周石磊,黃廷林,張春華,白士遠(yuǎn),何秀秀 (西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710055)

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基于Miseq的好氧反硝化菌源水脫氮的種群演變

周石磊,黃廷林*,張春華,白士遠(yuǎn),何秀秀 (西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710055)

摘要：為了研究好氧反硝化菌源水脫氮過(guò)程中水體微生物群落的演變,利用Miseq高通量測(cè)序法對(duì)投菌和對(duì)照兩系統(tǒng)水體樣本的微生物信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并對(duì)兩組樣品進(jìn)行了優(yōu)化序列統(tǒng)計(jì),OTU分布統(tǒng)計(jì)和分類學(xué)分析的基礎(chǔ)分析;以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),PCA,Rank-Abundance, Hcluster, Specaccum和OTU分布的高級(jí)分析.結(jié)果顯示,投加貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌的源水系統(tǒng)的氮素得到有效去除,脫氮效果明顯;層次聚類和主成分分析顯示兩系統(tǒng)內(nèi)的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,投菌系統(tǒng)與對(duì)照系統(tǒng)主要表現(xiàn)為變形菌和擬桿菌門(mén);細(xì)菌主要門(mén)類和水質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性分析得出,水質(zhì)指標(biāo)對(duì)兩系統(tǒng)群落變化作用明顯;與此同時(shí),投菌系統(tǒng)中有關(guān)氮循環(huán)的細(xì)菌有上升的變化過(guò)程. Miseq高通量測(cè)序研究源水脫氮過(guò)程的微生物種群演變可行,為研究原位生物脫氮過(guò)程的水體微生物群落演變提供技術(shù)支撐.

關(guān)鍵詞：源水脫氮；好氧反硝化；Miseq測(cè)序；生物信息分析；微生物群落

? 責(zé)任作者, 教授, huangtinglin@xauat.edu.cn

20世紀(jì)80年代,Robertson等[1]在除硫和反硝化處理系統(tǒng)中首次分離了好氧反硝化菌(Thiosphaera pantotropha),這種新型脫氮生物的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)氮循環(huán)又有了新的認(rèn)識(shí).好氧反硝化菌[2]是在有氧條件下,利用好氧反硝化酶進(jìn)行反硝化作用的一類脫氮菌.它的發(fā)現(xiàn)打破了反硝化只能在厭氧缺氧條件下進(jìn)行的傳統(tǒng)反硝化的觀念,為新型生物脫氮提供了新思路.目前所分離的好氧反硝化菌主要分布于假單胞菌屬(Pseudomonas)[3]、芽孢桿菌屬(Bacillus)[4-5]、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)[6-7]、微枝桿菌屬(Microvirgula)[8-9]和叢毛單胞菌屬(Comamonas)[10-11].目前大多數(shù)關(guān)于好氧反硝化菌的研究集中在實(shí)驗(yàn)室富營(yíng)養(yǎng)配水培養(yǎng)條件下以及污廢水條件下的脫氮特性分析.如, 張培玉等[12]在富營(yíng)養(yǎng)條件下(初始氮素109mg/L,COD 約2000mg/L)研究好氧反硝化菌假單胞菌qy37的脫氮特性;于愛(ài)茸等[13]分離的芽孢桿菌W2具有獨(dú)特的好氧反硝化作用,0.067hm2魚(yú)塘投入1Kg的該菌就能完全解決除氮問(wèn)題;Joo等[14]使用Alcaligenes faecalis 處理豬場(chǎng)廢水,總氮去除率高于65%;Bouchez等[15]將Microvirgula aerodenitrificans包埋于藻朊酸鹽中,投加于傳統(tǒng)硝化反應(yīng)器中,用于市政廢水處理,HN-AD脫氮率達(dá)26.8%;汪蘋(píng)等[16]在高濃度硝氮的富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基條件下研究叢毛單胞菌WXZ-17的反硝化特性,初始硝氮為92mg/L培養(yǎng)4d后硝氮去除率達(dá)到61%.

然而,針對(duì)微污染水源水體的貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌的分離鑒定及其脫氮特性的研究很少.對(duì)于好氧反硝化菌進(jìn)行源水脫氮過(guò)程中,微生物種群的演變更鮮有報(bào)道.1979年Kuznetsov等[17]提出寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌的概念,并定義第一次培養(yǎng)時(shí)能在含碳1～15mg/L培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌稱為寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌,能同時(shí)在貧營(yíng)養(yǎng)和富營(yíng)養(yǎng)基中生長(zhǎng)的稱為兼性寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌.Wainwright等[18]和Button等[19]研究表明,貧營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)碳的親和力較大,在低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中,具有較大的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì).結(jié)合本課題組之前關(guān)于貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌的研究[20-23],通過(guò)從微污染水體水庫(kù)底層沉積物中富集、馴化、分離出一批貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌,并通過(guò)對(duì)這些貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌進(jìn)行源水梯度馴化,使其適應(yīng)貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境. 源水馴化完成后接種到微污染源水環(huán)境下,考察其在低氮微污染水體下的脫氮特性.

近年來(lái),應(yīng)用分子生物學(xué)手段來(lái)研究微生物群落結(jié)構(gòu)變化成為熱點(diǎn),如白玉濤等[24]應(yīng)用末端限制性片段技術(shù)對(duì)反硝化和甲烷氧化細(xì)菌的群落進(jìn)行分析;黨巖等[25]應(yīng)用克隆文庫(kù)對(duì)應(yīng)用EGSB 處理垃圾焚燒滲瀝液的微生物群落變化進(jìn)行研究;郭建寧等[26]應(yīng)用HiSeq 2000建Illumina測(cè)序文庫(kù)對(duì)臭氧/陶瓷膜對(duì)生物活性炭工藝的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.第2代高通量測(cè)序技術(shù)Illumina MiSeq以Illumina的邊合成邊測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ),具有快速準(zhǔn)確的分析特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析[27-28].結(jié)合該源水投菌實(shí)驗(yàn)已發(fā)表的關(guān)于氮素以及有機(jī)物變化特性[29],本文主要針對(duì)在靜態(tài)源水條件下,應(yīng)用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)兩系統(tǒng)的起始、過(guò)程以及結(jié)束3個(gè)階段的水樣進(jìn)行分析,來(lái)考察投菌系統(tǒng)在源水脫氮過(guò)程中的微生物群落演變過(guò)程.為以后分析原位生物強(qiáng)化水源水體過(guò)程中對(duì)水體微生物群落影響提供技術(shù)支撐.

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置為20L的玻璃瓶,外壁附有黑色塑料袋來(lái)模擬水庫(kù)的黑暗環(huán)境.取山東周村水庫(kù)源水(2013年8月)并通過(guò)充氧泵的間歇曝氣來(lái)控制反應(yīng)器的溶解氧,實(shí)驗(yàn)的溫度為室溫.經(jīng)梯度馴化好的三株貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌Zoogloea sp. N299 (GenBank登錄號(hào),KP717093)[29], Acinetobacter sp. G107 (GenBank登錄號(hào), KP717096)[29]和Acinetobacter sp. 81Y (GenBank登錄號(hào),KP717097)[29]分別以體積比2mL/20L.活化后菌液的好氧反硝化菌的菌密度達(dá)到106cfu/mL.通過(guò)測(cè)定反應(yīng)器水樣中NO3--N, NO2--N,TN,COD和好氧反硝化菌菌落數(shù)來(lái)反應(yīng)投菌的源水實(shí)驗(yàn)效果. NO3--N,NO2--N和TN每5d一測(cè);菌落數(shù)為10d一測(cè).實(shí)驗(yàn)裝置示意如圖1所示.

圖1　源水實(shí)驗(yàn)裝置示意Fig.1　The schematic diagram of experiment system

1.2 微生物多樣性分析

1.2.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增 在進(jìn)行投加貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌源水生物脫氮實(shí)驗(yàn)的初始階段(0d),中間階段(30d),結(jié)束階段(60d).共3次從投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)分別取1L的水樣經(jīng)0.22μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾,以備提取DNA.將投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)的水樣濾膜利用水樣DNA提取試劑盒完成基因組DNA的抽提(美吉生物,上海).抽提DNA的含量和質(zhì)量采用分光光度法進(jìn)行檢驗(yàn).PCR擴(kuò)增區(qū)域選擇樣本16S rRNA基因的V1～V3區(qū)域,合成帶有barcode的特異引物.全部樣本按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行,每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù),將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris_HCl洗脫; 2%瓊脂糖電泳檢測(cè).參照電泳初步定量結(jié)果, 將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量,之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求,進(jìn)行相應(yīng)比例的混合.

1.2.2 Miseq文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序 應(yīng)用新一代高通量測(cè)序平臺(tái)Miseq對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序.Miseq文庫(kù)構(gòu)建: (1)連接“Y”字形接頭; (2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段; (3)利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集; (4)氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段. Miseq測(cè)序:(1)DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ),固定在芯片上; (2)另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ),也被固定住,形成“橋 (bridge)” ; (3)PCR擴(kuò)增,產(chǎn)生DNA簇; (4)DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈; (5)加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP,每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基; (6)用激光掃描反應(yīng)板表面,讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類; (7)將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割,恢復(fù)3'端粘性,繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸; 統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果,獲知模板DNA片段的序列.

1.2.3 生物多樣性與分類學(xué)分析 將Miseq測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾,區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析,基于OTU可以進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析[30],基于OTU聚類分析結(jié)果,可以對(duì)OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析,以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè);基于分類學(xué)信息,可以在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析[31].在上述分析的基礎(chǔ)上,可以進(jìn)行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析[30,32-33].

1.3 水質(zhì)分析方法

水質(zhì)指標(biāo)NO3--N,NO2--N和TN采用分光光度計(jì)測(cè)定[34].具體如下, NO3--N采用紫外分光光度法, NO2--N為N-(1-奈基)-乙二胺光度法, TN為過(guò)硫酸鉀氧化-紫外分光光度法.好氧反硝化菌菌落數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法[29,35].NO3--N, NO2--N的水樣預(yù)處理為進(jìn)過(guò)0.45μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾.醋酸纖維濾膜經(jīng)過(guò)超純水的3次煮沸,每次沸騰半小時(shí)去除雜質(zhì).

2　結(jié)果與討論

2.1 源水脫氮效果分析

結(jié)合之前研究結(jié)果[29]如下圖2所示,在溫度為20～27℃,DO在3～7mg/L條件下,通過(guò)60d的源水實(shí)驗(yàn),投菌系統(tǒng)的NO3--N從初始的(1.57± 0.02)mg/L下降到(0.42±0.01)mg/L,對(duì)照系統(tǒng)的NO3--N由(1.63±0.02)mg/L下降到(1.30± 0.01)mg/L;兩系統(tǒng)都沒(méi)有NO2--N的積累;投菌系統(tǒng)的TN從初始(2.31±0.12)mg/L下降到(1.09± 0.01)mg/L,對(duì)照系統(tǒng)的TN從(2.51±0.13)mg/L下降到(1.72±0.06) mg/L;投菌系統(tǒng)的好氧反硝化菌菌落數(shù)從初始的2.8×104上升到2×107cfu/mL,對(duì)照系統(tǒng)從7.75×103到5.5×105cfu/mL.結(jié)果表明投加好氧反硝化菌可以實(shí)現(xiàn)源水脫氮.

2.2 微生物多樣性分析

通過(guò)對(duì)投菌和對(duì)照兩系統(tǒng)3個(gè)時(shí)期取樣的樣品16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序,在實(shí)驗(yàn)初始階段投菌系統(tǒng)樣品和對(duì)照系統(tǒng)樣品各獲得了22412 和19776條有效序列,序列平均長(zhǎng)度315bp;中間過(guò)渡階段投菌系統(tǒng)樣品和對(duì)照系統(tǒng)樣品各獲得了21433和27171條有效序列,序列平均長(zhǎng)度318bp;結(jié)束階段投菌系統(tǒng)樣品和對(duì)照系統(tǒng)樣品各獲得了25475和16483條有效序列,序列平均長(zhǎng)度317bp.通過(guò)Rank-abundance曲線(等級(jí)-多度曲線)[36],考察源水投菌實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)菌的物種豐度和物種均勻度.

圖2　源水實(shí)驗(yàn)中氮素及好氧反硝化菌的變化情況Fig.2　The changes of nitrogen concentrations and aerobic denitrification bacteria in source water experiment

圖3　源水實(shí)驗(yàn)的等級(jí)-多度曲線Fig.3　The rank-abundance curve of source water experiment

圖3中展示的為源水實(shí)驗(yàn)過(guò)程中投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)的Rank-abundance的變化情況.在水平方向,曲線的寬度來(lái)反映物種的豐富度,寬度越大表示豐富度越高;曲線形狀的平滑程度反映樣本中物種的均度,曲線越平緩說(shuō)明物種分布越均勻.投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)從源水實(shí)驗(yàn)的開(kāi)始階段到結(jié)束階段,細(xì)菌種群的豐富度逐漸減小.然而,源水投菌系統(tǒng)的Rank-abundance逐漸變陡峭,表示物種均度隨時(shí)間變得不均勻;對(duì)照系統(tǒng)的物種均度變化不明顯.

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組分

將源水實(shí)驗(yàn)的投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)共6個(gè)點(diǎn)的樣本,共116572個(gè)OTU進(jìn)行注釋,然后統(tǒng)計(jì)在屬類別上的構(gòu)成形成柱狀圖(圖4),同時(shí)分析在各個(gè)水平上的菌群結(jié)構(gòu).結(jié)果顯示這116572個(gè) OTU主要屬于7個(gè)門(mén)類44個(gè)屬,具體結(jié)果如圖4和表1所示.

圖4　源水實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組分Fig.4　The bacterial community during the water of bacteria and control experimental systems

兩系統(tǒng)的OUT主要屬于7個(gè)門(mén)類,分別是變形菌門(mén)(Protebacterice)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、裝甲菌門(mén)(Armatimonadetes)和其他少數(shù)細(xì)菌門(mén)類,其中主要的細(xì)菌門(mén)類為變形菌門(mén).對(duì)照系統(tǒng)和投菌系統(tǒng)的變形菌門(mén)從開(kāi)始的32.83%和39.02%上升到實(shí)驗(yàn)中間階段的87.55%和86.24%,到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)變?yōu)?3.05%和94.97%.結(jié)果顯示,在源水脫氮過(guò)程中,對(duì)照和投菌兩系統(tǒng)的細(xì)菌菌落在門(mén)的類別上變化相差不大.在變形菌門(mén)類中對(duì)照和投菌兩系統(tǒng)在α-變形菌和β-變形菌變化較大.其中,對(duì)照系統(tǒng)中α-變形菌呈現(xiàn)上升趨勢(shì),從開(kāi)始階段的12.48%到中間階段的18.27%,最后到31.05%;投菌系統(tǒng)中α-變形菌呈現(xiàn)下降趨勢(shì),從開(kāi)始階段的19.12%到中間階段的11.16%,最后到7.56%.而兩系統(tǒng)中β-變形菌都是上升趨勢(shì),對(duì)照和投菌系統(tǒng)從開(kāi)始的19.20%和18.53%上升到實(shí)驗(yàn)中間階段的49.80%和86.39%.其他類的變形菌變化不大.

在源水脫氮實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)照和投菌兩系統(tǒng)的細(xì)菌群落分析得出44個(gè)屬. 投菌源水實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的開(kāi)始階段主要類別如下, SubsectionIII_ FamilyI_unclassified (32.74%)、LD12_freshwater_ group_norank (14.52%)、Azospira (8.43%)、CL500-29_marine_group(5.85%)、Polynucleobacter (3.81%)、hgcI_clade (2.52%)、CL500-3 (2.23%);中間階段時(shí)期主要類別如下, Hydrogenophaga (42.70%)、Betaproteobacteria_unclassified (10.56%)、Comamonadaceae_unclassified (8.26%)、NS11-12_marine_group_norank (7.53%)、Limnohabitans (4.20%)、Novosphingobium (3.35%);結(jié)束階段時(shí)期主要類別如下, Limnohabitans (59.62%)、Aquincola (19.78%)、Reyranella (5.92%)、Comamonadaceae_ unclassified (4.49%).

表1　源水實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)變化情況(%)Table 1　The bacterial community during the source water experiment (%)

對(duì)照系統(tǒng)開(kāi)始階段主要類別如下, Flavobacterium (40.36%)、Azospira (11.23%)、LD12_freshwater_group_norank (10.31%)、CL500-29_marine_group (9.40%)、SubsectionIII_ FamilyI_unclassified (5.03%)、hgcI_clade (2.96%)、Polynucleobacter (2.43%);中間階段時(shí)期主要類別如下, Comamonadaceae_unclassified (40.89%)、Aquincola (17.06%)、Reyranella (8.59%)、Candidatus_Aquirestis (4.22%)、 Sphingomonadaceae_unclassified (3.54%)、Betaproteobacteria_unclassified (3.36%);結(jié)束階段時(shí)期主要類別如下, Limnohabitans (22.71%)、Methyloversatilis (12.63%)、Sphingomonadaceae_ unclassified (10.38%)、Aquabacter (6.76%)、Reyranella (5.71%)、Acinetobacter (4.74%)、Stenotrophomonas (4.69%)、Betaproteobacteria_ unclassified (4.66%)、Comamonadaceae_ unclassified (3.34%)、Hydrogenophaga (2.76%).

結(jié)果顯示,與氮循環(huán)相關(guān)的β變形菌(Betaproteobacteria,如Limnohabitans和Acidovorax)[37]:投菌系統(tǒng)中從開(kāi)始階段的0.02%,上升到中間階段的4.32%,到最后結(jié)束階段的60.19%;與此同時(shí),對(duì)照系統(tǒng)的Limnohabitans從開(kāi)始階段的0.05%,上升到中間階段的0.84%,到最后階段的23.53%.投菌系統(tǒng)的Acidovorax從開(kāi)始的0.11%上升到實(shí)驗(yàn)結(jié)束的0.22%;對(duì)照系統(tǒng)基本不存在.另一種菌為代爾夫特菌 (Delftia)與我們課題組之前從原水中分離的一株貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌SF9屬于同一種屬:投菌系統(tǒng)中從開(kāi)始階段的0.65%,上升到中間階段的8.50%,最后到結(jié)束階段的4.53%;對(duì)照系統(tǒng)的從開(kāi)始的0.38%,上升到中間階段的42.02%,最后到結(jié)束階段的3.46%.另外一β變形菌 (Aquincola)[38]:投菌系統(tǒng)中從開(kāi)始階段的0.01%,上升到中間階段的1.55%,到最后結(jié)束階段的19.97%;與此同時(shí),對(duì)照系統(tǒng)的從開(kāi)始階段的0%,上升到中間階段的17.53%,到最后階段的1.34%.趙文莉等[28]研究復(fù)合填料反硝化脫氮過(guò)程的微生物群落特征時(shí),氫噬胞菌(Hydrogenophaga)具有反硝化功能,本實(shí)驗(yàn)中:投菌系統(tǒng)中從開(kāi)始階段的0.02%,上升到中間階段的43.94%,到最后結(jié)束階段的0.73%;與此同時(shí),對(duì)照系統(tǒng)的從開(kāi)始階段的0.01%,上升到中間階段的2.03%,到最后階段的2.86%.不動(dòng)桿菌 (Acinetobacter)與源水所投加的81Y和G107所屬種類一致:投菌系統(tǒng)中從開(kāi)始階段的0.10%,上升到中間階段0.59%,到最后結(jié)束階段的0.00%;與此同時(shí), 對(duì)照系統(tǒng)的從開(kāi)始階段的0.01%,上升到中間階段的0.15%,到最后階段的4.91%.與此同時(shí),主要門(mén)類細(xì)菌與水質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性分析如表2所示,結(jié)果顯示,投菌和對(duì)照系統(tǒng)在變形菌門(mén)的變化與系統(tǒng)的氮素參數(shù)呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān),但是在擬桿菌門(mén)細(xì)菌與水質(zhì)參數(shù)相關(guān)關(guān)系存在明顯差異,對(duì)照系統(tǒng)的正相關(guān)性更強(qiáng).體現(xiàn)出兩系統(tǒng)細(xì)菌群落變化的差異性.相關(guān)性顯示,氮素去除主要表現(xiàn)為硝氮的下降.雖然所投加的好氧反硝化菌并沒(méi)有在細(xì)菌群落的heatmap圖發(fā)生顯著的增加,可能是由于反硝化菌的投加與水體中存在的氮循環(huán)菌發(fā)生協(xié)同作用,促進(jìn)了其他好氧反硝化菌的脫氮進(jìn)行.

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照和投菌兩系統(tǒng)的變形菌是重要變化的細(xì)菌門(mén)類,并且變化趨勢(shì)一致.與此同時(shí),投菌系統(tǒng)水體中的反硝化菌菌落數(shù)目在增加.通過(guò)Heatmap得出,具有反硝化功能的細(xì)菌,其中β變形菌(Limnohabitans, Aquincola和Acidovorax)、代爾夫特菌(Delftia)、氫噬胞菌(Hydrogenophaga)以及不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)的豐度隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行獲得提高.

表2　源水實(shí)驗(yàn)中主要細(xì)菌群落與水質(zhì)參數(shù)的相關(guān)關(guān)系Table 2　The correlation analysis between main bacterial community and water parameters in bacteria and control systems

Meta-群落假說(shuō)[39-40]認(rèn)為,細(xì)菌多樣性是因擴(kuò)散作用而聯(lián)系在一起的一系列本地群落的集合,它強(qiáng)調(diào)不同時(shí)空尺度上群落的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)過(guò)程.在meta-群落假說(shuō)中,有兩個(gè)影響因子影響細(xì)菌群落組成:內(nèi)部環(huán)境因子和外部環(huán)境因子.其中內(nèi)部環(huán)境因子指食物網(wǎng)中生物間的相互作用及物種的隨機(jī)動(dòng)態(tài)等物種本身之間的影響因子,而外部環(huán)境因子指環(huán)境溫度、主要離子濃度等外在因素.目前一般認(rèn)為在水力停留時(shí)間長(zhǎng)的水體(如湖泊和水庫(kù))中細(xì)菌群落主要受其內(nèi)部環(huán)境因子的影響[40].但是,本文僅僅考察了在靜態(tài)源水系統(tǒng)中投加貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌,脫氮過(guò)程中水體的細(xì)菌群落以及多樣性的演變過(guò)程,存在一定的局限性.考慮以后增加源水動(dòng)態(tài)過(guò)程以及底泥存在條件下脫氮變化中的細(xì)菌群落變化特征的考察,以期為微污染水源水庫(kù)的生物修復(fù)過(guò)程中對(duì)水體細(xì)菌群落的影響提供技術(shù)支持.

2.4 源水實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌群落主成分分析

將源水實(shí)驗(yàn)投菌和對(duì)照兩系統(tǒng)的開(kāi)始時(shí)期、中間時(shí)期和結(jié)束時(shí)期共6個(gè)樣點(diǎn)的OTU (97%相似性)進(jìn)行主成分分析,來(lái)反映樣本間的差異和距離.樣本間的組成越相似,反映在PCA圖中的距離越近.通過(guò)在PCA圖中的樣本間的分散和聚集分布反映樣本間細(xì)菌群落的相似程度.圖5的結(jié)果展示,6個(gè)樣點(diǎn)的主成分分析得出PC1+PC2達(dá)到68.38%.在源水實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段,投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)的細(xì)菌群落組成相似性很高;隨著源水實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,各個(gè)系統(tǒng)的細(xì)菌群落組成發(fā)生變化,同時(shí)期的投菌系統(tǒng)與對(duì)照系統(tǒng)的細(xì)菌群落差異很大.與兩系統(tǒng)的OTU分布的Veen圖特征和樣本間聚類特征相一致.

圖5　源水實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌主成分分析Fig.5　Principal component analysis (PCA) of bacteria and control source experimental systems

2.5 源水實(shí)驗(yàn)的OTU分布Venn圖特征

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目,可以比較直觀的表現(xiàn)環(huán)境樣本的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況. 本實(shí)驗(yàn)選用相似水平為97%的OTU樣本表.

投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)的結(jié)果如圖6所示.源水實(shí)驗(yàn)投菌系統(tǒng)結(jié)果顯示為,開(kāi)始階段與中間階段共有85個(gè)相同的OTU樣本;中間階段與結(jié)束階段共有102個(gè)相同的OTU樣本;開(kāi)始階段與結(jié)束階段共有54個(gè)相同的OTU樣本;開(kāi)始階段、中間階段與結(jié)束階段共有45個(gè)相同的OTU樣本.源水實(shí)驗(yàn)對(duì)照系統(tǒng)結(jié)果顯示為,開(kāi)始階段與中間階段共有70個(gè)相同的OTU樣本;中間階段與結(jié)束階段共有143個(gè)相同的OTU樣本;開(kāi)始階段與結(jié)束階段共有61個(gè)相同的OTU樣本;開(kāi)始階段、中間階段與結(jié)束階段共有49個(gè)相同的OTU樣本,對(duì)照系統(tǒng)三階段共有的OTUs要高于投菌系統(tǒng).

圖6　源水實(shí)驗(yàn)兩系統(tǒng)的OUT分布Fig.6　OUT distribution of bacteria and control systems in source water experiment

然而,投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)間的菌群間相似性如圖7所示,開(kāi)始階段時(shí)投菌系統(tǒng) 對(duì)照系統(tǒng)共有212個(gè)相同的OTU樣本;中間階段時(shí)投菌系統(tǒng)對(duì)照系統(tǒng)共有158個(gè)相同的OTU樣本;結(jié)束階段時(shí)投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)共有95個(gè)相同的OTU樣本. 隨著源水實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行同一系統(tǒng)中從開(kāi)始到結(jié)束階段,投菌系統(tǒng)內(nèi)共有的OTUs要小于對(duì)照系統(tǒng),并且同一時(shí)期投菌系統(tǒng)與對(duì)照系統(tǒng)共有的OTUs也隨著試驗(yàn)的進(jìn)行逐漸減少.從源水實(shí)驗(yàn)開(kāi)始到結(jié)束整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中兩系統(tǒng)共有的OTUs明顯越來(lái)越少,說(shuō)明投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)間的細(xì)菌群落差異性逐漸顯現(xiàn),這點(diǎn)與6個(gè)樣本間的聚類分析相一致.

圖7　源水實(shí)驗(yàn)不同時(shí)期的OUT分布Fig.7　OUT distribution of different periods in source experiment

2.6 源水實(shí)驗(yàn)的樣本間聚類特征

利用樹(shù)枝結(jié)構(gòu)描述和比較多個(gè)樣本間的相似性和差異關(guān)系.首先使用描述群落組成關(guān)系和結(jié)構(gòu)的算法計(jì)算樣本間的距離,即根據(jù)beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類分析,使用非加權(quán)組平均法UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)算法構(gòu)建樹(shù)狀結(jié)構(gòu),得到樹(shù)狀關(guān)系形式用于可視化分析.通過(guò)bray curtis算法使用qiime計(jì)算beta多樣性距離矩陣,算法如下:

式中:SA,i= 表示A樣本中第i個(gè)OTU所含的序列數(shù); SB,i= 表示B樣本中第i個(gè)OTU所含的序列數(shù).

本源水實(shí)驗(yàn)的投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段、中間階段和結(jié)束階段取的6個(gè)樣本,通過(guò)樣本的OTUs進(jìn)行層次聚類分析得到結(jié)果如圖8所示.

結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)初始階段投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)在同一分支下,樣本間相似性很高、差異不明顯;隨著源水實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,投菌系統(tǒng)和對(duì)照系統(tǒng)內(nèi)樣本間的OTUs被分離,兩系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化.在貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌作用下的投菌系統(tǒng)中,隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行系統(tǒng)內(nèi)水體的氮素在逐漸減小.因此水體的微生物生存受到限制,其物種豐富度下降,與細(xì)菌門(mén)類與對(duì)照和投菌系統(tǒng)水質(zhì)參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果相一致.

圖8　源水實(shí)驗(yàn)細(xì)菌多樣本相似度樹(shù)狀圖Fig.8　The hcluster tree of source water experimental system

3　結(jié)論

基于Miseq高通量測(cè)序法研究源水脫氮過(guò)程的微生物群落的演變.結(jié)果顯示投菌系統(tǒng)與對(duì)照系統(tǒng)的水體中的微生物群落結(jié)構(gòu)隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行都發(fā)生了變化,兩系統(tǒng)不同時(shí)期差異性明顯.其中兩系統(tǒng)中變形菌的群落結(jié)構(gòu)與氮素指標(biāo)存在明顯的負(fù)相關(guān).與此同時(shí)投菌系統(tǒng)中與氮循化相關(guān)的菌種明顯增加.考慮到靜態(tài)源水投菌實(shí)驗(yàn)的局限性,以后增加底泥存在下流動(dòng)源水投菌實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌群落變化,以期為研究微污染水源水庫(kù)的投加貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌進(jìn)行生物修復(fù)過(guò)程中對(duì)水體細(xì)菌群落的影響提供技術(shù)支持.

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Bacterial community structures of aerobic denitrification bacteria nitrogen removal process in source water experiment by using Miseq high-throughput sequencing technique.

ZHOU Shi-lei, HUANG Ting-lin*, ZHANG Chun-hua, BAI Shi-yuan, HE Xiu-xiu (Key Laboratory of Northwest Water Resource, Environment and Ecology, Ministry of Education, School of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China). China Environmental Science, 2016,36(4)：1125～1135

Abstract：Miseq high-throughput sequencing technique was used to investage the bacterial community structure of nitrogen removal process in source water experiment systems added aerobic denitrification bacteria. Bioinformatics analysis were carried on the for the samples of bacteria and control systems. Then, the fundamental analysis, Optimized sequence statistics, OTU distribution, and Taxonomic analysis; the Advanced analysis, the microbial community, PCA, Rank-Abundance, Hcluster, Specaccum, and Venn of OTU distribution. As a result, the nitrogen of bacteria system was removed obviously, and Hierarchical cluatering and PCA showed that the microbial community structure of bacteria and control systems has changed, and the Protebacterice and Bacteroidetes were the main phylum in experiment systems. Meanwhile, the N-functional microbial of bacteria system had an increase process, obviously, which was consistent with the changes of aerobic denitrification bacteria. From all the results, the Miseq high-throughput sequencing technique was an effective tool to explore the changes of bacterial community structure of nitrogen removal process, which could supply a reference to study the changes of community structure of remediation the source water in situ.

Key words：nitrogen removal；aerobic denitrification；Miseq sequencing；bioinformatics analysis；bacterial community structure

作者簡(jiǎn)介：周石磊(1987-),男,河北石家莊人,西安建筑科技大學(xué)博士研究生,主要從事水環(huán)境修復(fù)與水源水質(zhì)微污染控制的相關(guān)研究.

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAC04B02)

收稿日期：2015-09-15

中圖分類號(hào)：X172

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6923(2016)04-1125-11