鄒三鵬， 沙煥臣 (廣東醫(yī)學(xué)院附屬惠東醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，惠州　56300； 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科；通訊作者，E-mail: shahuanchen9@63.com)

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17-β-雌二醇對人肝細(xì)胞癌細(xì)胞MHCC97H侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制

鄒三鵬1， 沙煥臣2*(1廣東醫(yī)學(xué)院附屬惠東醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，惠州516300；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科；*通訊作者，E-mail: shahuanchen229@163.com)

摘要：目的觀察17-β-雌二醇對人MHCC97H肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，探討其相應(yīng)機(jī)制。方法用不同濃度17-β-雌二醇(0，0.1，1，10 μmol/L)干預(yù)MHCC97H肝癌細(xì)胞24 h。Transwell小室法檢測17-β-雌二醇干預(yù)后MHCC97H肝癌細(xì)胞侵襲能力的改變。利用real-time PCR和Western blot法檢測17-β-雌二醇干預(yù)對MHCC97H肝癌細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin RNA和蛋白表達(dá)水平的改變。Western blot檢測17-β-雌二醇對MHCC97H細(xì)胞中Smad2和p-Smad2蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H肝癌細(xì)胞的侵襲能力，隨著濃度的升高抑制能力逐漸增強(qiáng)(P<0.05)。當(dāng)濃度超過0.1 μmol/L 時(shí)，17-β-雌二醇能夠有效抑提高M(jìn)HCC97H肝癌細(xì)胞中E-cadherin的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并同時(shí)抑制細(xì)胞中Vimentin蛋白的表達(dá)(P<0.05)；當(dāng)濃度超過0.2 μmol/L 時(shí)，17-β-雌二醇能夠有效抑制Vimentin的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)。進(jìn)一步的檢測發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度超過0.1 μmol/L 時(shí)，17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H細(xì)胞中Smad2的磷酸化水平(P<0.05)。結(jié)論17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H肝癌細(xì)胞的侵襲，這種作用可能與其通過抑制Smad2的磷酸化進(jìn)一步調(diào)節(jié)E-cadherin和Vimentin的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：17-β-雌二醇；肝細(xì)胞癌；MHCC97H細(xì)胞；細(xì)胞侵襲；Smad 2;E-cadherin;Vimentin

肝細(xì)胞癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，具有高死亡率和治療手段有限的特點(diǎn)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，肝癌在男性中的發(fā)病率明顯高于女性[1]。同時(shí)又有研究發(fā)現(xiàn)，在從慢性肝病向肝癌發(fā)展的過程中男性患者的進(jìn)展速度也明顯快于女性，且預(yù)后較差[2]，男性慢性肝病患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是女性患者的3-5倍，在用嚙齒類動物構(gòu)建的肝癌模型中，雄性動物發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于雌性。關(guān)于雄激素的研究發(fā)現(xiàn)，雄性激素能夠誘導(dǎo)并加快肝癌的發(fā)展進(jìn)程[3]，異常的雄性激素的代謝改變也與肝癌的發(fā)生相關(guān)[4]。侵襲轉(zhuǎn)移是造成肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、治療失敗和死亡的主要原因[1-3]，抗肝癌侵襲轉(zhuǎn)移新藥的開發(fā)意義重大，是延長肝癌患者生存期、提高遠(yuǎn)期療效的重要措施。但至今仍缺乏有效的防治手段。關(guān)于17-β-雌二醇與肝癌關(guān)系，當(dāng)前的研究還沒有得到一致的結(jié)論[3,5-9]?；谝陨媳狙芯繑M探討17-β-雌二醇與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

人高侵襲性MHCC97H肝癌細(xì)胞株購于上海市復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所。DMEM和胎牛血清購自Sigma 公司，相關(guān)引物由TaKaRa公司合成構(gòu)建。Smad 2和p-Smad2購于Cellsignal公司，E-cadherin 和Vimentin 抗體購于Abcam公司，beta-actin購自Santa-Crus公司。17-β-雌二醇(Estradiol)為Sigma公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑均購自RT-PCR公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù)

MHCC97H肝癌細(xì)胞購于上海市復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所，使用含有100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代間隔約為2-3 d。17-β-雌二醇利用二甲基亞砜(DMSO)溶解，DMSO的最終濃度<0.1%，其后用PBS稀釋至工作濃度。待MHCC97H細(xì)胞長到融合后，PBS洗滌3次，加入無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，其后按照實(shí)驗(yàn)要求加入相應(yīng)濃度17-β-雌二醇和含有相應(yīng)濃度DMSO的PBS(對照)。17-β-雌二醇的濃度均為0,0.1,1,10 μmol/L，處理時(shí)間為24 h。其后提取總RNA和蛋白進(jìn)行real time PCR和免疫印跡分析。

1.3細(xì)胞侵襲試驗(yàn)

取對數(shù)生長期MHCC97H肝癌細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化后利用含有20 ml/L血清濃度的培養(yǎng)基制成5×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，在Tranwell小室上室中加入含有不同濃度17-β-雌二醇的細(xì)胞懸液0.5 ml，下室中加入1 ml血清濃度為100 ml/L的常規(guī)培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，然后取出小室對細(xì)胞進(jìn)行固定，用棉簽去除上室中殘留細(xì)胞并對小室底部的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和拍照，并在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR檢測苦參堿對E-cadherin 和Vimentin轉(zhuǎn)錄的影響

Trizol法提取各組細(xì)胞中總RNA，根據(jù)TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)并對結(jié)果進(jìn)行分析，引物設(shè)計(jì)：E-cadherin為5′-TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3′和3′-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-5′，Vimentin 為5′-TGAGTACCGGAGACAGGTGCAG-3′和3′-TAGCAGCTTCAACGGCAAAGTTC-5′，β-actin 為5′-CCATCGTCCACCGCAAAT-3′和3′-CATGCCAATCTCATCTTGTTT-5′。

1.5免疫印跡試驗(yàn)

17-β-雌二醇處理MHCC97H肝癌細(xì)胞24 h，常規(guī)消化細(xì)胞后冰PBS洗滌2次，加入裂解液裂解細(xì)胞，離心提取細(xì)胞總蛋白。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，并根據(jù)蛋白提取物濃度確定上樣量。每次試驗(yàn)之前將蛋白煮沸變性、然后在SDS凝膠中每孔加入等量蛋白，根據(jù)目的蛋白的分子量調(diào)整電泳時(shí)間和電壓，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置于在50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h。根據(jù)抗體說明書配置一抗?jié)舛?，然后將膜封閉于含有各種抗體的溶液中，4 ℃搖床過夜。次日PBST洗膜3次，然后常溫封閉相應(yīng)二抗1 h、再次用PBST洗滌3次，最后一次用PBS洗滌，洗滌時(shí)間均為15 min。最后利用成像系統(tǒng)對結(jié)果圖像進(jìn)行采集，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.117-β-雌二醇對MHCC97H肝癌細(xì)胞侵襲的影響

MHCC97H肝癌細(xì)胞的侵襲能力較強(qiáng)，對照組培養(yǎng)24 h，穿過基質(zhì)膠到達(dá)小室底端的細(xì)胞較多。在17-β-雌二醇干預(yù)后，MHCC97H肝癌細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制，穿過基質(zhì)膠到達(dá)小室底端的肝癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，隨著17-β-雌二醇濃度的增加，穿過基質(zhì)膠到達(dá)小室底端的MHCC97H肝癌細(xì)胞的數(shù)目逐漸減少(見圖1A)，0.1，1，10 μmol/L濃度組MHCC97H肝癌細(xì)胞穿過基質(zhì)膠到達(dá)小室底端的細(xì)胞數(shù)目，分別為對照組的(70.11±9.11)%、(49.34±10.52)%和(43.32±14.63)%，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05，見圖1B)。

2.217-β-雌二醇對E-cadherin和Vimentin的轉(zhuǎn)錄水平的影響

為了進(jìn)一步檢測17-β-雌二醇抑制MHCC97H肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我們利用real-time PCR技術(shù)檢測了17-β-雌二醇對E-cadherin和Vimentin mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)17-β-雌二醇能夠在RNA水平明顯抑制Vimentin的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)能夠有效增強(qiáng)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。在17-β-雌二醇作用后，E-cadherin的表達(dá)水平逐漸降低，而Vimentin的表達(dá)水平逐漸升高。

2.317-β-雌二醇對MHCC97H肝癌細(xì)胞中E-cadherin和N-cadherin表達(dá)的影響

E-cadherin和Vimentin在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。在17-β-雌二醇干預(yù)后，MHCC97H肝癌細(xì)胞中，Vimentin的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而E-cadherin的蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

圖1　不同濃度17-β-雌二醇對MHCC97H細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 Figure 1　The inhibition effect of 17-β-oestrogen on the invasion of MHCC97H cells

與對照組(0 μmol/L)比較,**P<0.01圖2　17-β-雌二醇對MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin轉(zhuǎn)錄水平的影響Figure 2　The effect of 17-β-oestrogen on the expression of E-cadherin and Vimentin in HeLa cells

2.417-β-雌二醇對MHCC97H肝癌細(xì)胞中Smad2和p-Smad2的影響

Smad2的磷酸化水平的改變，能夠通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。我們的結(jié)果顯示，在17-β-雌二醇作用后Smad2的磷酸化水平明顯降低，0.1 μmol/L組、1 μmol/L組和10 μmol/L組分別為對照組的(81.92±23.94)%、(65.38±22.39)%和(47.06±1.47)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

圖3　不同濃度17-β-雌二醇對MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平的影響Figure 3　The inhibition effect of 17-β-oestrogen on the expression of E-cadherin and Vimentin of protein level in MHCC97H cells

3討論

關(guān)于17-β-雌二醇在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中作用至今尚未有定論，但是流行病學(xué)調(diào)查顯示，肝癌在男性患者中的發(fā)病率明顯較高且預(yù)后較差。而侵襲轉(zhuǎn)移是造成肝癌患者死亡主要原因，所以明確17-β-雌二醇在肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程的作用具有重要的理論價(jià)值和社會意義。我們的研究結(jié)果顯示，17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H肝癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力，提示17-β-雌二醇在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

圖4　不同濃度17-β-雌二醇對Smad2和p-Smad2表達(dá)的影響 Figure 4　The effect of 17-β-oestrogen on the expression of Smad2 and p-Smad2

近年來研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與多種腫瘤密切相關(guān)，在肝癌等多種癌癥的原位浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4]。此外,EMT在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮極為重要的作用，在肝炎病毒感染階段，病毒的感染會導(dǎo)致正常肝細(xì)胞通過EMT轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞等能夠促進(jìn)肝纖維化的細(xì)胞，從而引起肝纖維化和肝硬化。同時(shí)病毒合成的蛋白還能夠通過上調(diào)TGF-β相關(guān)信號通路的活性，促進(jìn)EMT的發(fā)生從而使得肝細(xì)胞變成無限增殖的腫瘤細(xì)胞成為可能[5]。在肝癌發(fā)生的早期，許多肝癌細(xì)胞能夠通過EMT獲得較強(qiáng)的侵襲能力，從而從原發(fā)腫瘤脫離發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，這也是肝癌患者容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移的重要原因之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)EMT在肝癌早期播散過程中發(fā)揮重要作用，而twist和vimentin可以作為肝癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的早期診斷指標(biāo)[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)vimentin高表達(dá)和E-cadherin低表達(dá)與肝癌的惡性特征相關(guān)，該研究還認(rèn)為E-cadherin可以作為判斷肝癌預(yù)后的一個獨(dú)立指標(biāo)[8]。通過對肝癌患者的標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)，E-cadherin低表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后較差相關(guān)[9]?？傊?EMT在肝癌發(fā)生發(fā)展的整個過程中均發(fā)揮重要作用，在肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中，肝癌細(xì)胞會發(fā)生上皮標(biāo)記的丟失(E-cadherin)及間質(zhì)標(biāo)記的獲得(N-cadherin 和 Vimentin等)。其中E-cadherin的丟失或者破壞是EMT進(jìn)程的標(biāo)志[4,10]。Vimentin是EMT的一個重要間質(zhì)標(biāo)記，是間質(zhì)細(xì)胞遷徙的重要調(diào)節(jié)者之一。在關(guān)于乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Vimentin在Slug誘導(dǎo)的乳腺癌EMT進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[11]。而作為EMT過程中重要的間質(zhì)標(biāo)記，N-cadherin在腫瘤細(xì)胞EMT及腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)的化療耐藥發(fā)揮重要作用[12,13]。本研究的結(jié)果顯示，17-β-雌二醇能夠有效抑制Vimentin的表達(dá)，同時(shí)提高E-cadherind的表達(dá)，提示17-β-雌二醇對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用可能與其對肝癌細(xì)胞EMT進(jìn)程的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。

TGF-β1是TGF中的一類，是EMT發(fā)生的一個重要的誘導(dǎo)因子，已經(jīng)證實(shí)，在多種高表達(dá)TGF-β1的腫瘤中，TGF-β1可以自分泌和旁分泌的形式作用于腫瘤細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞表面的TGF-β2受體結(jié)合，其后TGF-β2受體通過直接磷酸化的方式活化TGF-β1受體，其后細(xì)胞內(nèi)Smad2 和 Smad3受體發(fā)生磷酸化，然后與Smad4形成三聚體入核調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)和維持細(xì)胞EMT[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，17-β-雌二醇能夠抑制Smad2的磷酸化，提示其對E-cadherin和Vimentin的調(diào)節(jié)作用可能與其對TGF/Smad信號通路的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而這種作用可能是通過調(diào)節(jié)TGF/Smad信號通路的活性進(jìn)一步調(diào)節(jié)E-cadherin和Vimentin的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。我們的研究結(jié)果為進(jìn)一步明確17-β-雌二醇在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of 17-β-oestrogen on invasion of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H cells and its mechanism

ZOU Sanpeng1， SHA Huanchen2*

(1DepartmentofOncology,AffiliatedHuidongHospitalofGuangdongMedicalCollege,Huizhou516300,China;2DepartmentofHepatobiliarySurgery,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:shahuanchen229@163.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the anti-metastatic effect of oestrogen on invasion of human hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H cells and its possible mechanism.MethodsMHCC97H cells were treated with different concentrations of oestrogen(0, 0.1,1,10 μmol/L)for 24 h. The inhibitory effects of oestrogen on the migration and invasion of MHCC97H cells were measured by Transwell assay. Moreover, real time PCR and Western blot were used for investigating the expression of E-cadherin, Vimentin, Smad 2 and p-Smad 2.ResultsThe 17-β-oestrogen significantly inhibited the migration and invasion of MHCC97H cells in a dose-dependent manner(P<0.05). When the concentration was above 0.1 μmol/L, 17-β-oestrogen significantly down-regulated protein expression of Vimentin, the phosphorylation level of Smad 2, and up-regulated the RNA and protein levels of E-cadheirn(P<0.05). When the concentration was above 0.2 μmol/L, 17-β-oestrogen significantly down-regulated RNA level of Vimentin(P<0.05).ConclusionThe results suggest that oestrogen may effectively inhibit the epithelial-mesenchymal transition(EMT) of HCC, which may be related to the regulation of E-cadherin and Vimentin in MHCC97H cells through inhibiting the phosphorylation of Smad 2.

Key words:17-β- oestrogen;hepatocellular carcinoma;MHCC97H cells;cell invasion;Smad 2;E-cadherin;Vimentin

[收稿日期：2015-10-12]

作者簡介：鄒三鵬，男， 1969-10生，博士，副主任醫(yī)師，E-mail：zspdoctor@163.com.

中圖分類號：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0014-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.004