金科華， 劉復(fù)興(湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 咸寧　43700； 湖北科技學(xué)院基本醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室)

?

敲低和過表達(dá)LDHB對HeLa細(xì)胞生長的影響

金科華1， 劉復(fù)興2(1湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 咸寧437100；2湖北科技學(xué)院基本醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室)

摘要：目的研究敲低和過表達(dá)LDHB(lactate dehydrogenase B)對HeLa細(xì)胞生長的影響。方法根據(jù)慢病毒質(zhì)粒pLn (pLL3.7-neo) 特點(diǎn)，設(shè)計(jì)三對分別靶向LDHB cDNA 48,201,443位核苷酸序列的shRNA(short hairpin RNA)引物，退火后與pLn重組。同時(shí)，將LDHB cDNA與慢病毒質(zhì)粒pIp(pBOBI-IRES-puro)重組，獲得的重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，將獲得的病毒上清感染HeLa細(xì)胞，Western blot鑒定LDHB的敲低和過表達(dá)對LDHB蛋白水平的影響，并觀察其對HeLa細(xì)胞生長的影響。結(jié)果靶向LDHB第48位核苷酸的shRNA顯著敲低LDHB(P<0.01)，443位次之，201位無敲低作用。shRNA序列對HeLa細(xì)胞生長的抑制作用與其敲低效果成正相關(guān)。轉(zhuǎn)染pIp-LDHB顯著升高LDHB在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)水平(P<0.01)，但不影響其生長。結(jié)論敲低LDHB抑制HeLa細(xì)胞生長，下調(diào)LDHB的表達(dá)可能有助于宮頸癌的治療。

關(guān)鍵詞：乳酸脫氫酶B；敲低；過表達(dá)；HeLa細(xì)胞

近年來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶B(lactate dehydrogenase B,LDHB)的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。von Eyben等[1],康一娟[2],張惟[3]分別發(fā)現(xiàn)睪丸癌、子宮內(nèi)膜異位癌和膀胱移行細(xì)胞癌中LDHB高表達(dá)。Ishikawa等[4]研究表明生殖細(xì)胞瘤中因LDHA(lactate dehydrogenase A)的高度甲基化，導(dǎo)致LDHB高度表達(dá)，而Leiblich等[5]發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞中LDHB啟動(dòng)子高度甲基化，導(dǎo)致其表達(dá)沉默。Liao等[6]發(fā)現(xiàn)LDHB低表達(dá)與膀胱尿路上皮癌的發(fā)展密切相關(guān)。駱平等[7]和McCleland等[8]發(fā)現(xiàn)敲低LDHB可以抑制肝癌細(xì)胞和三陰性乳腺癌細(xì)胞的生長，而Cui等[9]發(fā)現(xiàn)抑制LDHB可誘導(dǎo)胰腺癌的糖酵解表型并促進(jìn)其生長。

可見，LDHB對腫瘤細(xì)胞生長的作用具有特異性。本文采用過表達(dá)和shRNA干預(yù)LDHB的表達(dá)，觀察其對HeLa細(xì)胞生長的影響，以期發(fā)現(xiàn)LDHB對HeLa生長的作用，為宮頸癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒、cDNA與細(xì)胞株

大腸埃希菌DH5α、TOP10，質(zhì)粒pIp(pBOBI-IRES-puro)、pLn(pLL3.7-neo)分別由李博安教授、吳喬教授饋贈(zèng)，慢病毒包裝質(zhì)粒(MDL、VSGV、REV)及LDHB cDNA為韓家淮教授饋贈(zèng)。人胚腎293T細(xì)胞、HeLa細(xì)胞為本教研室保存。

1.2主要試劑

PrimeSTAR DNA聚合酶、Solution Ⅰ、小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)為TaKaRa產(chǎn)品。膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒為OMEGA產(chǎn)品；快速限制性核酸內(nèi)切酶為Thermo公司產(chǎn)品。胎牛血清(FBS)為PPA公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品。Polybrene為Sigma產(chǎn)品。 RIPA(強(qiáng))裂解液，BCA法蛋白定量試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品?？谷薒DHB、LDHA、β-actin單克隆抗體分別為Epitomics、Cell signaling和Sigma公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(或鼠)IgG抗體(二抗)購自北京中杉金橋公司。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液(ECL)、Fugene轉(zhuǎn)染試劑購自Promega公司。

1.3構(gòu)建LDHB干擾表達(dá)載體

1.3.1LDHB干擾引物的設(shè)計(jì)根據(jù)LDHB cDNA序列及質(zhì)粒pLn說明書，利用Lifetechnology公司的iRNA在線設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)靶向LDHB cDNA第48、201、443位核苷酸序列的 shRNA(short hairpin RNA)引物。正向引物：48 s：5′-TGGCAACAGTTCCAAACAATTTCAAGAGAATTGTTTGGAACTGTTGCCTTTTTTC-3′；201s: 5′-TGCATGGGAGCTTATTTCTTTTCAAGAGAAAGAAATAAGCTCCCATG-

CTTTTTTC-3′；443s: 5′-TCCTGGAAACTAAGTGGATTTTCAAGAGAAATCCACTTAGTTTCCAGGTTTTT-

TC-3′。反向引物：48a: 5′-TCGAGAAAAAAGGCAA

CAGTTCCAAACAATTCTCTTGAAATTGTTTGGAACT-

GTTGCCA-3′；201a: 5′-CGAGAAAAAAGCATGGGAGCTTATTTCTTTCTCTTGAAAAGAAATAAGCTCCC-

ATGCA-3′； 443a: 5′-TCGAGAAAAAACCTGGAAACTAAGTGGATTTCTCTTGAAAATCCACTTAG-

TTTCCAGGA-3′。下劃線處為發(fā)夾的loop區(qū)。正、反向引物的5′端進(jìn)行磷酸化修飾。引物退火后-20 ℃保存，備用。

1.3.2 退火產(chǎn)物與pLn連接、轉(zhuǎn)化取pLn質(zhì)粒28 μl(2 μg)，HpaⅠ、XbaⅠ各3 μl，10×FD buffer 6 μl，水20 μl，混勻，37 ℃酶切1 h。膠回收雙酶切的pLn，并對其去磷酸化：pLn 45 μl，CIAP 2 μl，10×CIAP buffer 6 μl，水7 μl，混勻，37 ℃反應(yīng)1 h。用PCR純化試劑盒純化去磷酸化的pLn。將4 μl pLn、1 μl退火產(chǎn)物及5 μl Solution Ⅰ混勻，16 ℃連接3 h。連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，于含100 μg/ml羧芐青霉素的LB平板篩選抗性菌落。

1.3.3鑒定重組干擾質(zhì)粒將單菌落接種于10 ml含100 μg/ml羧芐青霉素的LB中，37 ℃，250 r/min，培養(yǎng)10 h。抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定：pLn-LDHB shRNA 16 μl，HpaⅠ、XbaⅠ 各1 μl，10×FD green buffer 2 μl，混勻，37 ℃酶切2 h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。對酶切鑒定的陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.4構(gòu)建LDHB過表達(dá)載體

1.4.1PCR擴(kuò)增LDHB根據(jù)LDHB cDNA序列及質(zhì)粒pIp多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)正向引物L(fēng)DHBs: CGATCTAGAATGGCAACTCTTAAGGAAAAACTC；反應(yīng)引物L(fēng)DHBa: AGTGGATCCTCACAGGTCTTTTAGGTCCTTCTG。下劃線序列分別為XbaⅠ、BamHⅠ位點(diǎn)。PCR體系：LDHBs(10 μmol/L)4 μl，LDHBa(10 μmol/L)4 μl，5×HS Buffer 40 μl，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)16 μl，H2O 132 μl，PrimeSTAR DNA聚合酶 2 μl，LDHB cDNA 2 μl，混勻，分成4等份。PCR參數(shù)：98 ℃，10 s；65 ℃，10 s；72 ℃，1 min。30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行膠回收純化。

1.4.2PCR產(chǎn)物與pIp連接、轉(zhuǎn)化取pIp質(zhì)粒16 μl(1 μg)，XbaⅠ、BamH Ⅰ各1 μl，10×FD Green buffer 2 μl?；靹?，37 ℃酶切2 h。膠回收雙酶切的pIp。另取PCR產(chǎn)物20 μl，XbaⅠ、BamHⅠ 各2 μl，10×FD Green buffer 4 μl，水12 μl。混勻，37 ℃酶切1 h。PCR純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物。將pIp 1 μl、酶切后純化的PCR產(chǎn)物4 μl及SolutionⅠ 5 μl混勻，16 ℃連接1 h。按1.3.2轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物、篩選抗性菌落。

1.4.3鑒定重組過表達(dá)質(zhì)粒按1.3.3的方法抽提質(zhì)粒、酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒pIp-LDHB。

1.5慢病毒的包裝與感染

將293T細(xì)胞按1.5×106個(gè)/皿接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿，加入3 ml培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)，培養(yǎng)過夜。將重組干擾質(zhì)粒(或過表達(dá)質(zhì)粒)3 μg、MDL 1.5 μg、VSVG 0.9 μg、REV 0.6 μg混合，加入0.4 ml OPTI-MEM培養(yǎng)基，并加入18 μl Fugene HD，混勻，室溫靜置15 min。更新293T細(xì)胞培養(yǎng)基，逐滴加入質(zhì)粒轉(zhuǎn)染混合物，輕晃混勻。24 h后更新培養(yǎng)基，收集轉(zhuǎn)染后48 h的培養(yǎng)基，置-80 ℃保存。

將HeLa細(xì)胞按6×105個(gè)/孔接種于6孔板，加入1.5 ml培養(yǎng)基(同上)，培養(yǎng)過夜。將-80 ℃保存的含慢病毒的培養(yǎng)基恢復(fù)至室溫，加入終濃度10 μg/ml的polybrene，混勻。棄HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，加入1.5 ml上述病毒液，平行感染兩孔HeLa細(xì)胞(一孔用于Western blot檢測，另一孔用于篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞)，輕晃混勻，培養(yǎng)8 h，更新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察HeLa細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.6Western blot檢測 LDHB干擾或過表達(dá)效果

棄檢測孔培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入RIPA裂解液 200 μl，冰浴裂解5 min，收集裂解的細(xì)胞，超聲10 s,4 ℃ 13 000 r/min離心10 min。取上清，測定蛋白濃度，用RIPA裂解液將其調(diào)整至等濃度，加入4×loading buffer，混勻，100 ℃ 加熱10 min。取15 μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE。電泳完畢，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5% BSA室溫封閉1 h；分別加3 ml 1∶20 000稀釋的抗LDHB抗體、1∶5 000稀釋抗β-actin抗體、1∶5 000稀釋的抗LDHA抗體，于4 ℃將相應(yīng)的PVDF膜孵育過夜；回收一抗，TBST洗膜3次，每次5 min；加20 ml 1∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h；回收二抗，TBST洗膜3次，每次5 min；加1 ml ECL覆蓋PVDF膜，用BIO-RAD ChemiDOC XRS+成像系統(tǒng)拍照。

上述1.5-1.6的實(shí)驗(yàn)，均重復(fù)三次。

2結(jié)果

2.1重組干擾質(zhì)粒的鑒定

重組LDHB干擾質(zhì)粒和空質(zhì)粒pLn經(jīng)XbaⅠ+XhoⅠ 酶切后，均于250-500 bp之間出現(xiàn)小片段，且重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)生的小片段比空質(zhì)粒大，與預(yù)期相符(圖1)。可見LDHB干擾引物退火片段成功插入pLn中。測序結(jié)果表明插入片段序列均與理論一致。

M.DNA marker；CK.pLn Xba Ⅰ+XhoⅠ酶切產(chǎn)物；1.pLn-LDHB sh48 Xba Ⅰ+Xho Ⅰ酶切產(chǎn)物； 2.pLn-LDHB 201 Xba Ⅰ+XhoⅠ酶切產(chǎn)物; 3.pLn-LDHB 443 XbaⅠ+XhoⅠ酶切產(chǎn)物圖1　重組干擾質(zhì)粒的酶切鑒定Figure 1　Identification of recombinant interfering plasmids by digestion

2.2LDHB cDNA PCR擴(kuò)增

LDHB cDNA PCR產(chǎn)物略大于1 000 bp，與LDHB cDNA分子量(1 005 bp)相符，而空白對照未見擴(kuò)增條帶(圖2)。

M.DNA marker；1.LDHB PCR 產(chǎn)物；2.空白對照圖2　瓊脂糖凝膠電泳檢測LDHB cDNA PCR產(chǎn)物Figure 2　PCR product of LDHB cDNA by agarose gel electrophoresis

2.3重組過表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

有兩個(gè)重組子質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生略大于1 000 bp的條帶(6、7泳道)，與LDHB cDNA分子量(1 005 bp)相符，而空載體無此條帶(見圖3)，可見PCR產(chǎn)物插入pIp中。測序結(jié)果表明插入片段與LDHB cDNA序列一致。

M.DNA marker；1.pLn Xba Ⅰ+Xho Ⅰ酶切產(chǎn)物；2-9.重組子Xba Ⅰ+Xho Ⅰ酶切產(chǎn)物圖3　重組過表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定 Figure 3　Identification of recombinant overexpression plasmids by digestion

2.4LDHB干擾及過表達(dá)效果檢測

Western blot結(jié)果提示：48 shRNA顯著干擾LDHB的表達(dá)(P<0.01)，443 shRNA干擾作用較弱，201 shRNA、pLn、pLn-scramble均無干擾作用，且上述5個(gè)質(zhì)粒對LDHA均無干擾作用(見圖4A)；pIp-LDHB顯著升高HeLa細(xì)胞LDHB的表達(dá)水平(P<0.01)，而pIp對LDHB的表達(dá)無明顯影響(見圖4B)。

圖4　Western blot檢測LDHB敲低或過表達(dá)48 h后的蛋白水平Figure 4　Protein levels of LDHB in HeLa cells at 48 h after knocking down or overexpression by Western blot

2.5干預(yù)LDHB表達(dá)對HeLa細(xì)胞生長的影響

48 shRNA干擾LDHB表達(dá)的HeLa細(xì)胞生長變慢，密度變小，漂浮細(xì)胞多；443 shRNA有類似效果，但較弱。pLn、scramble序列及201 shRNA對HeLa 細(xì)胞的生長無明顯影響(見圖5)?？梢姡蓴_LDHB抑制HeLa細(xì)胞的生長。

感染含pIp或pIp-LDHB質(zhì)粒的慢病毒的HeLa細(xì)胞與HeLa母細(xì)胞生長密度和形態(tài)無明顯差異(見圖6)?？梢姡^表達(dá)LDHB對HeLa細(xì)胞的生長無影響。

A.HeLa 細(xì)胞；B.感染含pLn的慢病毒的HeLa細(xì)胞; C.感染含pLn-scramble的慢病毒的HeLa細(xì)胞; D.感染含pLn-48shRNA的慢病毒的HeLa細(xì)胞;E.感染含pLn-201shRNA的慢病毒的HeLa細(xì)胞; F.感染含pLn-443shRNA的慢病毒的HeLa細(xì)胞圖5　敲低LDHB抑制HeLa細(xì)胞生長 (×10)Figure 5　Knocking down LDHB inhibited the growth of HeLa cells (×10)

A.HeLa 細(xì)胞；B.感染含pIp的慢病毒的HeLa細(xì)胞; C.感染含質(zhì)粒pIp-LDHB的慢病毒的HeLa細(xì)胞圖6　過表達(dá)LDHB不影響HeLa細(xì)胞生長 (×10)Figure 6　Overexpressing LDHB had no effect on the growth of HeLa cells (×10)

3討論

正常細(xì)胞主要依靠氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，而多數(shù)腫瘤細(xì)胞，即使氧氣充足，也主要由糖酵解提供ATP。同時(shí)，糖酵解中間產(chǎn)物為腫瘤細(xì)胞快速增殖提供生物合成前體[10]。LDH是糖酵解的重要酶之一，催化丙酮酸和乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化。LDH是由LDHA和LDHB兩種亞基構(gòu)成的四聚體，共有5種同工酶(LDH1-5)，單亞基和四聚體均具有酶活性。LDHA主要催化丙酮酸還原為乳酸，而LDHB主要催化乳酸氧化為丙酮酸[11]。

理論上，LDHA表達(dá)水平不變時(shí)，干擾LDHB表達(dá)會(huì)導(dǎo)致LDH的同工酶LDH1、LDH2的減少，LDH5、LDH4相對增多，減少乳酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化，增加其逆反應(yīng)，加速糖酵解，促進(jìn)糖酵解表型的腫瘤細(xì)胞生長。腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的乳酸如不及時(shí)排出胞外，會(huì)導(dǎo)致pH降低，引起細(xì)胞酸化中毒，抑制其生長。為防止細(xì)胞酸化，腫瘤細(xì)胞間形成代謝共生體：糖酵解表型的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)MCT4(monocarboxylate transporter 4)，將乳酸排出胞外[12]；氧化磷酸化表型的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)MCT1(monocarboxylate transporter 1)，攝入糖酵解表型的腫瘤細(xì)胞外排的乳酸[13]，將其氧化為丙酮酸，經(jīng)由三羧酸循環(huán)氧化，產(chǎn)生ATP。干擾LDHB是否加速了乳酸產(chǎn)生，而未增加MCT4和MCT1的表達(dá)，導(dǎo)致胞內(nèi)乳酸堆積、細(xì)胞酸化，從而抑制HeLa細(xì)胞生長，須進(jìn)一步研究。LDHB是一種多功能蛋白，除催化乳酸與丙酮酸的相互轉(zhuǎn)化外，還能轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[14]。干擾LDHB的表達(dá)是否削弱LDHB的非糖酵解功能，通過其他途徑抑制HeLa細(xì)胞生長，值得深入研究。

LDHB與LDHA的cDNA序列有較高同源性[15]，但本研究結(jié)果提示LDHB的shRNA序列并未干擾LDHA的表達(dá)。故干擾LDHB對HeLa細(xì)胞生長的抑制作用與LDHA無關(guān)。

過表達(dá)是研究基因功能的常用技術(shù)，但細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的蛋白是否具有相應(yīng)的生物學(xué)活性鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。過表達(dá)LDHB并未影響HeLa細(xì)胞生長，是否因LDHB缺乏翻譯后加工修飾，致其無活性，從而對HeLa細(xì)胞生長無影響，需要進(jìn)一步研究。

本文結(jié)果表明敲低LDHB的表達(dá)抑制HeLa細(xì)胞的生長，可見下調(diào)LDHB的表達(dá)可能有助于宮頸癌的治療。

參考文獻(xiàn)：

[1]von Eyben FE,Skude G,Tropé C,etal.Lactate dehydrogenase isoenzyme 1(LDH-1) in athymic mice with xenografts of a human testicular germ cell tumor[J].Mol Gen Genet,1982,186(3):427-431.

[2]康一娟.LDHB在子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)及其意義的相關(guān)性研究[D].武漢：華中科技大學(xué),2013.

[3]張惟.膀胱移行細(xì)胞癌組織中乳酸脫氫酶B亞基蛋白表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2013,53(2):82-83.

[4]Ishikawa J,Taniguchi T,Higashi H,etal.High lactate dehydrogenase isoenzyme 1 in a patient with malignant germ cell tumor is attributable to aberrant methylation of the LDHA gene[J].Clin Chem,2004,50(10):1826-1828.

[5]Leiblich A,Cross SS,Catto JW,etal.Lactate dehydrogenase-B is silenced by promoter hypermethylation in human prostate cancer[J].Oncogene,2006,25(20):2953-2960.

[6]Liao AC,Li CF,Shen KH,etal.Loss of lactate dehydrogenase B subunit expression is correlated with tumour progression and independently predicts inferior disease-specific survival in urinary bladder urothelial carcinoma[J].Pathology,2011,43(7):707-712.

[7]駱平,查小軍,汪宏.mTOR和LDHB在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義[J].安徽醫(yī)學(xué),2012,33(8):965-969.

[8]McCleland ML,Adler AS,Shang Y,etal.An integrated genomic screen identifies LDHB as an essential gene for triple-negative breast cancer[J].Cancer Res,2012,72(22):5812-5823.

[9]Cui J,Quan M,Jiang W,etal.Suppressed expression of LDHB promotes pancreatic cancer progression via inducing glycolytic phenotype[J].Med Oncol,2015,32(5):143.

[10]Warburg O.On respiratory impairment in cancer cells[J].Science,1956,124(3215):269-270.

[11]Porporato PE,Dhup S,Dadhich RK,etal.Anticancer targets in the glycolytic metabolism of tumors: a comprehensive review[J].Front Pharmacol,2011,2:1-18.

[12]Dimmer KS,Friedrich B,Lang F,etal.The low-affinity monocarboxylate transporter MCT4 is adapted to the export of lactate in highly glycolytic cells[J].Biochem J,2000,350(1):219-227.

[13]Sonveaux P,Vegran F,Schroeder T,etal.Targeting lactate-fueled respiration selectively kills hypoxic tumor cells in mice[J].J Clin Invest,2008,118(12):3930-3942.

[14]Zheng L,Roeder RG,Luo Y.S phase activation of the histone H2B promoter by OCA-S,a coactivator complex that contains GAPDH as a key component[J].Cell,2003,114(2):255-266.

[15]Sakai I,Sharief FS,Pan YC,etal.The cDNA and protein sequences of human lactate dehydrogenase B[J].Biochem J,1987,248(3):933-936.

Effects of knocking down and overexpression of LDHB on the growth of HeLa cells

JIN Kehua1，LIU Fuxing2

(1DepartmentofBiochemistry,BasicMedicalCollogeofHubeiScienceandTechnologyUniversity,Xianning437100,China;2DepartmentofPathology,BasicMedicalCollegeofHubeiScienceandTechnologyUniversity)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of knocking down and overexpression of LDHB on the growth of HeLa cells.MethodsThree pairs of interfering primers, respectively targeting 48, 201, 443 locus of LDHB cDNA sequences, were synthesized according to the instructions of lentivirus vector pLn(pLL3.7-neo). The cDNA of LDHB was recombined with overexpression plasmid pIp (pBOBI-IRES-puro). Recombinant plasmids pIp-LDHB or pLn-LDHB shRNAs were cotransfected with lentivirus package plasmids to 293T cells. After 48 h, the medium of 293T was harvested and applied to infect HeLa cells. The effects of interference and overexpression on the protein levels of LDHB were detected by Western blot, and the effects on the HeLa cell growth were observed simultaneously.ResultsThe protein levels of LDHB were significantly, weakly, little knocked down by shRNA 48(P<0.01), shRNA 443, shRNA 201, respectively. The protein level of LDHB was elevated significantly after transfected with pIp-LDHB(P<0.01). The inhibition effects of LDHB shRNAs on the growth of HeLa cells were in line with their interfering effects.However, the overexpression of LDHB had no influence on HeLa cell growth.ConclusionKnocking down LDHB could inhibit the growth of Hela cells, and the down-regulation of LDHB expression may contribute to the treatment of cervical cancer.

Key words:lactate dehydrogenase B;knocking down;overexpression;HeLa cells

[收稿日期：2015-08-02]

作者簡介：金科華，男，1978-12生，碩士，講師，E-mail：wenyuanxueyuan@126.com.

中圖分類號：R329

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0041-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.010

基金項(xiàng)目：湖北科技學(xué)院校級科研基金資助項(xiàng)目(ky2014074)