倪　磊， 王愛英， 羅　邁， 白濟瑜， 劉利英(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，西安　7006；西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部；西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)研究實驗中心，環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室；通訊作者，E-mail：llying@mail.xjtu.edu.cn)

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恐懼聲音心理應(yīng)激孕鼠的子代空間學(xué)習記憶能力研究

倪磊1， 王愛英1， 羅邁1， 白濟瑜2， 劉利英3*(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，西安710061；2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部；3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)研究實驗中心，環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室；*通訊作者，E-mail：llying@mail.xjtu.edu.cn)

摘要：目的探討恐懼聲音心理應(yīng)激模型孕鼠子代青春期記憶與學(xué)習能力。方法實驗采用昆明雌鼠,受孕后將其隨機分成應(yīng)激組和對照組。應(yīng)激組以小鼠恐懼聲音為應(yīng)激源,每日上、下午各播放2 h，持續(xù)2周，對照組為正常飼養(yǎng)小鼠。統(tǒng)計兩組的子代出生率，并正常環(huán)境下飼養(yǎng)至35-40 d。應(yīng)用Morris水迷宮測試小鼠學(xué)習與記憶成績。結(jié)果應(yīng)激組子代出生率低于對照組,對照組為11±1.85只/窩，而應(yīng)激組下降到7±1.58只/窩(P<0.05)。Morris水迷宮實驗表明，應(yīng)激組子代逃逸潛伏期比對照組子代明顯增長,尤其在第1，4，5天，兩組間的差異具有顯著性(P<0.05)。雌雄鼠分別統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)雌性子代小鼠的逃離潛伏期與對照組相比無明顯升高，而雄性子代小鼠的逃離潛伏期與對照組相比明顯升高(P<0.05)。在空間探索能力檢測中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激組子代小鼠的空間探索次數(shù)低于對照組(2.58±1.76 vs 3.35±1.89，P<0.05)；將雌鼠與雄鼠分別分析，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激組子代雄鼠的空間探索次數(shù)為(1.59±1.37)次，對照組子代雄鼠為(3.08±2.03)次，兩組之間有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而子代雌性小鼠的空間探索次數(shù)與對照組相比無明顯差異。結(jié)論恐懼聲音心理應(yīng)激可損傷應(yīng)激孕鼠雄性子代的學(xué)習和記憶能力。

關(guān)鍵詞：恐懼聲音；小鼠；學(xué)習與記憶能力；Morris水迷宮

精神壓力不僅可以引起抑郁癥、心血管疾病、腫瘤等重大疾病的發(fā)生，而且可以應(yīng)激子代神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，影響子代成年后的學(xué)習與記憶。目前，應(yīng)用于精神壓力的模型包括力竭游泳、束縛、熱以及電擊等，均可引起軀體應(yīng)激和心理應(yīng)激，因此難以評估單純心理應(yīng)激的效應(yīng)[1-3]。本研究組前期建立了不引起軀體應(yīng)激的心理應(yīng)激模型—恐懼聲音心理應(yīng)激模型。該模型可以引起多種應(yīng)激激素以及應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)的改變，同時也可導(dǎo)致小鼠免疫功能下降，進而促進荷瘤小鼠的腫瘤的生長[4-8]。但是，單純心理應(yīng)激是否可以引起孕鼠子代的學(xué)習記憶的損傷，尚無相關(guān)報道。本研究應(yīng)用恐懼聲音心理應(yīng)激模型應(yīng)激孕鼠，并檢測其后代青春期的學(xué)習與記憶，探討心理應(yīng)激對子鼠學(xué)習與記憶能力的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物

昆明清潔級小白鼠雄鼠20只以及動情期雌鼠60只，每只雄鼠與三只雌鼠合籠。每天8∶00查看小鼠陰栓。選擇陰栓雌鼠30只，隨機分為兩組：對照組與應(yīng)激組各15只。

1.2實驗儀器

漫步者聲邁X100V 音箱(北京愛德發(fā)高科技集團)；Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司)；ND6脈沖精密聲級計(中國江西國營紅聲器材廠)；398B型VCD；Morris 動物行為實驗軟件。

1.3動物模型的制備

空白對照組在正常飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。恐懼聲音心理應(yīng)激組模型的制備參照本小組此前造模方法[9]，即每天上午和下午進行心理應(yīng)激，強度為65-85 dB，應(yīng)激后置于正常飼養(yǎng)環(huán)境，持續(xù)14 d。各組小鼠自由進食進水，直至生育。子鼠出生后，統(tǒng)計每組子鼠數(shù)目，計算每只孕鼠子鼠生殖個數(shù)，并置于正常飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)至40 d?？瞻讓φ战M和恐懼聲音心理應(yīng)激組子鼠各16只，其中雄鼠與雌鼠各8只。

1.4Morris水迷宮實驗

定位航行實驗:用于測量小鼠在水迷宮中的學(xué)習和記憶能力。實驗時間持續(xù)5 d，實驗前一天讓小鼠自由游泳2 min以習慣實驗環(huán)境。正式實驗分上、下午兩個實驗階段，上、下午各4次，每次120 s，順時針從水池東、南、西、北4個入水點將小鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄小鼠找到并爬上平臺所需的時間(逃避潛伏期)。如果小鼠120 s內(nèi)找不到平臺，則將其引上平臺，并且逃離潛伏期記為120 s。小鼠在平臺上至少停留15 s。

空間探索實驗:于第6天進行測試。撤去平臺，任選一個入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在120 s內(nèi)經(jīng)過平臺所在位置的次數(shù)，檢測試驗小鼠的記憶保持能力。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1恐懼聲音心理應(yīng)激對孕鼠子鼠出生率的影響

恐懼聲音具有顯著的應(yīng)激效應(yīng)。小鼠在恐懼聲音播放期間，大小便次數(shù)顯著增加，而攝食和飲水量下降。對照組孕鼠子鼠的出生率為11±1.85只/窩，恐懼聲音應(yīng)激組為7±1.58只/窩，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2恐懼聲音對應(yīng)激孕鼠的子鼠定位航行影響

經(jīng)過5 d的定位航行實驗，對照組和應(yīng)激組小鼠的逃離潛伏期均迅速下降。從定位航行第一天開始，每天的小鼠逃離潛伏期均較前一天有明顯下降。但是，應(yīng)激孕鼠的子代較對照組的逃離潛伏期有所升高，在第1天、第4天和第5天，兩組間的差異具有顯著性(P=0.047，見圖1)。將應(yīng)激孕鼠子代的雌雄分別分析，結(jié)果表明應(yīng)激孕鼠的雌性子代與對照組的逃離潛伏期差異無顯著性(P=0.376，見圖2)，而應(yīng)激孕鼠的雄性子代逃離潛伏期較對照組明顯上升(P=0.008，見圖3)。

與對照組比較，*P<0.05圖1　恐懼聲音心理應(yīng)激對孕鼠子鼠逃離潛伏期的影響Figure 1　The effect of scream sound stress on the escape latency in offsprings of pregnant mice

2.3恐懼聲音對應(yīng)激孕鼠的子鼠空間探索能力的影響

恐懼聲音心理應(yīng)激對應(yīng)激孕鼠的子鼠空間探索能力具有明顯的抑制作用(P=0.049，見表1)。將應(yīng)激孕鼠子代的雌雄分別分析，結(jié)果顯示應(yīng)激孕鼠的雌性子代與對照組的空間探索能力差異無顯著性(P=0.435，見表1)，而應(yīng)激孕鼠的雄性子代空間探索能力較對照組明顯下降(P=0.014，見表1)。

圖2　恐懼聲音心理應(yīng)激對孕鼠雌性子鼠逃離潛伏期的影響Figure 2　The effect of scream sound stress on the escape latency in female offspring of pregnant mice

與對照組比較，*P<0.05圖3　恐懼聲音心理應(yīng)激對孕鼠雄性子鼠逃離潛伏期的影響Figure 3　The effect of scream sound stress on the escape latency in male offspring of pregnant mice

組別子鼠(n=16)雌性子鼠(n=8)雄性子鼠(n=8)對照組3.35±1.893.63±2.243.08±2.03應(yīng)激組2.58±1.76*3.61±2.091.59±1.37*

與對照組相比，*P<0.05

3討論

近年來的研究表明，生命早期母體營養(yǎng)不良、或暴露于不良環(huán)境，如化學(xué)物質(zhì)、電磁輻射等，或精神壓力過大，都會造成子代成年期疾病的發(fā)生，如心血管疾病、2型糖尿病、免疫功能異常或腫瘤等疾病的發(fā)生。并明確這些疾病發(fā)生的關(guān)鍵時期是在胚胎期、胎兒期與嬰兒期，即“胎源學(xué)說”，并引出了人類“健康與疾病發(fā)育起源(development origins of health and disease)”的新學(xué)說[10]。在以上諸多的母體暴露或應(yīng)激因素中，心理應(yīng)激逐漸成為影響人類生存質(zhì)量的重要原因之一。已有大量的研究工作表明，孕期復(fù)合應(yīng)激可以引起小鼠子代的淋巴細胞數(shù)和粒細胞數(shù)以及血漿皮質(zhì)醇降低[11]；引起子代海馬結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致記憶和空間辨別能力下降。人類的流行病調(diào)查研究顯示，孕期應(yīng)激可以提高母親皮質(zhì)醇水平，并通過胎盤傳遞給胎兒，導(dǎo)致新生兒臍血中皮質(zhì)醇含量升高，使胎兒處于應(yīng)激狀態(tài)[12],導(dǎo)致子代行動紊亂，注意力缺陷，尤其與男孩多動癥獨立相關(guān)[13]。但是以上研究存在的問題是不能區(qū)分軀體應(yīng)激與心理應(yīng)激的影響。

本研究首次應(yīng)用恐懼聲音應(yīng)激模型研究了孕鼠應(yīng)激后子代的學(xué)習記憶行為。該模型具有以下優(yōu)點：避免了軀體應(yīng)激，設(shè)備要求簡單，操作簡便易行。研究結(jié)果表明，恐懼聲音應(yīng)激孕鼠的子代出生數(shù)目明顯下降。Wainstock等[14]比較研究了對火箭襲擊有預(yù)期城市的1 345名孕婦與無預(yù)期城市的2 143名孕婦的歷史資料，其結(jié)論與本研究一致，孕期應(yīng)激與自發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生風險相關(guān)。

Morris水迷宮是一種能夠準確反映動物的空間學(xué)習記憶能力的研究手段。Morris水迷宮研究結(jié)果顯示，應(yīng)激孕鼠子代的逃離潛伏期與對照組相比增長，并且空間探索穿越平臺的次數(shù)下降，說明孕期應(yīng)激對子代的學(xué)習記憶過程存在損傷效應(yīng)。Barzegar等[15]以噪聲為應(yīng)激手段應(yīng)激受孕大鼠，證明應(yīng)激孕鼠子代LTP水平較低，皮質(zhì)酮水平較高，水迷宮結(jié)果與本研究結(jié)果一致。將子鼠按照性別分別分析，結(jié)果顯示雌性子鼠與對照組學(xué)習記憶無顯著性差異，而雄性子鼠學(xué)習記憶損傷嚴重。目前，產(chǎn)前孕婦應(yīng)激對不同性別子代的生物學(xué)效應(yīng)結(jié)論不盡相同。Walder等[16]研究了產(chǎn)前孕婦應(yīng)激與子代自閉癥的關(guān)系，自閉癥篩查問卷(ASSQ)結(jié)果顯示，6.5歲孩子中男孩的ASSQ評分高于女孩。Weston等[17]分別應(yīng)用Pb暴露以及束縛應(yīng)激處理雌鼠或孕鼠，研究了不同暴露對不同性別子代的神經(jīng)損傷，結(jié)果表明雄鼠受到明顯的影響，而雌鼠變化不明顯。有關(guān)雌鼠對應(yīng)激保護作用的機制研究鮮見報道，雌激素可能參與了保護作用。Komesaroff等[18]研究發(fā)現(xiàn)補充雌激素可以降低絕經(jīng)期的婦女由于心理應(yīng)激而引起的糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺反應(yīng)。綜上說述，恐懼聲音可損傷應(yīng)激孕鼠雄性子代的學(xué)習和記憶能力。

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Effect of scream voice stress on spatial learning and memory capability in offspring of pregnant mice

NI Lei1, WANG Aiying1, LUO Mai1, BAI Jiyu2, LIU Liying3*

(1DepartmentofCellBiologyandGenetics,Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter,Xi’an710061,China;2Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter;3CenterLaboratoryforBiomedicalResearch,Xi’anJiaotongUniversity,EnvironmentandGenesRelatedtoDiseasesKeyLaboratoryofEducationMinistry;*Correspondingauthor,E-mail:llying@mail.xjtu.edu.cn)

Abstract：ObjectiveTo explore the on the memory and learning ability of the offsprings of scream voice stress pregnant mice. MethodsKunming female mice were chosen as experimental animals. Pregnant mice were randomly divided into stress group and control group. Pregnant mice in stress group were exposed to scream voice stress for 2 h at the morning and afternoon respectively for 2 weeks. In control group the mice were fed under the normal situation. The natality was noted in the two groups. Descendant mice were continuously raised for 35-40 d. Learning and memory abilities of the offspring were further measured by the Morris water maze. ResultsThe natality was lower in stress group(7±1.58/nest)than that in control group(11±1.85/nest,P<0.05). Escape latency was significantly higher in offsprings of stress mice than that of control mice, especially at day 1,4,5(P<0.05). The escape latency of the male offsprings mice was longer in stress group than that in control group(P<0.05), but there was no difference in female offspring mice between two groups. The spatial probe test showed that the times of searching the platform of offspring mice in stress group was lower than in control group(2.58±1.76 vs 3.35±1.89，P<0.05). The times of searching the platform of male offsprings in stress group was significantly lower than in control group(1.59±1.37 vs 3.08±2.03,P<0.05). However, there was no difference in spatial probe test of female offsprings between two groups. ConclusionScream voice stress may damage the learning and memory of male offspring mice.

Key words:scream sound;mice;learning and memory abilities;Morris water maze

[收稿日期：2015-09-28]

作者簡介：倪磊，女，1965-11生，本科，實驗師，E-mail：nilei@mail.xjtu.edu.cn.

中圖分類號：R338

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0022-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.006

基金項目：陜西省科技資源開放共享平臺基金資助項目(2015FWPT-14);陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃基金資助項目(2014JM2-3032)