劉　勇， 徐天嬌， 霍金蓮， 田永青, 李海榮， 曹向?qū)帲?黃　瑞， 王偉偉(延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院老年病科，咸陽(yáng)　7000；西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)研究室； 通訊作者，E-mail:xtj8@63.com)

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硒對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

劉勇1， 徐天嬌2*， 霍金蓮1， 田永青1, 李海榮1， 曹向?qū)?， 黃瑞1， 王偉偉1(1延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院老年病科，咸陽(yáng)712000；2西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)研究室；*通訊作者，E-mail:xtj1118@163.com)

摘要：目的觀察硒對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討硒誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法設(shè)不同濃度硒(1,5,10 μmol/L)處理實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)陰性空白對(duì)照組，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率；FCM儀分析細(xì)胞的凋亡率；Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)分子Bcl-2,Bcl-xL,Bax,細(xì)胞色素C(cytochrome C)及caspase-3表達(dá)變化。結(jié)果與24 h組比較，同濃度(5 μmol/L和10 μmol/L)硒處理48 h組和72 h組顯著抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)，且具有時(shí)間依賴性；與同時(shí)間對(duì)照組比較，硒能夠明顯抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)，且具有濃度依賴性。與對(duì)照組比較，硒能夠顯著性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.05)，降低Bcl-2,Bcl-xL的表達(dá)并增加Bax,cytochrome C和caspase-3的表達(dá)(P<0.05)，且均具有濃度依賴性。結(jié)論硒通過調(diào)控Bcl-2，Bax，細(xì)胞色素C及caspase-3的表達(dá)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：硒；肺腺癌;A549細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

從腫瘤細(xì)胞學(xué)方面來(lái)說，肺癌的發(fā)生與細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡之間的平衡被打破有關(guān)，凋亡過程受阻及惡性細(xì)胞無(wú)限增殖可導(dǎo)致肺癌發(fā)生。Bcl-2基因家族是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中兩類典型的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白。這些因子的激活、過度表達(dá)或失活是腫瘤形成的重要機(jī)制。因此，通過調(diào)控這些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能成為抗腫瘤治療最有效的途徑之一。

目前大多數(shù)研究表明硒具有防癌、抗癌作用[1-3]。硒對(duì)于不同腫瘤的作用效果和機(jī)制卻不盡相同，但誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)以人肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察不同濃度硒處理后細(xì)胞增殖和凋亡情況，并重點(diǎn)觀察與凋亡相關(guān)的重要分子Bcl-2、Bcl-xL、Bax細(xì)胞色素C(cytochrome C)及caspase-3表達(dá)變化。深入探討硒可能通過線粒體途徑并依賴于caspase-3激活誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，為肺癌的研究提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑

亞硒酸鈉、胰蛋白酶、牛血清白蛋白和NC膜購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM(高糖)、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自上海生物化學(xué)試劑公司； BCA蛋白定量試劑購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；所有抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)復(fù)蘇A549細(xì)胞，用含10% FBS(胎牛血清)、100 /ml 青霉素以及100 g/ml 鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，37 ℃、5%CO2恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，間隔1-2 d換培養(yǎng)液1次。每2-3 d以0.25%胰酶消化，按1∶3傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法測(cè)定硒對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞株分別以1.0×105/ml加入96孔板中培養(yǎng)24，48，72 h，實(shí)驗(yàn)組設(shè)置不同濃度：1，5，10 μmol/L；空白組加入等體積的DMSO。在每孔加入MTT，作用4 h加入DMSO孵育30 min，在490 nm處測(cè)定吸光度。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。

1.4流式細(xì)胞儀Annexin Ⅴ/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以不同濃度硒(1，5，10 μmol/L)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/ml，用Annexin Ⅴ/PI雙染色法處理，流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡情況。

1.5Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以不同濃度硒(1，5，10 μmol/L)培養(yǎng)72 h，消化細(xì)胞，離心，冰浴PBS洗3次。收集細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液、BCA法定量蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h；分別加一抗Bcl-2(1∶200)、Bcl-xL(1∶200)、Bax(1∶200)、細(xì)胞色素C(1∶200)、caspase-3(1∶200)及β-actin(1∶1 000)，4 ℃過夜；洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫輕搖1 h，充分洗滌后與ECL反應(yīng)，即刻與X線片曝光，目的條帶使用分析儀進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1硒對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

不同濃度硒(1，5,10 μmol/L)對(duì)A549細(xì)胞的增殖均具有抑制作用，且具有一定濃度依賴性(見表1)，其中5 μmol/L和10 μmol/L兩個(gè)濃度的硒對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制較明顯，與對(duì)照組及同一濃度不同時(shí)間組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.2硒對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：A549細(xì)胞經(jīng)1，5，10 μmol/L硒處理48 h，細(xì)胞凋亡比例呈現(xiàn)濃度依賴性增加(見圖1)，其中5 μmol/L和10 μmol/L硒處理組與對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖1　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度硒對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Figure 1　Effects of selenium on apoptosis of A549 cells by FCM

組別24h48h72hODIR(%)ODIR(%)ODIR(%)對(duì)照組1.104±0.0100 1.113±0.03201.109±0.03401μmol/L組1.001±0.0439.30.984±0.02111.50.964±0.03113.15μmol/L組0.745±0.030*32.50.651±0.051**△41.50.533±0.062**△51.910μmol/L組0.643±0.041**41.80.427±0.037**△61.60.319±0.048**△71.2

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；同組與24 h比較，△P<0.05

2.3硒對(duì)A549細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xL、Bax和細(xì)胞色素C表達(dá)的影響

1， 5,10 μmol/L硒作用于A549細(xì)胞48 h，硒能夠減少Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，同時(shí)增加細(xì)胞中Bax、細(xì)胞色素C和caspase-3的表達(dá)，且均具有濃度依賴性(見圖2-6)。其中5 μmol/L and 10 μmol/L硒處理組與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01 圖2　不同濃度硒對(duì)A549細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響Figure 2　The effects of selenium on Bcl-2 expression in A549 cells

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3　不同濃度硒對(duì)A549細(xì)胞Bcl-xL表達(dá)的影響Figure 3　The effects of selenium on Bcl-xL expression in A549 cells

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖4　不同濃度硒對(duì)A549細(xì)胞Bax表達(dá)的影響Figure 4　The effects of selenium on Bax expression in A549 cells

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖5　不同濃度硒對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞色素C表達(dá)的影響Figure 5　The effects of selenium on level of cytochrome C in A549 cells

與對(duì)照組比較，*P<0.05， **P<0.01圖6　不同濃度硒對(duì)A549細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響Figure 6　The effects of selenium on caspase-3 expression in A549 cells

3討論

肺癌是一種發(fā)病率及死亡率極高的惡性腫瘤，對(duì)人類健康的危害日益嚴(yán)重。盡管采用了手術(shù)、化療、放療等多種治療方法，但5年存活率尚不足15%。21世紀(jì)，肺癌仍然是全球惡性腫瘤患者死亡的主要原因?，F(xiàn)已明確，細(xì)胞凋亡機(jī)制在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[4]。許多抗腫瘤的藥物都是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞[5,6]。

硒是人和動(dòng)物的必需微量元素，有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。周嵐等[7]檢測(cè)了宣威女性肺癌患者癌組織、癌周組織、正常肺組織和血清硒含量，結(jié)果提示宣威地區(qū)女性肺癌的發(fā)生與低血硒狀態(tài)有關(guān)，肺組織低硒可能是導(dǎo)致癌變的潛在危險(xiǎn)因素。趙秀香等[8]和Klarod等[9]的研究也表明肺癌患者血清硒含量明顯低于正常對(duì)照組，并且進(jìn)展期肺癌患者血清硒又明顯低于早期患者。這些表明，血清硒水平與肺癌發(fā)生有著密切的關(guān)系，硒缺乏會(huì)增加癌癥的發(fā)生率。

本研究首先通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察到5 μmol/L和10 μmol/L硒能夠顯著性抑制A549細(xì)胞增殖活力。另外，流式細(xì)胞儀Annexin Ⅴ/PI雙染色法結(jié)果顯示：不同濃度硒能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，其中5 μmol/L和10 μmol/L硒能夠顯著性誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，這些說明硒能夠顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的重要因子[10]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Bcl-2家族分成兩類包括凋亡抑制因子和促凋亡因子。其中抑制因子包括Bcl-2、Bcl-xl等，而促凋亡因子包括Bax、Bid等。激活的Bax蛋白能夠增加線粒體膜通透性使細(xì)胞色素C從線粒體釋放，再與結(jié)合同時(shí)激活caspase導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，其活化是凋亡進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的標(biāo)志。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)硒處理后的A549細(xì)胞中促凋亡分子Bax表達(dá)增加而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表達(dá)下降，并且胞質(zhì)中cytochrome C表達(dá)顯著性增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，硒能夠顯著增加活化的caspase-3的表達(dá)。

通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推斷：硒可能通過調(diào)控的Bcl-2及Bax表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，并激活Caspase-3，最終通過線粒體途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

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Effects of selenium on proliferation and apoptosis of human lung adenocarcinoma cell line A549 cells

LIU Yong1, XU Tianjiao2*, HUO Jinlian1, TIAN Yongqing1, LI Hairong1, CAO Xiangning1, HUANG Rui1, WANG Weiwei1

(1DepartmentofGeratology,XianyangHospitalofYan’anUniversity,Xianyang712000,China;2DepartmentofPharmacology,Xi’anMedicalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:xtj1118@163.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of selenium on proliferation and apoptosis of lung adenocarcinoma cell line A549 cells and explore its mechanisms.MethodsThe A549 cells were treated with different concentrations of selenium(1,5,10 μmol/L) for 24 h and 48 h respectively, and the untreated cells were used as negative contols. The cell proliferation was measured using MTT, the cell apoptosis was measured by flow cytometry and the expression of Bcl-2, Bcl-xL, Bax, cytochrome C and caspase-3 was examined by Western blot.ResultsCompared with 24 h group, the proliferation was significantly inhibited after treated with the same concentration of selenium(5,10 mol/L) in 48 h group and 72 h group(P<0.05). Selenium significantly inhibited the proliferation in a concentration-dependent manner at the same time(P<0.05). Selenium significantly induced the apoptosis (P<0.05), markedly down-regulated the expression of Bcl-2 and Bcl-xL and up-regulated expression of Bax, CytochromeC and Caspase-3 in a concentration-dependent manner(P<0.05).ConclusionSelenium can induce the apoptosis of A549 cells by regulating the expression of Bcl-2, Bax, cytochrome C and caspase-3.

Key words:selenium;lung adenocrcinoma;A549 cell;cell apoptosis

[收稿日期：2015-09-06]

作者簡(jiǎn)介：劉勇，男，1976-10生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail:15991883311@163.com.

中圖分類號(hào)：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)01-0031-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.008

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳科研計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(15JK1633)