胡玉紅， 宋美玉

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 黑龍江 佳木斯　154002； 2.佳木斯大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 黑龍江 佳木斯　154003)

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巨噬細(xì)胞活性與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的關(guān)系*

胡玉紅1， 宋美玉2

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 黑龍江 佳木斯154002； 2.佳木斯大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 黑龍江 佳木斯154003)

[摘要]目的： 研究巨噬細(xì)胞與子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)發(fā)生之間的關(guān)系。方法： 選取卵巢巧克力囊腫和子宮肌瘤患者各20例，在腹腔鏡下進(jìn)行手術(shù)治療，術(shù)前分別抽取約15 mL的腹腔液，制成單細(xì)胞懸液，運(yùn)用顯微成像技術(shù)、Cell-sense standard系統(tǒng)、Image J系統(tǒng)測(cè)量?jī)山M患者腹腔液中巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度以及子宮內(nèi)膜細(xì)胞4 h時(shí)面積的變化，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔液中表達(dá)特異性標(biāo)記物的巨噬細(xì)胞含量；比較兩組患者腹腔積液中CD14+巨噬細(xì)胞不同標(biāo)記物所占百分比差異。結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞移動(dòng)速度小于對(duì)照組患者巨噬細(xì)胞移動(dòng)速度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)膜細(xì)胞面積增長(zhǎng)，對(duì)照組患者面積減小，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.599，P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組患者腹腔液中表達(dá)CD69 、CD71 和CD54的巨噬細(xì)胞占CD14+巨噬細(xì)胞的百分比明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論： 巨噬細(xì)胞功能的降低可能會(huì)引起逆流內(nèi)膜組織在腹腔中形成新的病灶，導(dǎo)致EMT的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]巨噬細(xì)胞； 子宮內(nèi)膜異位癥； 移動(dòng)速度

目前，子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT)的病因尚未明。普遍認(rèn)為是逆流內(nèi)膜組織在各種因素的相互作用下，在除子宮體以外的部位形成新的病灶，其中越來(lái)越受關(guān)注的是免疫功能的異常與EMT發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。研究表明，當(dāng)腹腔免疫功能受損時(shí)，隨經(jīng)血逆流的子宮內(nèi)膜細(xì)胞在腹腔存活、形成病灶的機(jī)會(huì)將大大增加[1-3]。腹腔液體中免疫細(xì)胞的主要功能為對(duì)外來(lái)成分具有殺傷作用，而在諸多免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞起主要作用，它具有吞噬功能、抗原呈遞及分泌多種細(xì)胞因子等功能，腹腔中巨噬細(xì)胞的功能變化可能使內(nèi)膜細(xì)胞不能及時(shí)被清除，使其順利粘附、侵襲腹膜而形成病灶[4-8]。本研究通過(guò)運(yùn)用顯微成像技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)等對(duì)EMT患者和子宮肌瘤患者腹腔液中巨噬細(xì)胞的移動(dòng)速度、4 h子宮內(nèi)膜細(xì)胞面積變化及腹腔積液中特異標(biāo)記巨噬細(xì)胞量的差異進(jìn)行比較，來(lái)探討巨噬細(xì)胞與EMT產(chǎn)生之間的關(guān)系。具體報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1對(duì)象

選取2015年03月～2015年12月卵巢巧克力囊腫和子宮肌瘤患者各20例為研究對(duì)象，卵巢巧克力囊腫為實(shí)驗(yàn)組，子宮肌瘤患者為對(duì)照組，所有患者25～45歲，平均(25±6.48)歲，均未絕經(jīng)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合子宮肌瘤和卵巢巧克力囊腫的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且就診前未接受任何治療。排出標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均需排除自身免疫性疾病及盆腔炎性疾病，卵巢巧克力囊腫患者未應(yīng)用藥物治療，需行腹腔鏡手術(shù)治療。所有患者均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料器械

Cellsence standard軟件用于控制顯微鏡對(duì)放置于鏡下觀察的腹腔液?jiǎn)渭?xì)胞懸液拍照，Image J軟件標(biāo)記巨噬細(xì)胞軌跡來(lái)測(cè)算其速度及測(cè)量子宮內(nèi)膜細(xì)胞面積，CytoFLEX 流式細(xì)胞儀用于檢測(cè)細(xì)胞特異表型。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將所有患者分為兩組，卵巢巧克力囊腫患者為實(shí)驗(yàn)組，子宮肌瘤患者為對(duì)照組，各20例。實(shí)驗(yàn)組患者行腹腔鏡下卵巢囊腫切除術(shù)，術(shù)中根據(jù)ASRM修正EMT分期法(1997年)對(duì)該組患者分期(6例Ⅰ～Ⅱ期，14例Ⅲ～Ⅳ期患者)；對(duì)照組患者行腹腔鏡下子宮肌瘤切除術(shù)或子宮切除術(shù)。所有患者在手術(shù)前均抽取約15 mL的腹腔液體(留取樣本后立即實(shí)驗(yàn))，放入離心機(jī)中，2 000 r/min離心5 min，留上清液備用。將腹腔液?jiǎn)渭?xì)胞懸液置于光鏡下觀察，巨噬細(xì)胞形態(tài)多呈圓形或橢圓形，功能活躍著有偽足，較其他細(xì)胞形體較大，移動(dòng)速度相對(duì)慢。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

選取具有巨噬細(xì)胞和(或)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的視野，用Cellsence standard軟件對(duì)顯微鏡設(shè)置為4 h內(nèi)每2 min拍照1次該視野。運(yùn)用Image J軟件及Manual-Tranking插件標(biāo)記圖片中巨噬細(xì)胞軌跡并計(jì)算出巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度，用Photoshop軟件分析照片的實(shí)際尺寸及像素，計(jì)算得出1.5像素代表實(shí)際1 μm，以此為比例在Image J軟件中設(shè)標(biāo)尺，測(cè)量子宮內(nèi)膜細(xì)胞的面積，通過(guò)巨噬細(xì)胞移動(dòng)速度和4 h內(nèi)面積的變化來(lái)表示巨噬細(xì)胞功能及腹腔液中相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)EMT的作用效果。腹腔液中巨噬細(xì)胞的表型運(yùn)用雙色免疫熒光進(jìn)行標(biāo)記，使用的抗體有anti.CD14(單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物，PE.conjugated)，anti.CD69(早期激活分子，F(xiàn)ITC.conjugated)，anti.CD54 (細(xì)胞間黏附分子1，intercellular adhesion molecule.1/ICAM.1，F(xiàn)ITC.conjugated)，anti.CD71 (增殖標(biāo)記物，F(xiàn)ITC.conjugated)。所有抗體均購(gòu)于北京安必維(Abway)抗體技術(shù)有限公司。用的流式細(xì)胞儀為CytoFLEX 流式細(xì)胞儀(貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司)檢測(cè)腹腔積液中CD14+巨噬細(xì)胞不同標(biāo)記物所占百分比。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1巨噬細(xì)胞移動(dòng)速度

分析兩組患者樣本圖片所得的數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞移動(dòng)速率小于對(duì)照組患者巨噬細(xì)胞移動(dòng)速度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1　兩組患者腹腔液中巨噬細(xì)胞移動(dòng)速度

注：圖中*與·為離群值圖1　不同分組巨噬細(xì)胞移動(dòng)速度比較Fig.1　the macrophages' movement rate of different groups

2.2兩組患者腹腔積液樣本中子宮內(nèi)膜細(xì)胞面積變化測(cè)定及分析

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件測(cè)量4 h子宮內(nèi)膜細(xì)胞面積變化，以增長(zhǎng)為正值，減小為負(fù)值，其計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)膜細(xì)胞面積增長(zhǎng)明顯大于對(duì)照組患者(Z=-4.599，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2和圖2。

表2　兩組子宮內(nèi)膜細(xì)胞面積差值比較

注：兩組患者的表中數(shù)值為對(duì)應(yīng)視野中對(duì)應(yīng)標(biāo)記物巨噬細(xì)胞數(shù)與CD14+巨噬細(xì)胞的比值

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組患者腹腔積液中CD14+巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的差異

實(shí)驗(yàn)組患者腹腔液中表達(dá)CD69 、CD71 和CD54的巨噬細(xì)胞占CD14+巨噬細(xì)胞的百分比明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

注：A1為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始內(nèi)膜細(xì)胞，B1為4 h后內(nèi)膜細(xì)胞，A2為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始內(nèi)膜細(xì)胞，B2為4 h后內(nèi)膜細(xì)胞圖2　兩組子宮內(nèi)膜細(xì)胞面積的變化Fig.2　The ares difference of endometrial cells in observation and control group

標(biāo)記物對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組PCD6925.6±6.014.3±5.6<0.05CD7124.0±2.36.1±1.7<0.05CD5447.5±13.518.1±3.1<0.05

3討論

EMT是指子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體以外的部位，該病好發(fā)于育齡婦女，易復(fù)發(fā)，是具有惡性腫瘤侵襲性的良性疾病，易引起女性不孕、慢性骨盆疼痛(35%～50%)等嚴(yán)重影響女性心理和生理健康，降低生活質(zhì)量。研究表明，70%～90%育齡婦女的經(jīng)血或早卵泡期的腹腔液中均可見(jiàn)存活的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，但只有10%～15%的女性發(fā)病[8-13]。因此，EMT的發(fā)生除與異位種植有關(guān)外，還可能與腹腔清除外源細(xì)胞的能力密切相關(guān)。異位種植理論(也稱經(jīng)血逆流理論)是指女性月經(jīng)期的子宮內(nèi)膜碎片隨經(jīng)血自子宮經(jīng)輸卵管排入腹腔，粘附到腹膜表面發(fā)展成為子宮內(nèi)膜異位癥。但在一般情況下，健康女性的免疫系統(tǒng)能夠清除外來(lái)抗原，可以防止外源細(xì)胞的植入與生長(zhǎng)；而在各種因素的影響下，腹腔清除外源細(xì)胞能力降低時(shí)可能使內(nèi)膜組織經(jīng)逆行的經(jīng)血流入腹腔并存活，最終發(fā)展成新的病灶。腹腔清除外源細(xì)胞能力主要與腹腔免疫細(xì)胞密切相關(guān)，主要包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等。腹腔液中的免疫細(xì)胞以單核細(xì)胞為主，因此子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)入腹腔后遇到的第一道防線主要為腹腔巨噬細(xì)胞[14-18]。正常生理情況下，巨噬細(xì)胞具有相應(yīng)的免疫活性，能夠清除異位的子宮內(nèi)膜組織；然而EMT患者巨噬細(xì)胞的功能處于低靡狀態(tài)，大大增加了異位的子宮內(nèi)膜組織粘附和浸潤(rùn)的機(jī)會(huì)。

本研究中，抽取腹腔液檢測(cè)巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡并檢測(cè)其運(yùn)動(dòng)速度發(fā)現(xiàn)，EMT患者腹腔液中的巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度較為緩慢，同時(shí)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征也顯示細(xì)胞無(wú)明顯的偽足，功能不活躍；此外，用anti.CD14對(duì)所有巨噬細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，檢測(cè)巨噬細(xì)胞激活、粘附時(shí)表達(dá)的分子標(biāo)記物CD69、CD71 和CD54，發(fā)現(xiàn)EMT患者的腹腔液中CD69、 CD54和CD71處于低表達(dá)狀態(tài)，CD69、CD54和CD71的CD14+細(xì)胞百分明顯低于子宮肌瘤組。腹腔中的巨噬細(xì)胞來(lái)源于外周血，受細(xì)胞因子作用逐漸趨化至腹腔中，此過(guò)程中巨噬細(xì)胞會(huì)表達(dá)對(duì)應(yīng)的激活、粘附、遷徙分子；相反，這些分子標(biāo)記物表達(dá)量的增加或者降低也提示了巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)。本研究中，巨噬細(xì)胞無(wú)論是從子宮內(nèi)膜細(xì)胞面積，或者巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度，還是從其表達(dá)的黏附、激活分子標(biāo)記物上來(lái)看，巨噬細(xì)胞功能均處于低靡狀態(tài)。正常巨噬細(xì)胞功能的發(fā)揮是清除異位的子宮內(nèi)膜組織的關(guān)鍵，其功能降低很可能導(dǎo)致EMT的產(chǎn)生。當(dāng)腹腔免疫功能發(fā)生變化，尤其是巨噬細(xì)胞功能受損時(shí)，使進(jìn)入腹腔的子宮內(nèi)膜細(xì)胞不被機(jī)體的免疫殺傷作用清除[16，19-22]；同時(shí)巨噬細(xì)胞本身分泌一些細(xì)胞因子如IL.1、IL.6、IL.8、TNF.a、前列腺素、血小板活化因子、血管生長(zhǎng)因子、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子等導(dǎo)致腹腔微環(huán)境發(fā)生改變[2-3，9-10]；尤其是巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子，作用于巨噬細(xì)胞抑制其移動(dòng)，使病灶和腹腔液內(nèi)的巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，還能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌功能增強(qiáng)，使巨噬細(xì)胞向內(nèi)膜細(xì)胞游走募集的速度降低，影響其吞噬功能同時(shí)又增加異位內(nèi)膜侵襲性、促進(jìn)其生長(zhǎng)并且加重局部炎性反應(yīng)的作用，促進(jìn)其在腹腔內(nèi)種植生長(zhǎng)，最終形成病灶，這可能是該病發(fā)病的主要病理機(jī)制[4-11，23-25]。

綜上所述，巨噬細(xì)胞的清道夫功能減弱或缺陷時(shí)不能有效清除異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞，可能是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥重要原因；而對(duì)巨噬細(xì)胞的功能進(jìn)行靶向調(diào)節(jié)可能是防止子宮內(nèi)膜異位癥出現(xiàn)的有效途徑。

4參考文獻(xiàn)

[1] Koike N, Higashiura Y, Akasaka J, et al.Epigenetic dysregulation of endometriosis susceptibility genes (Review)[J]. Mol Med Rep, 2015(2)：1611-1616.

[2] Bulun SE, Monsivais D, Kakinuma T, et al. Molecular biology of endometriosis: from aromatase to genomic abnormalities[J]. Semin Reprod Med, 2015(3): 220-224.

[3] Langan KL, Farrell ME, Keyser EA, et al. Endometriosis: translation of molecular insights to management[J]. Minerva Endocrinol, 2014(3):141-154.

[4] Vitonis AF, Vincent K, Rahmioglu N, et al. World endometriosis research foundation endometriosis phenome and biobanking harmonization project: II.clinical and covariate phenotype data collection in endometriosis research[J]. Fertil Steril, 2014(5):1223-1232.

[5] Mehedintu C, Plotogea MN, Ionescu S, et al. Endometriosis still a challenge. J Med Life. 2014(3):349-357.

[6] Gadducci A, Lanfredini N, Tana R. Novel insights on the malignant transformation of endometriosis into ovarian carcinoma[J]. Gynecol Endocrinol, 2014(9): 612-617.

[7] Langan KL, Farrell ME, Keyser EA, et al. Endometriosis: translation of molecular insights to management[J]. Minerva Endocrinol, 2014(3):141-154.

[8] Hutter S, Heublein S, Knabl J, et al. Macrophages: are they involved in endometriosis, abortion and preeclampsia and how.Nippon Med Sch, 2013(2): 97-103.

[9] Rakhila H, Girard K, Leboeuf M, et al. Macrophage migration inhibitory factor is involved in ectopic endometrial tissue growth and peritoneal.endometrial tissue interaction in vivo: a plausible link to endometriosis development[J]. PLoS One, 2014(10): e110434.

[10]Beste MT, Pfaffle DN, Prentice EA, et al. Molecular network analysis of endometriosis reveals a role for c.Jun.regulated macrophage activation[J]. Sci Transl Med, 2014(222):216-222.

[11]Wang Y, Fu Y, Xue S, et al. The M2 polarization of macrophage induced by fractalkine in the endometriotic milieu enhances invasiveness of endometrial stromal cells[J]. Int J Clin Exp Pathol ,2014(1): 194-203.

[12]Gargett CE, Schwab KE, Brosens JJ, et al. Potential role of endometrial stem/progenitor cells in the pathogenesis of early.onset endometriosis[J]. Mol Hum Reprod, 2014(7): 591-598.

[13]Veillat V, Sengers V, Metz CN, et al. Macrophage migration inhibitory factor is involved in a positive feedback loop increasing aromatase expression in endometriosis[J]. Am J Pathol, 2012(3): 917-927.

[14]Kralickova M, Vetvicka V. Immunological aspects of endometriosis: a review[J]. Ann Transl Med, 2015(11): 153.

[15]Thiruchelvam U, Wingfield M, O'Farrelly C. Natural killer cells: key players in endometriosis[J]. Am J Reprod Immunol, 2015(4): 291-301.

[16]Mahdian S, Aflatoonian R, Yazdi RS, et al. Macrophage migration inhibitory factor as a potential biomarker of endometriosis[J]. Fertil Steril, 2015(1):153-159.

[17]Takebayashi A, Kimura F, Kishi Y, et al. Subpopulations of macrophages within eutopic endometrium of endometriosis patients[J]. Am J Reprod Immunol, 2015(3): 221-231.

[18]Signorile PG, Baldi A. New evidence in endometriosis Int.Biochem Cell Biol,2015(1) ：19-22.

[19]Nothnick W, Alali Z. Recent advances in the understanding of endometriosis: the role of inflammatory mediators in disease pathogenesis and treatment[J]. F1000Res, 2016(5):456-457.

[20]Zhang X, Mu L. Association between macrophage migration inhibitory factor in the endometrium and estrogen in endometriosis[J]. Exp Ther Med, 2015(2):787-791.

[21]Baranov VS, Ivaschenko TE, Liehr T, et al. Systems genetics view of endometriosis: a common complex disorder[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2015(1):59-65.

[22]Rizner TL. Diagnostic potential of peritoneal fluid biomarkers of endometriosis[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2015(4): 557-580.

[23]Fassbender A, Rahmioglu N, Vitonis AF, et al. World endometriosis research foundation endometriosis phenome and biobanking harmonisation project: IV tissue collection, processing, and storage in endometriosis research[J]. Fertil Steril, 2014(5): 1244-1253.

[24]Rahmioglu N, Fassbender A, Vitonis AF, et al. World endometriosis research foundation endometriosis phenome and biobanking harmonization project: III fluid biospecimen collection, processing, and storage in endometriosis research[J]. Fertil Steril, 2014(5):1233-1243.

[25]Becker CM, Laufer MR, Stratton P, et al. World endometriosis research foundation endometriosis phenome and biobanking harmonisation project: I. Surgical phenotype data collection in endometriosis research[J]. Fertil Steril, 2014(5):1213-1222.

(2016-01-08收稿，2016-04-07修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 周凌

The Correlation between Macrophage Activity and Endometriosis

HU Yuhong1, SONG Meiyu2

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology, 1stAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,Heilongjiang,China;2.ClinicalMedicineCollege,JiamusiUniversity,Jiamusi154003,Heilongjiang,China)

[Abstract]Objective: To study the relationship between macrophages and endometriosis. Methods: Twenty patients with ovarian chocolate cysts and 20 patients with uterine fibroids were selected; all patients underwent laparoscopic surgery. Approximately 15 mL peritoneal fluid was extracted before operation and single cell suspension was made. The microscopic imaging technique, Cell-sense standard system and Image J system were used to examine the trajectory, velocity of macrophages, as well as the changes in areas of endometrial cells within 4 hours. The ratio of macrophages expressed specific immunological markers measured by the flow cytometry was also calculated. The indicators mentioned above were collected and compared between the two groups. Results: The rate of macrophage movement of experimental group was lower than that in control group (P<0.05); the growth of endometrial cell areas of in experimental group was significant higher than that in control group (Z=-4.599, P<0.05); and the ratio of macrophages expressed specific immunological markers of CD69, CD71 and CD54 was statistically lower than that in control group (P<0.05). Conclusion: The decrease of macrophage function may cause a backflow of endometrial tissue to form new lesions in the abdominal cavity, causing EMT.

[Key words]macrophage; endometriosis; movement speed

[中圖分類(lèi)號(hào)]R783.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)04-0418-05

*[基金項(xiàng)目]佳木斯大學(xué)重點(diǎn)科技項(xiàng)目資助，項(xiàng)目編號(hào)(Sz2014-008)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1757.010.html