李金洵, 徐思源, 金　偉

(1 湖北工業(yè)大學輕工學部， 湖北 武漢 430068； 2 中國環(huán)境干部管理學院， 河北 秦皇島 066000 )

缺氮對血球藻光系統(tǒng)II蝦青素變化的影響

李金洵1, 徐思源2, 金偉2

(1 湖北工業(yè)大學輕工學部， 湖北 武漢 430068； 2 中國環(huán)境干部管理學院， 河北 秦皇島 066000 )

[摘要]血球藻(Haematococcus pluvialis)是一種生活在淡水的單細胞生物，綠藻綱,被認為是理想的天然蝦青素生產“工廠”。以代表性血球藻192.80為實驗材料，研究缺氮條件下其光系統(tǒng)II(PSII)光化學變化與其次級代謝產物蝦青素積累的變化之間的關系。實驗結果顯示，缺氮條件下，蝦青素含量、葉綠素相對含量和細胞密度均顯著低于全培養(yǎng)基處理組(P<0.05)，而蝦青素干重比值卻顯著高于全培養(yǎng)基處理組(P<0.05)；藻細胞的最大光化學效率(Fv/Fm)下降到初始值85%左右后，在紅色孢子中卻呈現(xiàn)上升趨勢，而rETR呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。結果顯示了血球藻響應氮脅迫的特殊保護機制。

[關鍵詞]血球藻；蝦青素；光系統(tǒng)II；缺氮

血球藻(Haematococcuspluvialis)是蝦青素的天然來源。幼期的血球藻呈綠色，在營養(yǎng)鹽限制、高光強、高鹽濃度等惡劣的生長環(huán)境下，這些細胞將會發(fā)生形態(tài)學和生化方面的改變，轉變成紅色的厚壁孢子，同時開始積累蝦青素[1-3]。

天然蝦青素消除自由基和抗氧化的能力非常強，所以逐漸受到市場的重視和喜愛。能夠對心腦血管疾病的治愈及術后修復產生積極的推動作用，在藥物、保養(yǎng)品、營養(yǎng)品等多個領域都有著廣闊的市場前景。而血球藻是生產天然蝦青素的最好的生物來源，具有非常高的經濟價值[3]。研究血球藻葉綠素熒光參數與蝦青素含量的關系少有報道。大量研究表明，對植物葉綠素熒光的分析結果一定程度上反映了其光合作用情況[4]，同時也可以反映其抵抗惡劣環(huán)境的能力。該方法測量速度較快且誤差小，能同時反映植物的生長狀態(tài)和光合作用情況[5-6]。

本次實驗旨在通過葉綠素熒光技術對血球藻的葉綠素熒光變化規(guī)律的研究，將不同的生長環(huán)境作為變量，以此來研究與蝦青素變化之間的關系，從而達到通過改變外界培養(yǎng)條件來優(yōu)化血球藻的生長以及提高蝦青素產量。

1材料和方法

1.1實驗藻種

雨生紅球藻(Haematoccuspluvialis192.80)，來源于湖北工業(yè)大學(輕工學部)微藻實驗室。

1.2微藻培養(yǎng)

實驗使用量程為600 mL的column管( Φ4 cm)和 BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度為(25±1)℃，光照強度為200 μmol/(m2·s)，保證充分光照，持續(xù)通氣培養(yǎng)，做好防止貼壁的措施。培養(yǎng)至對數生長期后離心收集綠色游動細胞，分別接入BG-11全培養(yǎng)基及無氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中接入BG-11無氮培養(yǎng)基的藻細胞在收集后用無氮培養(yǎng)基洗滌2次后接入，接種濃度OD550 nm(藻細胞在550 nm處的吸光度)設為0.2，每組分別設置4個平行。實驗周期為14 d。每天同一時間取樣，測量生長參數、葉綠素a、蝦青素和葉綠素熒光各項參數。

1.3實驗生長數據測量方法

1.3.1細胞計數細胞計數參考文獻[7]的方法，使用血球計數板在顯微鏡下進行。

1.3.2干重測量前，先將Whatman GF/C濾膜置于烘箱內，干燥；再置于干燥皿中，濾膜冷卻之后，稱量濾膜重量(m1)；精確量取藻液V藻液，使用稱重后的濾膜進行抽濾；將附著有藻細胞的濾膜再次置于烘箱內，干燥；隨后將濾膜置于干燥皿中，待濾膜完全冷卻之后，對其進行稱量(m2)。細胞干重

m=(m2-m1)×1000/V藻液

C2=C1×V2/V1

式中:C1表示上清液中葉綠素a的質量濃度，g/L；C2表示藻液中葉綠素a質量濃度，g/L；A666表示待測液中葉綠素a的吸光值；V1為藻液體積；V2為所用DMSO體積。

式中，C1表示上清液中蝦青素的濃度,g/L；C2表示藻液中蝦青素的濃度,g/L；A490表示待測液中蝦青素的吸光值；V1表示藻液體積；V2表示所用DMSO體積。

1.3.5蝦青素占干重體積分數蝦青素占干重體積分數為

1.4光化學效率及快速光響應曲線測定

葉綠素熒光參數用可調制式熒光儀(PAM-WATER-ED, Walz，德國)測定[10～11]。藻樣暗適應4 min，最大飽和脈沖設為4 000 μmol/(m2·s)，光系統(tǒng)II的最大光化學效率(Fv/Fm)，非光化學淬滅(NPQ分別計算如下：

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm

NPQ=(Fm-Fm′)/Fm

Fm:熒光最大值，經過暗適應后，光合機構中PSII的所有反應中心呈現(xiàn)完全關閉狀態(tài)下的熒光強度，此時所有的非光化學途徑都處于最小。Fo：熒光初始值，經過暗適應后，光合機構中PSII的所有反應中心呈現(xiàn)完全開放狀態(tài)下的熒光強度，這時所有的非光化學途徑都處于最小。

Fv：暗適應之后,非光化學途徑都處于最小時的最大可變熒光，F(xiàn)v=Fm-Fo。

快速光響應動力學曲線(Rapid Light Curve，RLC)的測定，參考White等(1999)的方法[12]，設定的光強梯度為0、141、217、320、489、730、1037、1441、2362 μmol/(m2s)，光適應時間設定為20 s。

1.5快速葉綠素熒光動力學曲線的測定(OJIP誘導曲線)

室溫下利用連續(xù)激發(fā)式熒光儀(Handy PEA，Hansatech，英國)獲得葉綠素熒光誘導曲線。藻樣暗適應時間4 min后，用Handy PEA按時檢測記錄實驗材料照射激發(fā)光后10 μs至2 s內不同時間的熒光信號。實驗材料經過一段時間暗適應后，再經過連續(xù)光照，葉綠素熒光強度隨著光照時間變化的熒光曲線中的快相部分(時間為1 s左右)為OJIP誘導曲線。作圖時，為了方便觀察J點和P點變化，一般將橫坐標(代表時間)改為對數坐標，得到典型的OJIP誘導曲線。

1.6數據統(tǒng)計與分析

用GraphPad Prism 5軟件作圖。所有實驗數據采用SPSS17.0軟件分別進行t檢驗(P<0.05視為兩者差異顯著)。

2實驗結果

2.1缺氮對血球藻生長的影響

根據圖1的描述，血球藻在缺氮條件下，細胞分裂停止并且蝦青素開始積累(圖1a、c、d)。接種后第3天，缺氮條件下藻細胞變成綠褐色不動狀態(tài)，氮充足條件下藻細胞仍然是綠色游動狀態(tài)；培養(yǎng)到第6 d，缺氮條件下藻細胞變?yōu)榧t色孢子狀態(tài)，氮充足條件下藻細胞仍然可以觀察到少量處于游動狀態(tài)。相對于氮充足，在缺氮條件下血球藻葉綠素a幾乎不增長(圖1b)。在全培養(yǎng)基的整個培養(yǎng)周期中,雨生紅球藻的生長較好, 當培養(yǎng)液中氮濃度逐漸消耗后, 所得到的最大細胞密度基本維持不變；缺氮時, 細胞密度基本維持穩(wěn)定(圖1a)。而在缺氮條件下，蝦青素積累明顯增加。培養(yǎng)14 d后，氮充足條件下單位體積的蝦青素含量是缺氮條件下的1.84倍。缺氮條件下，細胞密度顯著低于全培養(yǎng)基處理組(P<0.05)，而缺氮條件下蝦青素比干重比值顯著高于全培養(yǎng)基處理組(P<0.05)?？梢钥隙ǖ氖牵谌钡@一單一因素影響下，擾亂了細胞的光合作用、呼吸以及代謝作用。因此，細胞分裂被抑制而且蝦青素合成被激發(fā)。

圖1　血球藻在缺氮和氮充足條件下生長參數隨時間變化的曲線

2.2葉綠素熒光參數的測定

圖2為在缺氮條件下血球藻4個不同生長階段，葉綠素熒光參數的變化。 藻細胞光合作用活性可以通過葉綠素熒光參數反映出來，尤其是PSII最大光量子產量，即Fv/Fm，剛剛接種的對數期游動綠細胞的Fv/Fm值最高，說明綠色對數期藻細胞的PSII的最大光量子產量最大。血球藻生長到紅色孢子時期時，其Fv/Fm值下降了約12%(圖2a)。在缺氮條件下，血球藻整個培養(yǎng)周期中，ΦFPSII和rETR參數呈現(xiàn)出同樣的下降趨勢，在綠褐色不動細胞中達到最低，rETR下降了10%，隨后，rETR和Fv/Fm值均在紅色孢子中呈現(xiàn)上升趨勢 (圖2a、d)。而NPQ表示的是非光化學猝滅，即PSII天線色素在光合作用過程中吸收的光能無法用于光合電子的傳遞而是通過熱耗散的方式最終消耗掉，NPQ值從綠色游動細胞中的0.511上升到紅色孢子細胞中的0.824，并且在綠色不動細胞和紅色孢子細胞中較高(圖2a)。

GV為綠色游動細胞；GR為綠色不動細胞；OR為綠褐色不動細胞；RC為紅色孢子柱狀圖用平均值“±標準偏差”表示圖 2　血球藻在缺氮條件下不同生長階段的細胞中葉綠素熒光參數的測定

2.3快速葉綠素熒光誘導曲線(OJIP)

為研究缺氮對血球藻PSII電子傳遞途徑的影響，選取整個培養(yǎng)周期的第0天及第14天測定氮充足及缺氮情況下的快速葉綠素熒光誘導曲線。如圖3所示，血球藻細胞呈現(xiàn)出來的快速葉綠素熒光動力學曲線清晰反映出O、J、I、P相，與之前報道過的高等植物、藍藻及綠藻的快速葉綠素熒光動力學曲線相似。O-J-I-P熒光瞬間升高是由于PSII電子受體池的連續(xù)還原以及PSII的反應中心慢慢的關閉而導致的。J期被認為是電子從QA-到QB的積累，I期反映了電子從QA到QB-積累，P期代表電子從QA-到QB2-的積累[13]。圖3顯示在第0 d和第14 d時，缺氮條件下藻細胞J點的相對可變熒光值都高于氮充足條件下的，而且在第14 d時，兩種不同條件處理下的J點的相對可變熒光值都有所升高，但與加入DCMU的缺氮對照組相比要低很多。而加DCMU的缺氮對照組由于阻止了電子從QA-到QB的傳遞，導致電子在QA-大量堆積，呈現(xiàn)出熒光從O到J點的迅速上升。

(a)第0 d

(b)第14 d圖 3　缺氮和氮充足條件下血球藻的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線

3討論

以上相關數據顯示，缺氮嚴重影響血球藻細胞的正常生長與光合作用。N源是血球藻生長所必須的營養(yǎng)物質，在缺氮條件下血球藻的生長速度遠小于氮充足條件下，蝦青素比干重比值雖增加，但是生物量卻增長緩慢，導致單位體積蝦青素的增長低于氮充足條件下的值。這一結果與苗鳳萍等學者[14]的研究結果基本相同。通過對實驗中快速葉綠素熒光動力學曲線的研究，可以發(fā)現(xiàn)缺氮對血球藻PSII途徑的影響顯著。在缺氮條件下，血球藻的光合作用能力明顯受到影響，表現(xiàn)在光量子產量和電子傳遞速率下降等方面。由于缺氮導致藻細胞細胞代謝以及合成捕光色素所需要的酶合成不足，缺氮還會導致藻細胞PSII反應活性中心蛋白合成受阻，從而導致其PSII反應活性中心受到嚴重損傷[15]。到培養(yǎng)后期，通過分析4種不同的狀態(tài)，血球藻光合作用能力的下降，表現(xiàn)在Fv/Fm值的下降，而非光化學猝滅NPQ明顯上升，說明缺氮條件下血球藻光化學耗散下降，大部分過多的激發(fā)能耗散。而在紅色孢子細胞中，NPQ值要顯著高于綠色游動細胞。正是由于其熱耗散能力較高，紅色孢子細胞對PSII的光合活性一定程度上起到了保護作用,跟研究報道的類胡蘿卜素含量與細胞的生理狀態(tài)和光化學活性有相關性的報道基本相符[16-17]。

綜上所述，缺氮能影響血球藻的PSII光化學反應活性，影響蝦青素的產率，本研究為在缺氮條件下血球藻生長規(guī)律提供一定的理論依據，為優(yōu)化生長條件并提高蝦青素產率提供相關的參考信息。在后續(xù)研究中，將進一步觀察在不同脅迫條件下血球藻生長、蝦青素積累及葉綠素熒光變化規(guī)律的情況。

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[責任編校： 張眾]

Effects of Nitrogen Deficiency on Haematococcus Pluvialis PhotosystemII Photochemical Changes and Changes of Astaxanthin

LI Jinxun1, XU Siyuan2, JIN Wei2

(1InstituteofLightIndustry,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China;2EnvironmentalManagementCollegeofChina,Qinhuangdao066000，China)

Abstract：Haematococcus pluvialis, as a freshwater unicellular green algae, consisting of considerable content of astaxanthin is the mainly natural materials for astaxanthin extraction. In this study, typical Haematococcus pluvialis named 192.80 was chosen to investigate the relationship between the variation of photosystem II (PSII) and the accumulation of astaxanthin under the condition of nitrogen starvation. The results shown that FPSII (Fv/Fm) decreased to the initial of 80%, then increased slowly, while rETR increased up to a maximum value and then decreased. Meanwhile, the results also indicated that either relative content of Chlorophyll, astaxanthin content or cell density under nitrogen starvation condition was significantly lower than that nitrogen sufficiency condition. On the contrary, the radio of astaxanthin and dry weight was obviously improved with the consumption of nitrogen nutrition, which represented the special protection mechanism of Haematococcus pluvialis for the response of nitrogen starvation.

Keywords：Haematococcus pluvialis; astaxanthin; PSII; Fv/Fm; nitrogen starvation

[收稿日期]2015-12-22

[基金項目]科技部863計劃(2014AA022000)

[作者簡介]李金洵(1989-)， 女，湖北石首人，湖北工業(yè)大學碩士研究生，研究方向為化學工程與工藝

[文章編號]1003-4684(2016)02-00111-03

[中圖分類號]Q945

[文獻標識碼]：A