張雪婷，褚明磊，劉　卅，李立風(fēng)，李衛(wèi)昌，王　琳，任　力

(1.華南理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640；

2.華南理工大學(xué) 國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣州 510006)

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細菌纖維素改性無紡布復(fù)合材料的制備及性能

張雪婷1,2，褚明磊1,2，劉卅1,2，李立風(fēng)1,2，李衛(wèi)昌1,2，王琳1,2，任力1,2

(1.華南理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640；

2.華南理工大學(xué) 國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣州 510006)

摘要：利用生物復(fù)合法制備細菌纖維素/無紡布復(fù)合材料(BC/N)，并對其結(jié)構(gòu)、含水率、失水率、力學(xué)性能進行測試，結(jié)合體外細胞培養(yǎng)對材料進行生物安全性研究，并通過原位復(fù)合法制備載Ag的BC/N材料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細菌纖維素(BC)與無紡布(Non)實現(xiàn)良好的復(fù)合，復(fù)合材料的含水率從410%提升到1 018%，失水率從82.39%降至48.07%，有效提高了復(fù)合材料的含水率及保濕性；BC/N的拉伸強度和斷裂伸長率較BC和Non有明顯提高；MTT結(jié)果顯示該材料具有良好的生物相容性；抗菌實驗表明載Ag的BC/N具有極佳的抗菌性，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率最大可達99.96%，99.93%。因此，該材料有望在醫(yī)用敷料領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：無紡布；細菌纖維素；保濕性能；生物相容性

0引言

無紡布(nonwovens，Non)，又稱非織造布[1]。Non作為敷料使用由來已久，且因價格低、使用便利而得到廣泛應(yīng)用[2-3]，但存在保液性能不佳、生物相容性差等缺陷[4]。

細菌纖維素(bacterial cellulose，BC)和植物纖維素均是由吡喃型葡萄糖單體通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的一種無分支、大分子直鏈聚合物，但在分子的高級結(jié)構(gòu)和存在狀態(tài)上，BC有明顯的區(qū)別[5-7]。近年來，BC以其良好的生物相容性、高持水性和結(jié)晶度、高張力和強度以及良好的納米纖維網(wǎng)絡(luò)而廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[8-9]；其中，較為常見的是其在醫(yī)用敷料中的應(yīng)用[10]。但BC在應(yīng)用過程中因本身較柔軟，貼合傷口時不易控制，大大限制了其應(yīng)用效率。

目前，A.Meftahi等[11]研究了BC與紗布的復(fù)合，但該研究僅注重紗布含水率和保濕性能的提升，沒有涉及其它性能的研究。因此本文旨在通過BC與Non的復(fù)合，一方面解決BC不易貼合的問題；另一方面改善Non單獨作為敷料使用存在的保濕能力差、生物相容性不佳等不足。并通過與Ag復(fù)合賦予材料抗菌性能。

1實驗

1.1材料

無紡布(PET)，廣州美博城；細菌學(xué)蛋白胨、瓊脂、酵母粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；木葡糖醋酸桿菌(ATCC700178)，美國ATCC公司；硼氫化鈉(NaBH4)，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；硝酸銀(AgNO3)，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2BC/N材料的制備及純化

以椰汁、1%酵母粉、0.6%蛋白胨、0.02%培養(yǎng)基配液1、0.01%培養(yǎng)基配液2、2%葡萄糖為原料配成培養(yǎng)基，滅菌后進行接種，擴增后加至培養(yǎng)皿中。將經(jīng)堿處理12 h后又處理至中性的Non經(jīng)滅菌后置于上述培養(yǎng)基中，再取適量培養(yǎng)基添加到Non上。室溫環(huán)境下分別培養(yǎng)2，4，6，8，10 d，即得到不同BC含量的BC/N。用蒸餾水反復(fù)沖洗后將其浸入0.1 mol/L的NaOH水溶液中，2 d后取出用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性即可。根據(jù)發(fā)酵時間的不同，將上述復(fù)合材料分別記為BN2，BN4，BN6，BN8，BN10。

1.3材料的理化性能表征

材料的FT-IR光譜是材料經(jīng)干燥后由美國Nicolet傅立葉紅外光譜儀(Nexus)直接進行分析所得，掃描波數(shù)范圍為500～4 000 cm-1。材料的形貌是材料經(jīng)冷凍干燥后對其表面及截面進行噴金處理后用荷蘭FEI公司的Nova nano430進行觀察所得。其含水率、失水率分別按式(1)、(2)測定。材料的力學(xué)性能用美國instron5967型萬能材料試驗機進行，并按式(3)、(4)計算拉伸強度、斷裂伸長率

(1)

(2)

其中，m′為初始樣品的質(zhì)量，即0 min時樣品的質(zhì)量，m″為在環(huán)境中放置15，30，60，240，480 min后樣品的質(zhì)量，m0為烘干后樣品的質(zhì)量。

(3)

(4)

其中，F(xiàn)為斷裂載荷，N；a為試樣平行段寬度，mm；b為試樣平行段厚度，mm；ΔL為斷裂時試樣的伸長量，mm；L為試樣原長，mm。

1.4細胞實驗

配制DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清+100μg/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素)，將L929細胞在其中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃， 5%CO2培養(yǎng)箱。將滅菌后的材料浸入培養(yǎng)， 24h后以其浸提液作為細胞的生長介質(zhì)，將L929細胞密度調(diào)整為3×103cells/well接種到96孔板中，吹打均勻后每孔加10mL細胞懸浮液，同樣的條件下培養(yǎng)，每隔2d換液一次。分別在1，3，5和7d的時候，加入一定量的MTT母液，孵化4h后加200μL鹽酸化異丙醇溶液，用酶標(biāo)儀測定570nm處溶液的吸光度值，對照組為空白細胞。

另取一部分上述經(jīng)過滅菌后的材料轉(zhuǎn)移到24孔板加入培養(yǎng)基在37 ℃， 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，更換培養(yǎng)基，將細胞密度調(diào)整為3×103cells/well接種，繼續(xù)培養(yǎng)。一段時間后，洗去培養(yǎng)液，用PBS洗去膜上未貼附的細胞，隨后用2.5%的戊二醛固定1h，梯度乙醇脫水后，濺射鍍膜法表面鍍金，SEM觀察拍照。

1.5抗菌實驗

采用原位復(fù)合法將Ag載入BC/N中。根據(jù)浸泡AgNO3時濃度不同將材料記為BC/N、BC/N-1Ag、BC/N-5Ag、BC/N-9Ag。

1.5.1定性法

取適量的大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)至液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后稀釋至108cfu/mL。取20μL菌液至瓊脂板中央，涂布均勻后將滅菌的BC/N和BC/N-Ag平鋪在上面，置于37 ℃培養(yǎng)箱中。待菌落長滿瓊脂板時，測量計算抑菌圈寬度H

D為抑菌帶的外徑，mm；d為試樣的直徑，mm，平行測3次取其平均值。

1.5.2定量法

將菌液稀釋至107cfu/mL后取300 μL至含BC/N和BC/N-Ag的48孔板中，37 ℃、150 r/min的環(huán)境中培養(yǎng)0.5，1，3，6，12，24，48，72 h后取菌液10 μL進行梯度稀釋(100，1 000倍)。將稀釋的菌液取10 μL至瓊脂板上，涂布均勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中，待其長成獨立菌落時，選取菌落合適的瓊脂板進行計數(shù)來計算抑菌率

C0為空白組的平均菌落數(shù)，Ct為實驗組的平均菌落數(shù)。其中，BC/N為對照組。

2結(jié)果與討論

2.1紅外光譜分析

圖1　Non和BC/N的紅外光譜圖

2.2表面形態(tài)特征

利用SEM對BC/N的表面和截面形貌進行觀察，結(jié)果如圖2所示。BC具有納米級的纖維網(wǎng)絡(luò)[14]，而Non的纖維直徑則大得多。從圖2(a)可以看到表面是1層膜，下面有一些粗纖維，即在Non粗纖維的上面覆蓋有1層BC膜，表明BC能較好地粘附在Non的纖維表面。從截面形貌(圖2(b))可以看出，BC除分布在Non的表面外，其微纖維已穿透到Non的纖維網(wǎng)絡(luò)中間，纖維密度相對較低，呈絮狀，所以說BC不僅覆蓋在Non的表面，而且穿透至Non的纖維中間。從SEM照片中看到，BC與Non結(jié)合較好，沒有明顯的間隙，不會輕易脫落。

2.3含水率分析

圖3為Non以及不同BC含量的BC/N材料的含水率，可以看出Non的含水率較低，僅為400%，但與BC復(fù)合之后所得BC/N的含水率有了明顯的提升，并且隨BC含量的升高，材料的含水率逐漸升高。而且BN10的含水率最高可達到Non的3倍。原因在于BC分子中含有很多羥基，對水分子有很強的親和力，本身具有極高的含水率[15]。因而Non與BC復(fù)合后使Non含水率提高，而且隨BC含量的升高而增加。因此，Non與BC復(fù)合后可明顯改善其含水率。

圖2　BC/N的SEM圖

圖3　Non和不同BC含量的BC/N的含水率

Fig 3 Moisture content of Non and BC/N with different BC content

2.4失水率分析

圖4為Non以及不同BC含量的BC/N材料在不同時間的失水率。

圖4　Non和不同BC含量的BC/N的失水率

Fig 4 Moisture loss rate of Non and BC/N with different BC content

從圖4可以看出Non的失水速率很快，在溫度為24 ℃、濕度為72%的環(huán)境中放置15 min后失水率即達7%，且隨時間的延長，失水速率更快，在放置480 min后失水率已達82%。而當(dāng)Non與BC復(fù)合之后，其失水速率顯著降低，尤其隨著BC含量的升高，其失水速率更低?？梢钥吹?80 min時，BN10的失水率為50%，而此時Non的失水率為82%，同比減少32%。結(jié)果顯示隨BC含量的升高，BC/N的失水率有了明顯的降低，且放置時間越長，這種作用越顯著。這是因為BC中含有的羥基與水分子相互作用形成氫鍵，而氫鍵鍵能相對較高，使水分不易流失。因此，Non與BC復(fù)合后可明顯降低其失水速率，提高其保濕性能。

2.5力學(xué)性能分析

圖5為Non、BC以及不同BC含量的BC/N材料的拉伸強度。

圖5　Non、BC和不同BC含量的BC/N的拉伸強度

Fig 5 Tensile strength of Non，BC and BC/N composites with different BC content

由圖5可知，BC拉伸強度較低，約為2.5 MPa，Non拉伸強度則較BC高，約為10 MPa，而二者復(fù)合后的BN2-BN10的拉伸強度較二者復(fù)合之前均有顯著提升，特別是比BC提高了10 MPa以上。而BN2-BN10的拉伸強度隨BC含量的升高而降低，其原因在于含BC多的樣品在拉伸過程中與Non發(fā)生一定的脫離，出現(xiàn)首先斷裂的情況，從而導(dǎo)致樣品的拉伸強度略有降低。而BN2中BC均分布在Non中，拉伸過程不會發(fā)生BC脫離Non的情況，因此拉伸強度較高。

圖6所示為Non、BC以及不同BC含量的BC/N材料的斷裂伸長率，從圖6看到BC與Non的斷裂伸長率相近，約為23%，但二者復(fù)合后所得材料的斷裂伸長率則有了進一步的提高，且最大可提高10%?？傊?，從拉伸強度和斷裂伸長率來看，Non與BC復(fù)合后所得復(fù)合材料的綜合力學(xué)性能較Non、BC均有了明顯的提升。

圖6　Non、BC和不同BC含量的BC/N的斷裂伸長率

Fig 6 Elongation at break of Non,BC and BC/N with different BC content

2.6生物相容性分析

圖7為Non以及不同BC含量的BC/N材料的體外細胞毒性情況。MTT結(jié)果顯示隨著天數(shù)的增加，細胞含量正常遞增，各組分細胞生長情況與空白對照組沒有明顯差別，表明Non、BC以及各復(fù)合材料(BN2-BN10)沒有明顯的細胞毒性。通過L929細胞在BC/N復(fù)合材料上的生長情況(圖8)可以看出， 細胞可以在材料表面實現(xiàn)很好的粘附并能實現(xiàn)相應(yīng)的增殖，因此Non與BC復(fù)合后使Non的生物相容性有所提高，并能有效改善其粘附效果。

圖7　Non、BC和不同BC含量的BC/N的MTT值

Fig 7 The MTT absorbance of Non，BC and BC/N composites with different BC content

圖8L929細胞在BC/N表面培養(yǎng)3 d粘附情況的SEM圖

Fig 8 SEM images of the L929 cell cultivated on BC/N for 3 d

2.7抗菌性能分析

圖9為BC/N與BC/N-Ag對E.coli和S.aureus的抑菌圈照片。從圖9看到，BC/N(B0)沒有抑菌效果，而BC/N-Ag則有明顯的抗菌效果，且隨著浸泡AgNO3時濃度的增大而變得更加顯著，具體表現(xiàn)在表1中。

圖9BC/N與BC/N-Ag對E.coli和S.aureus的抑菌圈照片

Fig 9 Inhibition zone photo of BC/N and BC/N-Ag composite against E.coli and S.aureus

表1為BC/N與BC/N-Ag對E.coli和S.aureus的抑菌帶寬度?？梢钥吹紹C/N(B0)抑菌圈寬度為0。而BC/N-9Ag對E.coli的抑菌圈寬度可達2.30 mm，對S.aureus的最大抑菌圈寬度可達1.79 mm。BC/N-Ag有顯著的抗菌效果是因為BC/N中具備的納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為Ag的載入提供了充分的空間，而Ag對E.coli和S.aureus具有極佳的抗菌效果。目前對Ag的抗菌機理還沒有統(tǒng)一的定論。但有研究者認為，細菌與Ag接觸后，Ag會快速吸附在細菌細胞膜的表面，致使其外部形成很多凹陷，改變細菌細胞膜的通透性，從而影響細菌正常的呼吸以及滲透性等生理功能，從而導(dǎo)致細菌死亡[16]。因此， BC/N-Ag具有良好的抗菌性。且隨Ag含量的升高，BC/N-Ag的抗菌效果更加顯著(見表1)。

采用定量分析法計算出 BC/N-Ag對E.coli和S.aureus 0.5，1，3 h的抑菌率(表2)，可以看到0.5 h時BC/N-Ag的抑菌率區(qū)別不大，均在70%～80%之間。3 h時BC/N-Ag的抑菌率均在99%以上，其中BC/N-9Ag的抑菌率最高，對E.coli的抑菌率已達到99.96%，對S.aureus的抑菌率達到99.93%。這些結(jié)果均說明，BC/N-Ag與E.coli和S.aureus接觸3 h后，抗菌效果已達99%以上，而且其抗菌效果可持續(xù)72 h以上。這是因為BC/N-Ag與細菌接觸3 h后已經(jīng)基本使其失活，從而使該材料表現(xiàn)出極佳的抗菌性能。

表1　BC/N與BC/N-Ag對E.coli和S.aureus的抑菌帶寬度

表2　BC/N-Ag對E.coli和S.aureus 0.5，1，3 h的抑菌率

3結(jié)論

采用生物復(fù)合法制備出不同BC含量的BC/N復(fù)合材料。結(jié)果表明，BC和Non實現(xiàn)了良好的復(fù)合，而且復(fù)合后可明顯改善Non的含水率和保濕性能，提高拉伸強度及生物相容性；通過NaBH4在材料上還原AgNO3原位復(fù)合所得的材料具有極佳的抗菌效果，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率最大分別可達99.96%，99.93%。通過BC與Non的復(fù)合還改善了BC的貼合問題，從而進一步擴大了二者作為敷料使用的范圍，特別是在生物醫(yī)學(xué)敷料領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

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Preparation and properties of nonwoven composite modified by bacterial cellulose

ZHANG Xueting1,2，CHU Minglei1,2，LIU Sa1,2，LI Lifeng1,2，LI Weichang1,2，WANG Lin1,2， REN Li1,2

(1.College of Materials Science and Engineering, South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.National Engineering Research Center for Human Tissue Restoration and Reconstruction,South China University of Technology, Guangzhou 510006,China)

Abstract:Bacterial cellulose/nonwoven composite was prepared by biological composition method. The structure, moisture content, moisture loss rate and mechanical properties were studied. Besides, biological safety was also studied by L929 cell culture in vitro. And the antibacterial BC/N-Ag composites were prepared by in situ composite. The results showed that bacterial cellulose (BC) and nonwoven (Non) achieved good composite. And the moisture content of bacterial cellulose/nonwoven composite increased from 410% to 1 018%, the water loss rate decreased from 82.39% to 48.07%. The composite enhanced the moisture content and water holding capacity of bacterial cellulose/nonwoven composite. And both tensile strength and elongation at break were higher than BC and Non. MTT showed that BC/N had good biocompatibility. Antibacterial results showed that BC/N-Ag had excellent antibacterial properties, and the highest antibacterial rate against escherichia coli staphylococcus aureus reached 99.96% and 99.93% respectively. Therefore, this material was expected to be widely used in the field of medical dressing.

Key words:nonwoven; bacterial cellulose; moisture holding capacity; biocompatibility

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.03.047

文獻標(biāo)識碼：A

中圖分類號：O636.1

作者簡介：張雪婷 (1990-)，女，山東高密人，在讀碩士，師承任力教授，從事細菌纖維素研究。

基金項目：廣東省科技計劃資助項目(2012A080203010,2012A080800015)

文章編號：1001-9731(2016)03-03253-05

收到初稿日期：2015-04-10 收到修改稿日期：2015-09-12 通訊作者：任力，E-mail: psliren@scut.edu.cn