付國強， 曹義戰(zhàn)， 何乾鋒， 田小溪， 王伯良(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院急診科,西安　710038； 通訊作者，E-mail: wliang@fmmu.edu.cn)

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N-3不飽和脂肪酸對C57BL/6 PD-1基因敲除小鼠心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響

付國強， 曹義戰(zhàn)， 何乾鋒， 田小溪， 王伯良*(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院急診科,西安710038；*通訊作者，E-mail: wliang@fmmu.edu.cn)

摘要：目的觀察N-3不飽和脂肪酸飼養(yǎng)對C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房細(xì)胞氧化應(yīng)激水平變化及心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響。方法流式細(xì)胞儀檢測心房肌細(xì)胞活性氧，比較C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠和、N-3不飽和脂肪酸飼養(yǎng)的C57BL/6-PD-1-/-小鼠(每組10只，雄性，6-8周齡)的心房肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，Masson染色檢測心房肌纖維化水平，電子天平稱重檢測心臟/體質(zhì)量比值變化。結(jié)果與C57BL/6小鼠比較，C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯升高(P<0.05)，心房肌Masson染色顯示基因敲除后心房肌出現(xiàn)了明顯纖維化、心臟/體質(zhì)量比值明顯升高(P<0.001)，N-3不飽和脂肪酸飼養(yǎng)后的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(P<0.05)及心房肌纖維化、心臟/體質(zhì)量比值(P<0.01)升高趨勢得到明顯遏制。結(jié)論PD-1基因敲除C57BL/6小鼠的心房肌細(xì)胞活性氧水平升高，同時出現(xiàn)了的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，N-3不飽和脂肪酸飼養(yǎng)能夠遏制這種變化趨勢。

關(guān)鍵詞：PD-1基因敲除；N-3不飽和脂肪酸；活性氧；心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)；心房纖顫

心房顫動(房顫)是臨床上最常見并且危害嚴(yán)重的心律失常疾病，普通人群的發(fā)病率約為2%，且隨著年齡的增長發(fā)病率迅速升高，與非房顫患者相比，房顫患者死亡率及心血管病事件風(fēng)險明顯升高[1]。房顫的發(fā)病機制比較復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為房顫起源于存在于心房的多發(fā)折返環(huán)[2]，但對于多發(fā)折返環(huán)的產(chǎn)生機制仍然未得到完全闡明。近年來，有研究證實心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)能夠促進(jìn)心房內(nèi)多發(fā)折返環(huán)生成而使得房顫發(fā)病易感性增高[3]。

程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)是T細(xì)胞表面的CD28家族的一個重要的負(fù)性共刺激分子，PD-1基因的缺失或PD-1及其配體途徑阻斷可以增強T細(xì)胞活性，提高體內(nèi)的炎癥水平[4]。氧化應(yīng)激主要指在細(xì)胞代謝過程中所產(chǎn)生的對機體具有損害作用的活性氧(reactive oxygen species，ROS)。在許多病理生理學(xué)條件下，炎癥可以加強氧化應(yīng)激水平，反之亦然。已有研究表明，炎癥和氧化應(yīng)激與心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)密切相關(guān)[5]。

那么，伴隨著PD-1-/-小鼠機體的高炎癥狀態(tài)是否會影響小鼠心房肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，并進(jìn)而對小鼠心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)產(chǎn)生影響？本研究應(yīng)用抗炎藥物N-3不飽和脂肪酸飼料添加，對比了C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠和N-3不飽和脂肪酸飼養(yǎng)的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌氧化應(yīng)激水平和心房心肌纖維化水平，心臟/體質(zhì)量比值變化，旨在探究炎癥、氧化應(yīng)激與心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)之間的關(guān)系。

1材料和方法

1.1主要儀器及試劑

主要儀器：BD FACScalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，Langendorff 離體灌注儀(美國 Radnoti 公司)，石蠟切片機，電子天平(美國Sartorius公司)

主要試劑：二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA，美國Sigma-Aldrich 公司)，牛血清白蛋白、無血清培養(yǎng)基、膠原酶Ⅰ、胰蛋白酶 (美國 Sigma 公司)。

1.2實驗動物

C57BL/6-PD-1-/-小鼠由日本京都大學(xué)的Tasuku Honjo教授免費轉(zhuǎn)讓，實驗小鼠分為3組：C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠和、N-3不飽和脂肪酸飼養(yǎng)的C57BL/6-PD-1-/-小鼠，每組10只，雄性，6-8周齡。實驗前均飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物教研室SPF級實驗動物中心。實驗開始前4周，N-3不飽和脂肪酸飼養(yǎng)的C57BL/6-PD-1-/-小鼠，每只小鼠飼料中添加二十碳五烯酸+二十二碳六烯酸(EPA+DHA),各2.5 mg/d。

1.3血清不飽和脂肪酸濃度檢測

參考相關(guān)文獻(xiàn)中的方法[6]，通過氣相色譜法檢測血清不飽和脂肪酸濃度，在內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)磷脂酰膽堿存在的情況下提取血清中的脂類物質(zhì)，然后利用薄層色譜法從血清中性脂質(zhì)中分離提取磷脂質(zhì)，最后在磷脂質(zhì)中提取甲基脂肪酸類脂質(zhì)并在液相色譜儀上進(jìn)行分析。

1.4Langendorff小鼠離體心臟灌注獲取心房肌細(xì)胞

脫頸處死小鼠后迅速摘除心臟并主動脈插管，懸掛于Langendorff離體灌注儀上，通過主動脈實現(xiàn)冠狀動脈逆灌注，在冠狀動脈灌注過程中保持灌注液溫度在37 ℃并加入100%的氧氣。最初用普通的臺氏液灌注心臟清洗血液，然后用無鈣臺氏液灌注2 min，最后心臟用0.14 mg/ml膠原酶(Sigma-Aldrich)液灌注15 min左右。灌注結(jié)束后，分離心房并剪成碎片，用玻璃移液管吹散這些碎片形成單個細(xì)胞。800 r/min離心5 min，將細(xì)胞沉淀與含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基混勻，成纖維細(xì)胞差速貼壁1 h，更換培養(yǎng)基，無菌無毒條件下，置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)以備后續(xù)試驗。

1.5心房肌細(xì)胞活性氧(ROS)檢測

取培養(yǎng)24 h的心房肌細(xì)胞，用0.1%胰酶1 ml滴于培養(yǎng)瓶，覆蓋瓶底，當(dāng)細(xì)胞開始收縮棄去胰酶，PBS溫和清洗1次，放入2 ml無血清培養(yǎng)基，用彎頭吸管反復(fù)吹打，制備單個細(xì)胞懸液。心房肌細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基清洗2次，種植于96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml，加用DMSO配置的濃度為2 μmol/L的二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)0.5 ml，并在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，移入上樣管上流式細(xì)胞儀記錄數(shù)據(jù)。DCF的激發(fā)波長為495 nm，發(fā)射波長為525 nm，通過FL1檢測。

1.6心臟/體質(zhì)量比值測定及病理學(xué)檢查

實驗小鼠頸椎脫臼處死后用電子天平稱量體質(zhì)量(BW)后，迅速將心臟取出，PBS液中去除結(jié)締組織及殘血，濾紙吸干心臟表面殘留液體，用電子天平稱心臟質(zhì)量(HW)，計算心臟/體質(zhì)量比值(HW/BW)。然后將右心房剪下，標(biāo)本放入Bouin氏液中固定，供組織病理學(xué)檢查使用。常規(guī)石蠟包埋、切片。切片在Masson三色染色液(第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病理學(xué)實驗室)中浸入5 min，0.2%醋酸清洗10 s后用5%磷鎢酸處理10 min，然后用0.2%醋酸溶液再清洗2次，2%苯胺藍(lán)溶液染色5 min，醋酸清洗2次后梯度酒精脫水，二甲苯清洗中性樹膠封片。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1血清不飽和脂肪酸濃度比較

與C57BL/6組比較，血清不飽和脂肪酸濃度在C57BL/6-PD-1-/-小鼠組未見明顯升高，但經(jīng)過4周N-3不飽和脂肪酸喂養(yǎng)后，PUFAs組血清不飽和脂肪酸濃度較C57BL/6-PD-1-/-組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，見表1)。

表1三組實驗動物血清不飽和脂肪酸濃度比較 (%)

Table 1Concentrations of N-3 fatty acids in plasma phospholipids in three groups (%)

小鼠種類 N-3PUFAsEPA+DHAC57BJ65.7±0.63.1±0.6C57BL/6-PD-1-/-5.8±0.73.2±0.7N-3PUFA-C57BL/6-PD-1-/-8.2±0.9*5.7±1.0*

與C57BL/6-PD-1-/-小鼠比較，*P<0.001

2.2心房肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平檢測

通過流式細(xì)胞儀檢測心房肌細(xì)胞(每組10 000個)內(nèi)活性氧結(jié)果顯示，C57BL/6-PD-1-/-小鼠較C57BL/6小鼠心房肌細(xì)胞平均熒光強度明顯升高(30.29±2.26vs25.02±1.02，P<0.05)；飼喂N-3 PUFA的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌細(xì)胞平均熒光強度較未飼喂組明顯下降(27.20±1.71vs30.29±2.26，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3HW/BW比值比較

C57BL/6-PD-1-/-小鼠和C57BL/6小鼠比較，HW/BW比值明顯升高[(5.469±0.098)mg/gvs(5.145±0.089)mg/g，P<0.001]，飼喂N-3 PUFA的C57BL/6-PD-1-/-小鼠HW/BW比值上升得到較明顯的抑制[(5.328±0.101)mg/gvs(5.469±0.098)mg/g，P<0.01]。

2.4心房病理學(xué)檢查

心房肌Masson三色染色發(fā)現(xiàn)，在C57BL/6-PD-1-/-小鼠組出現(xiàn)了比較嚴(yán)重的心肌纖維化，而C57BL/6小鼠組未發(fā)現(xiàn)，飼料添加PUFA的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌纖維化程度有較明顯的下降趨勢。在C57BL/6-PD-1-/-小鼠組中可以看到大量染為藍(lán)色的膠原纖維，成團塊狀分布。而C57BL/6小鼠組心肌組織中中沒有看到膠原纖維，相對C57BL/6-PD-1-/-小鼠組，PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠組的心肌纖維化程度得到了較明顯的抑制。表現(xiàn)在染為藍(lán)色的膠原纖維明顯減少，呈現(xiàn)條索狀，且數(shù)量明顯減少(見圖3)。

圖1　三種小鼠及N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠心臟大體比較Figure 1　Comparison of gross of heart among three groups

圖2　C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠及N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠HW/BW比值比較Figure 2　Comparison of HW/BW ratio among three groups

A.C57BL/6小鼠(×200)；B.C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×200)；C.N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×200)；D. C57BL/6小鼠(×400)；E.C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×400)；F.N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×400)圖3　C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠及N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌纖維化程度比較Figure 3　Comparison of atrial myocardial fibrosis among three groups

3討論

程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)是T細(xì)胞表面的CD28家族的一個重要的負(fù)性共刺激分子，它通過和其配體程序性死亡因子配體-1/2(programmed death ligand-1/2,PD-L1/2)結(jié)合后負(fù)性調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[7]。敲除該基因能夠增強T細(xì)胞活性，提高體內(nèi)的炎癥水平。1998年有學(xué)者[8]成功制作出了PD-1基因敲除(PD-1-/-)小鼠，有研究證實PD-1-/-小鼠分泌炎性因子的能力明顯增強[9]。氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)氧化和抗氧化失衡，導(dǎo)致某些自由基的產(chǎn)生和抗氧化防御之間出現(xiàn)嚴(yán)重失衡的一種病理狀態(tài)。在許多病理生理情況下，炎癥和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，高炎癥水平往往伴隨著高氧化應(yīng)激水平。研究表明炎癥因子可以通過白細(xì)胞膜上NADPH氧化酶復(fù)合物的氧化作用產(chǎn)生活性氧，放大氧化應(yīng)激的反應(yīng)[10]；炎性細(xì)胞因子(IL-6，TNF-a)可直接誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基[11]，提高機體氧化應(yīng)激水平，而氧自由基又可以進(jìn)一步刺激炎癥細(xì)胞活化。因此，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)形成螺旋上升式的惡性循環(huán)。本研究結(jié)果顯示：C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平明顯升高，表明PD-1基因敲除小鼠本身伴隨的高炎癥狀態(tài)影響了小鼠心房肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，使其明顯升高。同時觀察到PD-1基因敲除小鼠出現(xiàn)了明顯的心房肌纖維化和心臟/體質(zhì)量比值增加，即出現(xiàn)了心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)。

炎癥、氧化應(yīng)激和心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)密切相關(guān)，研究表明：心房顫動患者的心房組織中通常存在炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子高表達(dá)[12]；氧化應(yīng)激主要產(chǎn)物是對機體具有損害作用ROS，ROS在血管緊張素Ⅱ所誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)中發(fā)揮了重要作用[12]；Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(ras related C3 botulinum toxin substrsye 1，Rac1)蛋白能夠通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)心房纖維化及心肌細(xì)胞肥大[14]。因此C57BL/6-PD-1-/-小鼠體內(nèi)高炎癥狀態(tài)和心房肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高可能導(dǎo)致了心房肌纖維化和心臟/體質(zhì)量比值增加。

飼料添加N-3不飽和脂肪酸(PUFAs)能夠降低實驗動物體內(nèi)系統(tǒng)性炎癥水平[15]。PUFAs主要包括兩個基本類型：N-6和 N-3，其中N-3 PUFAs人體不能合成，必須依靠食物攝取。N-3 PUFAs主要有三類：來源于植物的α-亞油酸(LNA:alpha-linolenic acid)，主要來源于海洋脊柱動物類和魚油中的十二碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)以及二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)。本實驗應(yīng)用DHA和EPA飼料添加補充N-3 PUFAs。結(jié)果顯示： N-3多聚不飽和脂肪酸飼料添加能夠通過其抗炎效應(yīng)對C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌重構(gòu)發(fā)揮了一定的抑制作用，表現(xiàn)在心肌纖維化程度、心臟/體質(zhì)量比值上升均得到了一定的抑制。由于N-3多聚不飽和脂肪酸具有確切的抗炎效果，研究結(jié)果提示炎癥和氧化應(yīng)激水平升高可能導(dǎo)致了C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)。由于心房重構(gòu)和房顫發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，實驗結(jié)果也高度提示飼料添加N-3多聚不飽和脂肪酸能夠降低炎癥所導(dǎo)致的房顫發(fā)病易感性，對于房顫具有一定的預(yù)防作用。

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Effects of N-3 polyunsaturated fatty acids on atrial structure remodeling by inhibiting atrial myocytes oxidative stress in C57BL/6 PD-1-/-mice

FU Guoqiang, CAO Yizhan, HE Qianfeng, TIAN Xiaoxi, WANG Boliang*

(DepartmentofEmergency,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China；*Correspondingauthor,E-mail:wliang@fmmu.edu.cn)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of dietary N-3 polyunsaturated fatty acids(PUFA) supplementation on the oxidative stress level and atrial structure remodeling in PD-1 deficient mice.MethodsThe level of cardiac atrium myocytes oxidative stress, heart weight/body weight(HW/BW)ratio and atrial myocardial fibrosis level were examined in male C57BL/6 mice(n=10), C57BL/6-PD-1-/-mice(n=10) and PUFA-C57BL/6-PD-1-/-mice(n=10). ResultsThe level of atrium myocytes oxidative stress and the HW/BW ratio in C57BL/6-PD-1-/-group were significantly higher than in C57BL/6 group(P<0.05 or P<0.001). The atrial myocardial fibrosis was detected in C57BL/6-PD-1-/-group but not in C57BL/6 group. After dietary N-3 PUFA supplementation, the level of atrium myocytes oxidative stress, HW/BW ratio and atrial myocardial fibrosis were dramatically attenuated in PUFA-C57BL/6-PD-1-/-group(P<0.05). ConclusionThe higher level of atrium myocytes oxidative stress in the C57BL/6PD-1-/-mice results in the atrial structural remodeling. Dietary N-3 PUFA supplementation can attenuate the atrial structure remodeling.

Key words:PD-1 deficiency;N-3 polyunsaturated fatty acids;reactive oxygen species;atrial structure remodeling;atrial fibrillation

[收稿日期：2015-11-04]

作者簡介：付國強，男，1976-09生，博士，主治醫(yī)師,講師，E-mail:fgq229@yeah.net.

中圖分類號：R363

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0001-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.001

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81070161)