胞TLR4、ANP及

(1)與對(duì)照組比較,P<0.05；(2)與刺激組比較,P<0.05;(3)與低溶度組比較，P<0.05；(4)與中溶度組比較，P<0.05

表2　各組心肌細(xì)胞總蛋白含量±s)

(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與刺激組比較，P<0.05；(3)與低溶度組比較，P<0.05

3討論

高血壓病嚴(yán)重危害人類身體健康，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的心腦腎等靶器管功能損害，其中RAS發(fā)揮著重要作用。AngⅡ是RAS的主要效應(yīng)分子，參與了高血壓心肌損傷的全過程，與心臟疾病的發(fā)展密切相關(guān)[3]。AngⅡ生物學(xué)功能主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)血管張力和血流、促進(jìn)細(xì)胞生長和增生。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ還具有致炎作用,AngⅡ通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子和黏附因子等多種炎性介質(zhì)的表達(dá)參與機(jī)體炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展，在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚等心血管疾病中發(fā)揮著炎癥因子的作用[4-5]。

表3　各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中

(1)與對(duì)照組比較,P<0.05；(2)與刺激組比較,P<0.05

TLR4屬于跨膜信號(hào)傳遞受體家族，在免疫反應(yīng)中起著重要作用。TLR4與其配體結(jié)合，通過胞內(nèi)區(qū)與接頭蛋白髓樣細(xì)胞分化因子(myeloid differentiation factor，MyD88)的TH結(jié)構(gòu)域相互作用，使胞漿內(nèi)NF-κB從靜息狀態(tài)下激活，活化的NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與DNA分子上炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)基因中啟動(dòng)子區(qū)域的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞因子(IL-6,TNF-α等)以及協(xié)同刺激因子CD86等基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，導(dǎo)致炎癥因子大量釋放[6]。TLR4可在心肌細(xì)胞膜上表達(dá)，AngⅡ可通過TLR4活化NF-κB，使心肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α表達(dá)增加,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)[7]。研究表明，TLR4-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化過程中產(chǎn)生多種炎癥因子，這些炎癥因子參與了心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程，并且在心肌肥厚、心肌細(xì)胞調(diào)亡等病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用[8]。

既往研究表明AngⅡ刺激可引起心肌細(xì)胞肥厚，肥厚的心肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白重組，總蛋白含量升高，ANP上調(diào)[9-10]。ANP由心肌細(xì)胞合成和分泌，在心肌肥厚過程中，伴隨有ANP升高，是公論的反映心肌細(xì)胞肥大的特征性指標(biāo)[11]。早期研究表明，在許多組織或器官，如腎臟、心臟和血管中存在著獨(dú)立的局部RAS系統(tǒng)，局部組織中的AngⅡ具有胞內(nèi)作用，可促進(jìn)心肌細(xì)胞的DNA合成，mRNA轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞肥大[12]。正常心肌組織中TNF-α表達(dá)水平較低或不表達(dá)，肥厚心肌組織TNF-α表達(dá)明顯增加[13]。Sriramula等[14]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚過程中,TNF-α基因敲除大鼠相比野生型大鼠心肌肥厚明顯減輕，提示TNF-α在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚中起重要作用。Devorah Gurantz等[15]報(bào)道TNF-α使心肌中成纖維細(xì)胞的血管緊張素ⅡAT1受體上調(diào),兩者均可以在心肌組織局部合成分泌, 具有自分泌和旁分泌作用，共同參與心肌病變的進(jìn)展和演變過程。本實(shí)驗(yàn)中用AngⅡ刺激心肌細(xì)胞后, TLR4表達(dá)增加, TNF-α分泌增多，同時(shí)心肌細(xì)胞總蛋白含量和反映心肌肥大指標(biāo)ANP增多。加用黃芪多糖后，心肌細(xì)胞TLR4表達(dá)下降， TNF-α分泌下降，心肌細(xì)胞蛋白含量和ANP下降，隨著劑量增加，這種作用逐慚增強(qiáng)，表明黃芪多糖可抑制AngⅡ刺激引起的心肌細(xì)胞肥大和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，黃芪多糖AngⅡ刺激引起的心肌細(xì)胞肥厚和炎癥反應(yīng)有良好的保護(hù)作用，黃芪多糖的這種作用為高血壓心肌損害的防治研究提供了新的思路和理論依據(jù)。

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(2016-02-17收稿，2016-03-29修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

The Influence of Astragalus Polysaccharides on Angiotensin Ⅱ Induced Cardiomyocyte Inflammation Factor TNF-α

CHEN Tianhua1, ZHOU Pingping2, LI Zhiliang3

(1.SchoolofMedicine,JinggangshanUniversity,Ji'an343000,Jiangxi,China； 2.TheAffiliatedHospitalofJinggangshanUniversity,Ji'an343000,Jiangxi,China； 3.TheAffiliatedZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510280,Guangdong,China)

[Abstract]Objective: To explore the intervention effect of astragalus polysaccharides(APS) on angiotensin Ⅱ induced cardiomyocyte hypertrophy and inflammation of rats. Methods: The cardiomyocytes of rats of primary culture were divided into control group, AngⅡ stimulation group, low APS concentration intervention group, middle APS concentration intervention group and high APS concentration intervention group. Cardiomyocytes of each APS intervention were treated with different concentrations of APS for 30 minutes and stimulated with angiotensin Ⅱ to induce cardiomyocyte hypertrophy and inflammation. In each group, Real-time PCR was adopted to determine mRNA expression of TLR4, ANP, TNF-α of cardiomyocytes, Elisa was used to determine TNF-α concentration in cell culture supernatant, and Bradford's method was used to determine total protein content of cardiomyocytes. Results: Compared with AngⅡstimulation group, the mRNA expression of TLR4, ANP, TNF-α of cardiomyocytes and cardiomyocyte protein and TNF-α concentration in cell culture supernatant were decreased with APS intervention. Conclusion: APS can play a protection role in angiotensin Ⅱ induced cardiomyocyte hypertrophy and inflammation, and the mechanism may be inhibiting inflammation factors such as TNF-α.

[Key words]cardiomyocyte; astragalus polysaccharides; cardiomyocyte； angiotensin Ⅱ; tumour necrosis factor alpha; rats,Sprague-Dawley

[中圖分類號(hào)]R361.3； R285.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)04-0446-04

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1853.054.html