康雪芳　李紅麗　王文全　侯俊玲

100102　北京中醫(yī)藥大學 中藥學院[康雪芳(碩士研究生)、李紅麗、王文全、侯俊玲]；中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所(王文全)；中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心(王文全、侯俊玲)

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甘草地上部分脂溶性總黃酮抗氧化活性研究

康雪芳李紅麗王文全侯俊玲

100102北京中醫(yī)藥大學 中藥學院[康雪芳(碩士研究生)、李紅麗、王文全、侯俊玲]；中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所(王文全)；中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心(王文全、侯俊玲)

【摘要】目的建立甘草地上部分脂溶性成分高效液相指紋圖譜，采用DPPH自由基清除能力、還原力、羥基自由基清除能力評價甘草地上部分脂溶性總黃酮抗氧化活性。方法建立甘草地上部分脂溶性黃酮類成分高效液相指紋圖譜，色譜條件：島津WondaSil?-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸-水溶液梯度洗脫，體積流量1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長190～400 nm。通過體外抗氧化活性法測定甘草地上部分脂溶性總黃酮的清除DPPH自由基能力、還原能力及清除羥基自由基能力。結果甘草地上部分脂溶性黃酮類成分有良好的清除DPPH自由基活性、清除羥基自由基能力及還原能力。結論建立的HPLC-DAD指紋圖譜方法能較好的反應甘草地上部分脂溶性黃酮類成分，甘草地上部分脂溶性總黃酮有較強的抗氧化能力。

【關鍵詞】甘草地上部分；脂溶性總黃酮；HPLC-DAD

甘草是豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖，具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥的功效，在中國有悠久的用藥歷史。其地上莖葉部分資源豐富，黃酮類成分含量較高，研究發(fā)現(xiàn)，盛花期的甘草葉總黃酮含量約為5.64%[1]。國外研究者發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、抗氧化等藥理作用[2-3]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，甘草葉醇提物上清液對大鼠慢性非細菌性前列腺炎有良好的預防和治療作用，但提取物的沉淀部分未得到利用[4]。而甘草地上部分提取物沉淀中含有較多脂溶性黃酮類成分，主要為異黃酮、二氫黃酮、黃酮醇類黃酮苷元物質(zhì)[5]。黃酮苷元類成分具有抗氧化、抗炎、抗菌等多種藥理活性，并且苷元類物質(zhì)在動物血液內(nèi)可直接被吸收，其效價是苷類物質(zhì)的7倍[6]。

為使甘草地上部分資源得到充分利用，本實驗對甘草地上部分提取物沉淀中的脂溶性黃酮類成分進行研究，通過HPLC-DAD建立甘草地上部分脂溶性黃酮類成分高效液相色譜方法，并對總黃酮進行體外抗氧化活性的測定，為甘草地上部分的進一步開發(fā)提供依據(jù)。

1儀器與材料

島津高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器，SP-752型紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，CP224電子天平(奧豪斯儀器有限公司)，旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科貿(mào)有限公司)，GKC21CR4可控硅恒溫水浴鍋(上海錦屏儀器儀表有限公司)，槲皮素(批號：YA0806YB13，純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)，蘆丁(純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)，DPPH(1,1-二苯基苦基苯肼，東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn))。

甘草地上部分于2014年采于寧夏銀川，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學王文全教授鑒定為甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的地上部分。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2方法與結果

2.1樣品的制備及含量測定

取甘草地上部分莖葉粗粉10 kg，70%乙醇回流提取3次，每次2小時。提取液回收乙醇至無醇味，靜置過夜，離心取沉淀部分，石油醚脫脂，真空干燥得沉淀部分樣品。

甘草地上部分總黃酮含量采用紫外分光光度法[7]測定，用槲皮素為對照品，以10%KOH為顯色劑顯色，測得甘草地上部分脂溶性總黃酮含量為43.39%。2.2甘草地上部分脂溶性總黃酮HPLC-DAD指紋圖譜的建立

2.2.1色譜條件高效液相色譜對各類黃酮化合物均可獲得良好的分離效果。由于黃酮類化合物大多具有多個羥基，故用高效液相色譜分離時，往往采用反相柱色譜，根據(jù)文獻發(fā)現(xiàn)，乙腈-磷酸-水溶劑系統(tǒng)可較好地分離甘草地上部分黃酮類成分，故選用此溶劑系統(tǒng)。經(jīng)二極管陣列檢測器檢測波長190 ～400 nm范圍紫外吸收，比較紫外吸收強度，在280 nm和350 nm波長下有很好的吸收。經(jīng)考察不同洗脫流速、柱溫及進樣量、檢測波長，確定HPLC最佳色譜條件如下：島津WondaSil-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈(A)-0.1%磷酸-水溶液(B)梯度洗脫，體積流量1 mL/min，柱溫35℃，檢測波長280 nm、350 nm。洗脫梯度：0～25分鐘(A-B，20∶80)，25～40分鐘(A-B，42∶58),40～60分鐘(A-B，45∶55)，60～75分鐘(A-B，70∶30)，75～80分鐘(A-B，80∶20)，80分鐘(A-B，95∶5)，進樣量為10 μL。色譜圖見圖1。

2.2.2方法學考察通過分析上述樣品色譜峰保留時間和峰面積值計算RSD評價進樣和儀器的精密度、方法重復性及樣品穩(wěn)定性。

(1)精密度試驗：沉淀部分樣品以甲醇配制供試品溶液，按2.2.1項色譜條件連續(xù)進樣5次檢測指紋圖譜，計算得色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于3%，表明該儀器精密度良好。

(2)重復性試驗：精密稱取相同濃度樣品溶液5份，按2.2.1項色譜條件進樣，檢測指紋圖譜，計算

圖1　甘草地上部分脂溶性成分高效液相指紋圖譜

得色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于3%，表明方法重現(xiàn)性良好。

(3)穩(wěn)定性試驗：以沉淀部分樣品配制供試品溶液，室溫存放，按2.2.1項色譜條件進樣，分別在0小時、2小時、8小時、12小時、24小時檢測指紋圖譜，經(jīng)計算得色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明穩(wěn)定性良好。

2.3抗氧化活性的測定

2.3.1清除DPPH自由基活性測定準確稱取一定量甘草地上部分沉淀部分粉末，分別加入甲醇配制成0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL、1.8 mg/mL、2.0mg/mL的樣品溶液。準確稱取DPPH試劑0.045 g，以無水乙醇溶解至1000 mL容量瓶，搖勻即得0.045 mg/mL DPPH溶液。分別取1 mL待測樣液和3 mL DPPH溶液混合搖勻，室溫且避光反應30分鐘，517 nm波長下測定吸光度值。以待測液溶劑為空白對照，計算樣品自由基清除率。每批樣品重復試驗3次[8]。結果見圖2。

圖2　不同濃度甘草地上部分脂溶性總黃酮對

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(AS-AC)]/A0×100%，式中A0為空白組吸光度值，AS為樣品溶液與DPPH反應吸光度值，AC為對照組吸光度值。

2.3.2還原力的測定取甘草地上部分脂溶性總黃酮樣品，配制成不同濃度的樣品溶液(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL、1.8 mg/mL、2.0 mg/mL)，各取1 mL，加入0.2 moL/L的磷酸緩沖溶液(pH=6.6)2 mL和1%鐵氰化鉀溶液2 mL，混合物于50℃水浴保溫20分鐘，然后加入10%三氯乙酸溶液，3000 rpm離心。取上清液2 mL，加入蒸餾水2 mL及0.5 mL的0.1%三氯化鐵溶液，混合溶液于700 nm波長下測吸光度，重復實驗3次，結果如圖3。吸光度值越大，還原能力越強，物質(zhì)的還原能力與其抗氧化活性有明顯的相關性。由圖3可知，甘草地上部分脂溶性總黃酮有較強的還原能力，且與濃度有一定相關性，隨著濃度的增加，還原能力增強。

圖3　不同濃度甘草地上部分脂溶性總黃酮還原力曲線

2.3.3清除羥基自由基活性測定在10 mL試管中分別加入9 mmol/L Fe2SO4溶液及10.0 mmol/L水楊酸乙醇溶液，分別加入1.0 mL不同濃度樣品溶液(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL、1.8 mg/mL、2.0mg/mL)，加蒸餾水至5 mL，然后加入6.0 mmol/L H2O2溶液1 mL，37℃水浴加熱10分鐘，510 nm處測定吸光度?？瞻讓φ找韵嗤w積蒸餾水代替樣品；按照下列公式計算羥自由基清除率，實驗重復3次。羥自由基清除率(%)=[A0-(As-Ac)]/A0×100%，式中A0為空白對照液吸光度值，只加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過氧化氫，不加入樣品溶液的吸光度值；As為加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過氧化氫、樣品溶液的吸光度值；Ac為加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、樣品溶液，不加過氧化氫引發(fā)反應的吸光度值。羥基自由基化學性質(zhì)活潑，可損傷蛋白質(zhì)核酸和脂類等多種生物大分子，尤其對脂質(zhì)過氧化作用最強[8]。由圖4可知，甘草地上部分脂溶性總黃酮對羥基自由基有一定清除能力，隨著總黃酮濃度增加，對羥基自由基的清除率也增加。當濃度增加到2 mg/mL時，甘草地上部分總黃酮對羥基自由基的清除率達到36.93%。

圖4　不同濃度甘草地上部分脂溶性

3討論

體外抗氧化測定實驗具有快速、簡便、靈敏的優(yōu)點[9]。現(xiàn)代研究表明，自由基是引起多種疾病和老化的重要因素，自由基引起的連鎖反應經(jīng)體內(nèi)代謝后會引起脂質(zhì)、DNA、細胞膜等體內(nèi)大分子損傷，是多種疾病如癌癥、心血管疾病、腎炎等的誘因[10]。

DPPH·是一種化學性質(zhì)較為穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若被測物能清除它，則提示被測物有降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基等自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應的作用[11]。國內(nèi)外廣泛采用DPPH分光光度法篩選天然抗氧化劑[12]。羥基自由基是活性氧中最活潑的自由基之一，也是毒性最大的自由基，可直接損傷各種生物膜，導致多種疾病的發(fā)生，從而危及生物體[13]。因此，良好的羥基自由基清除能力表明甘草地上部分資源具有天然抗氧化劑的潛在開發(fā)價值。

本研究建立的HPLC-DAD高效液相指紋圖譜能很好地反映甘草地上部分脂溶性黃酮類成分。體外抗氧化能力的測定表明甘草地上部分脂溶性黃酮類具有良好的抗氧化能力，其抗氧化活性有效成分有待進一步明確。指紋圖譜的建立及抗氧化活性的研究為豐富甘草地上部分主要黃酮類成分種類、篩選活性指標成分及建立全面譜-效關系奠定基礎。

參考文獻

[1]張學靜.甘草莖葉及根中黃酮和多糖類成分積累動態(tài)研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2009.

[2]敖明章，李唯，崔永明，等.脹果甘草葉成分分析及抗炎作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，(20)：35-38.

[3]Toshio FA，Ai Marumo，Kiyoshi Kaitou，et al. Anti-heli，cobacter pylori flavonoids from licorice extract[J]. Life Sciences，2002，71：1449-1463.

[4]鄭巧云.甘草葉抗慢性非細菌性前列腺炎活性研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2011.

[5]韓亞男.甘草地上部分提取物化學成分的分段研究及其抗氧化活性分析[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2013.

[6]張金亮，趙璐璐，王蒙，等. 天然黃酮的分離及高活性苷元制備方法的研究進展[C]//中國蠶學會桑樹病蟲害防治學術研討會論文集，2008，171-178.

[7]程新宇，韓亞男，康雪芳，等.甘草地上部分總黃酮含量測定方法的篩選[J].中醫(yī)藥信息，2015，32(2)：1-5.

[8]許海順，蔣劍平，徐攀，等.紅參多糖抗氧化活性的研究[J].浙江中醫(yī)藥大學學報，2011，35(6)：909-912.

[9]王曉宇，杜國榮，李華.抗氧化能力的體外測定方法研究進展[J].食品與生物技術學報，2012，31(3)：247-249.

[10]孫存普.自由基生物學導論[M].合肥：中國科技大學出版社，1999.

[11]Zheng JQ. Advance of empirical study on antioxidant[J]. Foreign Med Sci ( Hyg )(國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊) ，2000，27：37-40.

[12]谷麗華，吳弢，張紫佳，等.應用薄層色譜-生物自顯影技術評價烏藥等三種中藥的抗氧化活性[J].藥學學報，2006，41(10)：956-962.

[13]柳紅，張靜.不同南瓜多糖體外清除羥基自由基作用的研究[J].武漢植物學研究，2007，25(4)：356-359.

(本文編輯： 董歷華)

Evaluation of the antioxidant activity of fat-soluble flavonoids in aerial parts ofGlycyrrhizauralensisFisch.

KANGXue-fang，LIHong-li，WANGWen-quan，etal.

SchoolofChinesePharmacy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China

【Abstract】ObjectiveTo establish the HPLC fingerprint of fat-soluble flavonoids in aerial parts of Glycyrrhiza uralensis Fisch., the DPPH radical scavenging, reducing antioxidant power assay, hydroxyl free radical scavenging capacity was used to evaluate antioxidant activity of fat-soluble flavonoids in aerial parts of Glycyrrhiza uralensis Fisch.. MethodHPLC fingerprint of the aerial parts of the fat-soluble flavonoids of Glycyrrhiza uralensis Fisch. was established, HPLC fingerprint chromatographic conditions: DIKMA Wonda Sil?-C18 analytical column (4.6×250mm,5μm), acetonitrile-0.1%phosphoric acid - water gradient, the volumetric flow rate was 1mL/min, column temperature was 35℃, detection wavelength was 190～400 nm. In vitro antioxidant activity was measured by DPPH radical scavenging method, reducing power and scavenging hydroxyl radical assay. ResultsFat-soluble flavonoids in aerial parts of Glycyrrhiza uralensis Fisch. had a strong antioxidant capacity. ConclusionHPLC-DAD fingerprint method can show fat-soluble flavonoids in aerial parts of Glycyrrhiza uralensis Fisch.. It has good DPPH radical scavenging activity, scavenging hydroxyl free radical activity and reducing power.

【Key words】Aerial parts of Glycyrrhiza uralensis Fisch.；Total fat-soluble flavonoids；HPLC-DAD

(收稿日期：2016-02-03)

Corresponding author：WANG Wen-quan， E-mail：wwq57@126.com

【中圖分類號】R284

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.05.011

作者簡介：康雪芳(1990- )，女，2013級在讀碩士研究生。研究方向：中藥資源開發(fā)與利用。E-mail：gerile2920@sina.com通訊作者： 王文全(1957- )，博士，教授。研究方向：中藥材規(guī)范化生產(chǎn)及其調(diào)控機制研究。E-mail：wwq57@126.com

基金項目：國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2009ZX09308-002) ; 國家中醫(yī)藥管理局行業(yè)專項( 201107009-03)