彭桂瑩,陳永玲,韓玉珍,張庭廷(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽省皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 蕪湖 241000)

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乳酸對銅綠微囊藻的抑藻效應(yīng)及機理

彭桂瑩,陳永玲,韓玉珍,張庭廷*(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽省皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 蕪湖 241000)

摘要：以銅綠微囊藻為實驗對象,研究了乳酸對銅綠微囊藻的抑藻效果及可能的抑藻機理.結(jié)果表明乳酸對銅綠微囊藻的生長有很強的抑制作用,72h,除最低濃度實驗組對銅綠微囊藻的抑制率為60%外,其余濃度實驗組的抑制率均達到了80%以上;在乳酸脅迫下,藻液中核酸和蛋白質(zhì)含量增加,電導(dǎo)率上升,細胞中丙二醛(MDA)和氧自由基(O2?)含量增加,超氧化物歧化酶(SOD)活性下降;透射電鏡圖片顯示,細胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變.推測乳酸可能的抑藻機理是改變了藻細胞膜的通透性及其細胞結(jié)構(gòu),降低了其抗氧化能力,最終使得藻細胞裂解死亡.

關(guān)鍵詞：乳酸；銅綠微囊藻；抑藻效應(yīng)；抑制機理

* 責(zé)任作者, 教授, cyhztt@mail.ahnu.edu.cn

水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象,已成為日益嚴重的全球性水環(huán)境污染問題之一[1].目前,利用天然植物產(chǎn)生的次生代謝物進行抑藻是環(huán)境領(lǐng)域研究的熱點.如沉水植物穗花狐尾藻分泌的焦性沒食子酸被認為是一種抑藻效應(yīng)較強的化感物質(zhì)[2],而Zhang等[3]從普生輪藻中分離到的亞油酸等也同樣表現(xiàn)出非常好的抑藻作用;張庭廷等[4]對17種不同結(jié)構(gòu)脂肪酸的抑藻效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)所有脂肪酸均有不同程度的抑藻作用.但脂肪酸和酚酸類化感物質(zhì)在應(yīng)用時有一個重要的瓶頸,即難溶問題,因此,尋找那些易于溶解且具有良好抑藻效果的天然低毒或無毒代謝物進行藍藻水華的防治就顯得異常重要.

乳酸(2-羥基丙酸)是某些植物無氧呼吸的代謝產(chǎn)物,已有相關(guān)報道認為乳酸是一些植物的化感成分之一,如Xian等[5]分析3種沉水植物分泌的化感物質(zhì)成分時,在金魚藻、黑藻和苦草的水培液中都檢測到了含量相對較高的乳酸;王紅強等[6]也從伊樂藻的水浸提液中檢測到了乳酸成分.此外,乳酸可作為食品添加劑、防腐劑,且無異味,能與水任意互溶,可以方便地直接投入水體使用.因此,采用乳酸進行抑藻不僅具有較好的生態(tài)安全性且使用方便,易于操作,具有較高的可行性.

為此,本研究利用單純的天然產(chǎn)物乳酸對水華最常見的藍藻—銅綠微囊藻進行抑藻實驗并測定了其抑藻機理,力求為富營養(yǎng)化水體藍藻水華防治提供新的研究思路和有用參考.

1　材料與方法

1.1 實驗材料

銅綠微囊藻PCC7806(Microcystis aeruginosa PCC7806) 購自中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫,采用BG-11培養(yǎng)基進行培養(yǎng).培養(yǎng)條件為4000lx 的光照強度,光暗比為12h:12h,溫度為(25±1)℃.實驗前一周,銅綠微囊藻進行擴大培養(yǎng),使得細胞進入對數(shù)生長期.

乳酸為分析純,含量99%,購自于上海國藥集團.

1.2 實驗儀器

超凈工作臺;Motic數(shù)碼顯微鏡;血球計數(shù)板;光照培養(yǎng)箱PGX-250B;離心機;TGL-16G冷凍離心機;721型分光光度計等,Jeol 1230透射電鏡. 1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸對銅綠微囊藻的抑藻實驗 根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果,在已滅菌的錐形瓶中(250mL)加入銅綠微囊藻藻液100mL,藻的初始密度為1.3× 106cells/mL,然后向其中加入一定量的乳酸,乳酸設(shè)置5個濃度梯度,分別為12.5,25.0,50.0,100.0, 200.0μL/L(由于加入的乳酸量非常小,對藻液的密度幾乎沒有影響,故其體積可以忽略不計).另外設(shè)置不含乳酸的空白對照組,各實驗組與對照組均3個平行,置于1.1相同條件下培養(yǎng).

通過血球計數(shù)板對藻細胞進行計數(shù)來反映乳酸對銅綠微囊藻生長的影響,每24h計數(shù)一次,統(tǒng)計至96h.

通過藻細胞密度計算出乳酸對銅綠微囊藻的百分抑制率(Inhibition Ratio).抑制率的計算公式為:

式中:IR表示抑制率;N表示處理組的銅綠微囊藻的藻密度,cells/mL;N0表示對照組的銅綠微囊藻的藻密度,cells/mL.

1.3.2 乳酸對銅綠微囊藻的部分抑制機理研究及相關(guān)參數(shù)的測定 根據(jù)1.3.1的抑藻結(jié)果,對機理的測定,設(shè)置了4個乳酸濃度梯度,分別為12.5,25.0,50.0,100.0μL/L,其他處理方法同上,初始藻密度為5.35×106cells/mL.24h后測定各種機理參數(shù),此后每隔48h測定一次,總共測定3次.

細胞膜通透性通過測定細胞外液電導(dǎo)率、OD260、OD280變化[7]來反映.OD260反映的是藻液中核酸的含量;OD280反映的是藻液中蛋白質(zhì)的含量.

參照Health等[8]硫代巴比妥酸TBA比色法測定丙二醛(MDA)含量.丙二醛是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物,其含量可以反映細胞遭受逆境傷害的程度.實驗時分別測定反應(yīng)產(chǎn)物在不同光波長處的吸光值,計算丙二醛的濃度和含量.

超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定參考修改的Stewert等[9]的方法.SOD是普遍存在于生物體內(nèi)的一種清除超氧陰離子自由基的酶.通過測定反應(yīng)后反應(yīng)液在560nm處的吸光值,計算出酶活性的大小.

藻細胞超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡分析:于實驗第3d收集銅綠微囊藻,離心,棄上清,0.1mol/L PBS清洗2次.加2.5%戊二醛過夜固定后,用0.1mol/L PBS清洗2次,再經(jīng)1%鋨酸后固定5h,0.1mol/L PBS清洗數(shù)次后,丙酮梯度濃度脫水,Epon812 樹脂梯度浸透包埋,在60℃恒溫箱聚合成包埋塊, 在Leica UC6超薄切片機上切片,切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后在Jeol 1230透射電鏡上觀察拍照(透射電鏡分析由上海釜誠生物科技有限公司協(xié)助完成).

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0和Excel 2010軟件處理,對組間數(shù)據(jù)的差異進行多重比較分析,大寫字母表示P<0.01,說明有極顯著性差異;小寫字母表示P<0.05,說明有顯著性差異.

2　結(jié)果與分析

2.1 乳酸對銅綠微囊藻生長的影響

由表1可知,乳酸對銅綠微囊藻的抑制率隨著乳酸濃度的增加而增大;同一濃度下,隨著處理時間的加長而增大.除去最低濃度處理組,其余濃度的處理組抑制率在第72h后均超過了80%,在第96h后均超過了90%,最大乳酸濃度(200.0μL/L)組,在第96h抑制率可以達到99.58%,接近100%.由此可以看出,乳酸對銅綠微囊藻有很好的抑制作用.

表2中數(shù)據(jù)顯示的是對不同處理時間所得的數(shù)據(jù)進行的Pearson相關(guān)性分析.可以看到表中大多數(shù)據(jù)的R≥0.8, P≤0.05.由此可以表明乳酸濃度與抑制效果呈正相關(guān),即乳酸濃度越大,抑制率越大.

表1　乳酸對銅綠微囊藻的抑制率Table 1　The Inhibition ratio of lactic acid on M.aeruginosa

表2　乳酸濃度與抑制率的相關(guān)性Table 2　The correlation between lactic acid concentration and inhibition ratios

2.2 乳酸對銅綠微囊藻的抑制機理

表3　乳酸對銅綠微囊藻藻液核酸含量的影響Table 3　The effect of lactic acid on nucleic acid contents in the supernatant of M.aeruginosa

表4　乳酸對對銅綠微囊藻藻液蛋白質(zhì)含量的影響Table 4　The effect of lactic acid on protein contents in the supernatant of M.aeruginosa

2.2.1 乳酸對銅綠微囊藻細胞膜通透性的影響 表3、表4和圖1分別顯示的是銅綠微囊藻藻液中核酸含量(OD260)、蛋白質(zhì)含量(OD280)以及電導(dǎo)率的變化.可以看出,對照組中核酸和蛋白質(zhì)含量基本保持穩(wěn)定,而各處理組藻液中核酸含量和蛋白質(zhì)含量都隨著乳酸濃度的增大而增加,且隨著處理時間的加長而增加.50.0,100.0μL/L處理組在120h時核酸含量和蛋白質(zhì)含量增加的幅度較兩個低濃度組較小,但較之前仍在增加,且核酸和蛋白質(zhì)含量在各組間的差異基本上都已經(jīng)達到了顯著性差異(P<0.05).電導(dǎo)率變化趨勢與OD260、OD280的變化趨勢基本相似.這些參數(shù)變化的可能原因是乳酸損傷了銅綠微囊藻的藻細胞膜,使得細胞膜的通透性發(fā)生了改變,細胞中的核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生外滲,從而OD260、OD280的值增大;細胞內(nèi)小分子物質(zhì)外滲,從而電導(dǎo)率升高.

圖1　乳酸對銅綠微囊藻藻液電導(dǎo)率的影響Fig.1　The effect of lactic acid on conductivity in the supernatant of M.aeruginosa不同小寫字母表示組間比較P<0.05;不同大寫字母表示組間比較P<0.01

圖2　乳酸對銅綠微囊藻MDA含量的影響Fig.2　The effect of lactic acid on MDA contents of M.aeruginosa不同小寫字母表示組間比較P<0.05;不同大寫字母表示組間比較P<0.01

2.2.2 乳酸對銅綠微囊藻MDA含量的影響 從圖2可以看出,對照組的MDA含量基本保持不變,而實驗組MDA含量隨乳酸濃度的增加而上升,隨著處理時間的加長而增高.同時可以看出,各個濃度組之間的差異也比較顯著(P< 0.05),個別組之間的差異甚至達到了極顯著性(P<0.01). MDA含量的這種變化可能是因為在乳酸的脅迫作用下,銅綠微囊藻細胞膜脂質(zhì)過氧化程度加劇,造成了MDA的積累.

含量在逐漸增加,72h時,各濃度組之間的差異基本上都表現(xiàn)為極顯著性差異(P<0.01).表明藻細胞受到乳酸脅迫后細胞膜脂質(zhì)過氧化增加,導(dǎo)致細胞內(nèi)含量上升,這與MDA含量上升是一致的.

圖3　乳酸對銅綠微囊藻O2?含量的影響Fig.3　The effect of lactic acid on O2? contents of M.aeruginosa不同小寫字母表示組間比較P<0.05;不同大寫字母表示組間比較P<0.01

2.2.4 乳酸對銅綠微囊藻SOD活性的影響 由圖4可知,對照組銅綠微囊藻細胞內(nèi)的SOD活性基本保持不變,而實驗組中,隨著乳酸濃度的增加,銅綠微囊藻細胞內(nèi)的SOD活性均呈下降的趨勢.最大濃度組(100.0μL/L)在24h時就已經(jīng)表現(xiàn)出SOD總活性相對于對照組有較大的下降幅度,而其它幾個較低濃度組此時的SOD總活性相對于對照組還未顯示出較大差異,但隨著時間的延長,其活性也逐漸低于對照組.當(dāng)藻細胞受到乳酸脅迫時,細胞內(nèi)氧自由基濃度上升,而SOD具有清除細胞內(nèi)自由基的作用,抗氧化體系酶活性理應(yīng)也會隨之上升,而本實驗中SOD活性下降的可能原因是乳酸對藻細胞的協(xié)迫作用比較強烈,大多數(shù)藻細胞還來不及產(chǎn)生相應(yīng)的生理應(yīng)對措施就已經(jīng)死亡(這與乳酸對銅綠微囊藻抑制率大小的影響結(jié)果2.1相吻合),導(dǎo)致總的蛋白質(zhì)合成量減少,抗氧化酶系統(tǒng)的總活性降低,故呈現(xiàn)下降趨勢.

圖4　乳酸對銅綠微囊藻SOD活性的影響Fig.4　The effect of lactic acid on SOD activity of M.aeruginosa

圖5　乳酸對銅綠微囊藻細胞結(jié)構(gòu)的影響Fig.5　The effect of lactic acid on cell structure of M.aeruginosaa為對照組,b、c、d、e依次為乳酸12.5,25.0,50.0,100.0μL/L濃度組

2.2.5 乳酸對銅綠微囊超微結(jié)構(gòu)的影響 由圖5可看出乳酸對銅綠微囊藻細胞超微結(jié)構(gòu)破壞明顯,圖5a是對照組,其細胞壁完整,膠質(zhì)鞘厚,類囊體清晰,排列整齊;而圖5b類囊體開始彎曲,排列不整齊,膠質(zhì)鞘消失,但整個細胞形態(tài)完整,未出現(xiàn)偽空泡;圖5c藻細胞破壞進一步加劇,類囊體分散,細胞內(nèi)出現(xiàn)大的偽空泡;圖5d和圖5e細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)混亂,結(jié)構(gòu)破壞,細胞不完整.可見隨著乳酸用量的加大,在作用相同時間內(nèi),細胞破壞程度明顯加重.

2.3 討論

利用植物的化感作用進行抑藻已是環(huán)境領(lǐng)域研究者的共識,而植物化感抑藻的原理主要是植物分泌釋放的一些化感物質(zhì)在起作用.植物產(chǎn)生的化感物質(zhì),主要是一些次生代謝產(chǎn)物,它的種類很多,其中相當(dāng)一部分已被分離鑒定,主要有脂肪酸、有機酸、萜類及酚類物質(zhì)[11-13]等.不少化感物質(zhì)和相關(guān)機理已被研究[14-16].乳酸也被證實為某些植物,如金魚藻[6],所分泌的化感物質(zhì)之一,并且他有著優(yōu)于其他大多數(shù)化感物質(zhì)所不具備的物理性質(zhì).

植物化感物質(zhì)抑藻的機理往往根據(jù)化感物質(zhì)種類的不同而不同[17],且往往同一種物質(zhì)作用的機理不止一種,而是多種方式共同起作用的.如化感物質(zhì)可以使葉綠素a的含量減少[18],破環(huán)藻的光合系統(tǒng);破環(huán)細胞膜的結(jié)構(gòu)[19],導(dǎo)致膜的完整性喪失;影響細胞內(nèi)酶的活性[20],從而使其正常生理功能改變;破環(huán)細胞的超微結(jié)構(gòu)[19]以及影響細胞內(nèi)基因的表達[21]等.

本實驗中乳酸的抑藻結(jié)果表明,較低濃度時的乳酸即可抑制銅綠微囊藻的生長,抑藻效果明顯.乳酸抑藻部分機理方面的研究顯示,OD260、OD280、電導(dǎo)率的值隨著乳酸濃度的增加而增大,說明藻細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)外滲,表明藻細胞膜在乳酸作用下通透性發(fā)生了改變;和MDA隨著乳酸濃度的增加而增大,揭示出乳酸使銅綠微囊藻細胞膜脂質(zhì)過氧化程度加劇;SOD活性下降表明藻細胞的抗氧化酶系統(tǒng)的總活性降低,應(yīng)激能力下降而死亡;透射電鏡圖片顯示,細胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變.這些測定結(jié)果符合上述的化感物質(zhì)作用機理中的幾種.由此推測乳酸可能的抑藻機理是改變了藻細胞膜的通透性及其細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),降低了其抗氧化能力,最終使得藻細胞裂解死亡.由于本實驗只研究了乳酸可能的抑藻機理中的一部分,那么乳酸抑藻是否同時還存在其它的機制呢?比如上述機制中對基因表達的影響,對光和系統(tǒng)的破壞?這仍需進一步的研究與探索.

乳酸作為植物的化感物質(zhì)之一,對生態(tài)有著較好的安全性[22],且使用起來較方便,可以直接噴灑乳酸進入污染水體進行銅綠微囊藻的清除.該成果可為富營養(yǎng)化水體藍藻水華治理和抑藻劑的開發(fā)提供有力材料和有用參考.

3　結(jié)論

3.1 乳酸對銅綠微囊藻的生長有很強的抑制作用,且抑制效果與乳酸濃度成正相關(guān).

3.2 乳酸可能的抑藻機理是改變了藻細胞膜的通透性及其細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),降低了其抗氧化能力,最終使得藻細胞裂解死亡.

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The inhibitory effect of lactic acid on Microcystis aeruginosa and its mechanisms.

PENG Gui-ying, CHEN Yong-ling, HAN Yu-zhen, ZHANG Ting-ting*(Collaborative Innovation Center of Recovery and Reconstruction of Degraded Ecosystem in Wanjiang City Belt, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China). China Environmental Science, 2016,36(4)：1167～1172

Abstract：The inhibitory effect and possible inhibitory mechanisms of lactic acid on M. aeruginosa were studied. The results showed that lactic acid had a strong inhibiting effect on the growth of M. aeruginosa, 72h, except the inhibition rate of experimental group in lowest concentration was 60%, the rest inhibition rate of experimental group were reached more than 80%; under the stress of lactic acid, the contents of nucleic acid and protein, the electrical conductivity (EC) in M. aeruginosa supernatant all increased, the contents of malondialdehyde (MDA) and oxygen free radical (O2?) of M. aeruginosa cells enhanced, the activity of superoxide dismutase (SOD) decreased, and transmission electron microscope photographs showed that ultrastructure of M. aeruginosa cells had changed obviously. All the results indicated that the possible inhibiting mechanisms were that lactic acid changed the permeability of M. aeruginosa membrane and the cell structure, decreased its antioxidant capacity, and caused the crack and death of the cell in the end.

Key words：lactic acid；Microcystis aeruginosa；inhibitory effect；inhibitory mechanism

作者簡介：彭桂瑩(1990-),女,安徽東至人,碩士研究生,主要研究方向為水域生態(tài)學(xué).

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(31170443)

收稿日期：2015-09-10

中圖分類號：X503

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)04-1167-06