潘良盈， 劉震雄， 張　哲， 趙　麗， 李慧艷， 趙曙光(第四醫(yī)軍大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科，西安　710038；通訊作者，E-mail：zsg1203@126.com)

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脂多糖對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞caspase-1及IL-18表達(dá)的影響

潘良盈， 劉震雄， 張哲， 趙麗， 李慧艷， 趙曙光*(第四醫(yī)軍大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科，西安710038；*通訊作者，E-mail：zsg1203@126.com)

摘要：目的觀察脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞NLRP3活化時(shí)caspase-1及IL-18表達(dá)的變化。方法常規(guī)培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞，用RT-PCR檢測(cè)LPS誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞2 h時(shí)NLRP3炎癥小體及caspase-1,IL-18 mRNA的表達(dá)，熒光定量PCR檢測(cè)不同濃度LPS(0，0.05，0.1，0.2 μg/ml)誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞不同時(shí)間(30，60，120 min)時(shí)caspase-1及IL-18 mRNA的表達(dá)。結(jié)果LPS誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞在30 min和60 min時(shí)，隨著LPS濃度增加caspase-1和IL-18 mRNA表達(dá)增高，0.1和0.2 μg/ml組均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05)；120 min時(shí)，隨著LPS濃度增加caspase-1和IL-18 mRNA表達(dá)逐漸降低，其中0.05 μg/ml組較0 μg/ml組顯著降低(P<0.05)。隨LPS誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，0.05 μg/ml組caspase-1 和IL-18 mRNA表達(dá)逐漸增加；在0.1 μg/ml和0.2 μg/ml組，caspase-1 mRNA 表達(dá)逐漸降低，其中120 min組較30 min組顯著降低(P<0.05)；IL-18 mRNA表達(dá)水平先升高后降低，均在60 min時(shí)達(dá)最高水平(P<0.01)。結(jié)論LPS能夠促進(jìn)肝星狀細(xì)胞炎癥小體NLRP3表達(dá)，激活NLRP3，誘導(dǎo)HSC-T6分泌caspase-1及IL-18。

關(guān)鍵詞：脂多糖；非酒精性脂肪性肝炎；肝星狀細(xì)胞；NLRP3炎癥小體

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。NASH動(dòng)物模型及患者常有代謝性內(nèi)毒素血癥，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)經(jīng)門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，誘導(dǎo)庫普細(xì)胞(Kuppfer cell，KC)活化，產(chǎn)生炎癥因子，觸發(fā)肝臟胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，在NASH發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2-4]。同時(shí)，LPS作為Toll樣受體4的配體，也能活化炎癥小體NLRP3，產(chǎn)生具有酶活性半胱氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)，介導(dǎo)IL-1β和IL-18等炎癥因子由前體轉(zhuǎn)化為活性形式并分泌到胞外，參與肝臟IR的發(fā)生[5]。已證實(shí)，NLRP3與NASH的發(fā)生密切相關(guān)，敲除NLRP3可以阻止高脂飲食導(dǎo)致的IR、肥胖和NASH的進(jìn)展[6-9]。目前研究LPS誘導(dǎo)肝臟NLRP3活化多集中在Kuppfer細(xì)胞和肝細(xì)胞，有研究[10]表明肝星狀細(xì)胞也表達(dá)NLRP3，LPS誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化對(duì)caspase-1及其下游炎癥因子表達(dá)如何影響，目前報(bào)道不多[11]。本研究利用大鼠肝星狀細(xì)胞，觀察LPS誘導(dǎo)NLRP3活化時(shí)caspase-1和IL-18表達(dá)的變化，對(duì)于進(jìn)一步豐富LPS參與NASH發(fā)病的機(jī)制有重要意義。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株與主要試劑

實(shí)驗(yàn)用大鼠肝臟星狀細(xì)胞HSC-T6購自中國(guó)科學(xué)院上海生物細(xì)胞庫。無抗生素的DMEM、0.5 g/L胰酶EDTA溶液購自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)購自美國(guó)Gibco公司；LPS購自美國(guó)Sigma公司；RNA simple Total RNA Kit、DNA maker購自北京Tiangen公司；PrimeScript TMRT Master Mix、Premix TaqTM、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKara 公司。

1.2LPS刺激細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

常規(guī)培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6，使用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)期的大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6，采用0.25%胰酶消化，將HSC-T6細(xì)胞按5×106/ml接種于6孔板(用含10%胎牛血清的DMEM稀釋)，培養(yǎng)24 h后，用含0.5%胎牛血清的DMEM饑餓16 h，加入不同終濃度的LPS(0，0.05，0.1，0.2 μg/ml)，各組分別培養(yǎng)30，60，120 min。

1.3提取總RNA轉(zhuǎn)錄合成cDNA

應(yīng)用離心柱型總RNA提取試劑盒，按試劑盒的說明書進(jìn)行操作分別提取總RNA，并用超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算總RNA的濃度，A260/A280在1.8-2.0之間。用PrimeScript TMRT Master Mix 試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA模板，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.4反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR(real time PCR)檢測(cè)LPS誘導(dǎo)后HSC-T6中caspase-1、IL-18 mRNA表達(dá)

根據(jù)Genbank中公布的各待測(cè)基因的基因序列設(shè)計(jì)引物，NLRP3上游引物：5′-TGC ATG CCG TAT CTG GTT GT-3′，下游引物：5′-AGC TGA GCA AGC TAA AGG CT-3′，產(chǎn)物大小134 bp；caspase-1上游引物：5′-CCG AGT GGT TCC CTC AAG TT-3′，下游引物：5′-CCG ACT CTC CGA GAA AGA TG-3′，產(chǎn)物大小158 bp；IL-18上游引物：5′-TGG AAT CAG ACC ACT TTG GC-3′，下游引物：5′-GTC TGG TCT GGG ATT CGT TG-3′，產(chǎn)物大小150 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-TAC CCA CGG CAA GTT CAA CG-3′，下游引物：5′-CAC CAG CAT CAC CCC ATT TG-3′，產(chǎn)物大小122 bp。RT-PCR反應(yīng)體系為：Premix Taq 25 μl，模板cDNA 2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，滅菌蒸餾水加至50 μl。反應(yīng)條件為：98 ℃ 10 s，56-57 ℃30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。real time PCR反應(yīng)體系如下：SYBR?Premix Ex Taq 12.5 μl，上游引物(10 μmol/L)1.0 μl，下游引物(10 μmol/L)1.0 μl，模板cDNA 12 μl，加dH2O 至25.0 μl。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s，PCR反應(yīng)95 ℃ 3 s，56 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

RT-PCR 瓊脂凝膠電泳經(jīng)成像所得圖像用Lane 1D分析軟件分析處理，real time PCR所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。采用SPSS 13.0軟件，結(jié)果用表示，采用方差分析或LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1LPS誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞表達(dá)caspase-1和IL-18 mRNA

用0,0.05,0.1,0.2 μg/ml LPS誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞，檢測(cè)30,60,120 min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)caspase-1和IL-18 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，三個(gè)不同濃度LPS在不同時(shí)間點(diǎn)均可誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞表達(dá)caspase-1和IL-18 mRNA(見圖1)。

M.Marker；1-4.分別為0,0.2，0.1，0.05 μg/ml LPS處理組； 5.GAPDH圖1　LPS誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞2 h時(shí)NLRP3、caspase-1和IL-18 mRNA的表達(dá)Figure 1　Expression of NLRP3,caspase-1 and IL-18 mRNA in rat hepatic stellate cells induced by LPS for 2 h

2.2不同濃度LPS誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞對(duì)不同時(shí)間caspase-1 mRNA表達(dá)的影響

LPS誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞在30 min和60 min時(shí)，隨著LPS濃度增加caspase-1 mRNA表達(dá)增高，0.1 μg/ml和0.2 μg/ml組均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05)，120 min時(shí)間點(diǎn)，隨著LPS濃度增加caspase-1 mRNA表達(dá)逐漸降低，其中0.05 μg/ml組較0 μg/ml組顯著降低(P<0.05)。隨LPS誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，0.05 μg/ml組caspase-1 mRNA表達(dá)逐漸增加(P>0.05)；0.1 μg/ml組和0.2 μg/ml組表達(dá)逐漸降低，其中120 min時(shí)較30 min時(shí)顯著降低(P<0.05，見表1)。

組別30min60min120min0μg/ml組1.00±0.001.00±0.001.00±0.00 0.05μg/ml組1.48±0.351.52±0.342.07±0.35*0.1μg/ml組2.22±0.38*1.76±0.16*1.60±0.48#0.2μg/ml組2.39±0.63*2.28±0.31*1.36±0.40#

與0 μg/ml相比，*P<0.05；與30 min相比，#P<0.05

2.3不同濃度LPS誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞對(duì)不同時(shí)間IL-18 mRNA表達(dá)的影響

LPS誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞在30 min和60 min時(shí)，隨著LPS濃度增加IL-18 mRNA表達(dá)均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05)；在120 min時(shí)間點(diǎn)，隨著LPS濃度增加IL-18 mRNA表達(dá)逐漸降低，但各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。隨LPS誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，0.05 μg/ml組IL-18 mRNA表達(dá)增高，其中120 min時(shí)較30 min時(shí)顯著增高(P<0.01)；0.1 μg/ml和0.2 μg/ml組表達(dá)先增加后降低，60 min時(shí)表達(dá)最高，且顯著高于其余兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(P<0.05，見表2)。

與0 μg/ml組相比，*P<0.05，**P<0.01；與30 min相比，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；與120 min組相比，#P<0.01

3討論

近年NASH發(fā)病率明顯上升，已成為慢性肝病及隱源性肝硬化的主要病因之一[1]，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。正常腸道菌群與高脂飲食相互作用產(chǎn)生代謝性內(nèi)毒素血癥，LPS水平增高，經(jīng)門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟誘導(dǎo)KC浸潤(rùn)、活化，合成多種炎癥因子，觸發(fā)肝臟IR，導(dǎo)致NASH發(fā)生。研究表明，這些腸道來源的LPS可以引起肝臟NLRP3活化，敲除NLRP3對(duì)NASH發(fā)病發(fā)揮保護(hù)作用[5,8,9,12]。新近研究發(fā)現(xiàn)[10]，NLRP3表達(dá)水平與肝臟細(xì)胞種類有關(guān)，KC和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)，肝星狀細(xì)胞中度表達(dá)，原代培養(yǎng)肝細(xì)胞幾乎不表達(dá)。既往對(duì)LPS誘導(dǎo)肝臟NLRP3活化，研究對(duì)象多為肝細(xì)胞和Kuppfer細(xì)胞，而對(duì)肝星狀細(xì)胞研究較少[8,10-12]。本研究表明，LPS能夠誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞NLRP3活化，且進(jìn)一步誘導(dǎo)caspase-1及IL-18的表達(dá)，有可能通過此途徑參與NASH的發(fā)病。

NLRP3與凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)和caspase-1相互結(jié)合形成炎癥小體[13]，NLRP3通過感受肥胖所導(dǎo)致的危險(xiǎn)信號(hào)，促進(jìn)肥胖導(dǎo)致的炎癥和IR，參與NASH的發(fā)病。Csak等[12]發(fā)現(xiàn)NASH小鼠肝臟NLRP3、ASC、caspase-1表達(dá)高于對(duì)照組，提示NASH中存在炎癥小體活化。分別缺失caspase-1、ASC及NLRP3的小鼠，高脂飲食誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性輕于對(duì)照組，且缺乏caspase-1的小鼠脂肪組織中巨噬細(xì)胞的數(shù)量下降。敲除NLRP3改善高脂飲食引起的小鼠肝臟和脂肪組織IR[8]。因此，caspase-1表達(dá)是LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的重要環(huán)節(jié)，本研究表明， LPS能夠誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞NLRP3活性升高，進(jìn)而導(dǎo)致caspase-1 mRNA表達(dá)增加，且隨LPS濃度增高而表達(dá)上調(diào)，隨時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)減少，與以前研究[14]報(bào)道LPS導(dǎo)致肝臟NLRP3活化時(shí)caspase-1 mRNA表達(dá)特點(diǎn)并不一致，可能與該研究檢測(cè)的是肝臟各種細(xì)胞受LPS刺激后caspase-1 mRNA的總和，而各種細(xì)胞受LPS刺激后caspase-1 mRNA表達(dá)的規(guī)律并不完全一致有關(guān)。

NLRP3炎癥小體在被激活前處于自身抑制狀態(tài)，NLRP3與配體結(jié)合后，形成成熟的caspase-1，剪切無活性的IL-1β和IL-18前體為成熟的活性形式，分泌到細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。缺乏caspase-1小鼠導(dǎo)致IL-1β和IL-18合成和分泌障礙。目前研究證實(shí)，IL-1β和IL-18與IR的發(fā)生關(guān)系密切[8,9,15]。清除NLRP3炎癥小體能夠降低IL-18水平，改善脂質(zhì)細(xì)胞的代謝功能，并增強(qiáng)其胰島素敏感性[8]。因此，caspase-1的表達(dá)對(duì)于其下游細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮非常重要的作用。本研究表明，LPS能夠誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞NLRP3活性升高，隨后使caspase-1表達(dá)增加，促進(jìn)IL-18的合成。IL-18 mRNA表達(dá)隨LPS濃度增加而下降，隨時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)增加,與在體觀察到肝臟IL-18總的變化特點(diǎn)相一致[14]。

總之，本研究表明LPS能夠誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞NLRP3活化，進(jìn)而導(dǎo)致caspase-1和IL-18表達(dá)上調(diào)，可能通過各種炎癥因子相互作用，導(dǎo)致肝臟IR。由于肝星狀細(xì)胞活化與肝臟纖維化的發(fā)生密切相關(guān)，觀察NLRP3活化對(duì)肝纖維化的影響可能有助于進(jìn)一步闡明星狀細(xì)胞在NASH發(fā)病中的作用。

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Effects of lipopolysaccharide on caspase-1 and IL-18 expression in rat hepatic stellate cells

PAN Liangying, LIU Zhenxiong, ZHANG Zhe, ZHAO Li, LI Huiyan, ZHAO Shuguang*

(DepartmentofGastroenterology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China;*Correspondingauthor,E-mail:zsg1203@126.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of caspase-1 and IL-18 in hepatic stellate cells when NLRP3 activation is induced by lipopolysaccharide(LPS). MethodsRat hepatic stellate cells were conventionally cultured. The expression levels of NLRP3, caspase-1 and IL-18 mRNA in hepatic stellate cells induced by LPS for 2 h were detected by RT-PCR, and the caspase-1 and IL-18 mRNA expression levels were detected by quantitative PCR at different time points(30,60,120 min) when stellate cells were induced by different doses of LPS(0,0.05,0.1,0.2 μg/ml).Results At 30 min and 60 min, the caspase-1 and IL-18 mRNA expression levels increased in a concentration-dependent manner, and they were significantly higher in 0.1 μg/ml and 0.2 μg/ml group than in 0 μg/ml group(P<0.05). At 120 min, the expression of caspase-1 and IL-18 mRNA was decreased in a concentration-dependent manner, and it was significantly lower in 0.05 μg/ml group than in 0 μg/ml group(P<0.05).With the enlargement of treatment, the caspase-1 and IL-18 mRNA expression was increased in 0.05 μg/ml group, while the caspase-1 mRNA expression decreased in 0.1 μg/ml and 0.2 μg/ml group, it was significantly lower at 120 min than at 30 min(P<0.05). The IL-18 mRNA expression was increased first and then reduced, and peaked at 60 min(P<0.01).ConclusionLPS can promote the inflammasome NLRP3 expression in hepatic stellate cells, activate the NLRP3, and thus induce the HSC-T6 secreting caspase-1 and IL-18.

Key words:LPS;nonalcoholic steatohepatitis;stellate cells;NLRP3 inflammasome

[收稿日期：2015-09-24]

作者簡(jiǎn)介：潘良盈，女，1987-08生，在讀碩士，E-mail：panly1025@163.com.

中圖分類號(hào)：R575

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)01-0010-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.003

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(81170376，81270485)