李 玥，鄒愛英

(1.天津市濱海新區(qū)大港中醫(yī)醫(yī)院，天津 300193； 2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300151)

李 玥1，鄒愛英2

(1.天津市濱海新區(qū)大港中醫(yī)醫(yī)院，天津 300193； 2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300151)

目的：分析藏茵陳甲醇提取物中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸6種有效成分。方法：高效液相色譜-電噴霧/離子阱質(zhì)譜法(HPLC-ESI/MS)對藏茵陳甲醇提取物中6種有效成分進行測定和色譜峰的歸屬。采用ACCHROM Unitary-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以水(4 mmol/L 甲酸銨-0.2%的甲酸)-甲醇溶液為流動相進行梯度洗脫，體積流量 0.8 ml/min，進樣量 20 μl，柱溫40 ℃；采用電噴霧離子源進行正離子模式監(jiān)測。結果：藏茵陳甲醇提取物中6種有效成分獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸分別在1.452～29.04、0.808～16.16、1.036～20.72、0.864～17.28、0.828～16.56和5.812～116.24 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關系，平均回收率分別為100.1%(RSD為1.41%)、99.7%(RSD為1.49%)、98.1%(RSD為1.69%)、101.7%(RSD為1.69%)、100.1%(RSD 1.62%)、100.3%(RSD 1.64%)。結論：本法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好，可用于藏茵陳甲醇提取物中6種有效成分的測定。

藏茵陳，HPLC-MS，獐牙菜苦苷，龍膽苦苷，芒果苷，swertia，svinertia，齊墩果酸

藏茵陳是傳統(tǒng)藏藥，藏藥名“蒂達”，具有清熱解毒，清肝利膽的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，藏茵陳具有保肝、抗病毒、抗菌、消炎等多種作用，臨床上廣泛用于治療乙肝、急性黃疸型肝炎等疾病。藏茵陳中含有環(huán)烯醚萜、呫噸酮、三萜等多種類別的化學成分[1]。藏茵陳來源廣泛，《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·藏藥》(第一冊)收載其原植物有川西獐牙菜SwertiamussotiiFranch和印度獐牙菜S.chirayitaKarsten。其中，藏茵陳為龍膽科獐牙菜屬植物印度獐牙菜Swertiachirayita(Roxb ex Flemi) Karsten 的干燥全草；主產(chǎn)于尼泊爾、印度、不丹，多從尼泊爾由民間進入我國。藏茵陳中的齊墩果酸對四氯化碳引起的大鼠急慢性肝損傷有明顯保護作用；環(huán)烯醚萜類成分具有抗炎、促進肝損傷細胞修復等藥理活性。而黃酮類化合物具有抑制單胺氧化酶、抑制體外腫瘤細胞生長、抗氧化、保肝等多重活性[2-10]。

本實驗采用高效液相色譜-電噴霧/離子阱質(zhì)譜法(HPLC-ESI/MS)，對藏茵陳甲醇提取物中齊墩果酸、svinertia、swertia、芒果苷、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷6種有效成分首次進行同時測定，可為藏茵陳的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

美國Finnigan 公司 LCQ 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，ACCHROM Unitary-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，DL-360D 智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；BP211D型十萬分之一天平(德國 Sartorius 公司)；甲醇為色譜純(天津康科德科技發(fā)展有限公司)。獐牙菜苦苷對照品(批號110785-201404，質(zhì)量分數(shù)98.3%，中國食品藥品檢定研究院)；龍膽苦苷對照品(批號110770-201515，質(zhì)量分數(shù)99.1%，中國食品藥品檢定研究院)；芒果苷對照品(批號111607-200402，質(zhì)量分數(shù)100%，中國食品藥品檢定研究院)；swertia對照品(質(zhì)量分數(shù)為99.3%，自制)；svinertia對照品(質(zhì)量分數(shù)為99.1%，自制)；齊墩果酸對照品(批號110709-201206，質(zhì)量分數(shù)94.9%，中國食品藥品檢定研究院)； 5批藥材均購于青海地區(qū)，經(jīng)張鐵軍研究員鑒定為印度獐牙菜Swertiachirayita(Roxb ex Flemi) Karsten。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為ACCHROM Unitary-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相為水(4 mmol/L甲酸銨-0.2%的甲酸，A)-甲醇溶液(B)，梯度洗脫：0～7.0 min，95% A；7.1～21.0 min，95%～5% A；21.1～25.0 min，95% A；檢測波長：分段變波長測定，0～21.0 min為254 nm，21.1～25.0 min為210 nm；體積流量 0.8 ml/min；柱溫40 ℃；進樣量20 μl。

2.2 質(zhì)譜條件 正離子檢測；離子源噴射電壓：4.5 kV；毛細管溫度：250 ℃；毛細管電壓：25 V；鞘氣流速：50 arb；輔助氣流速：20 arb；碰撞氣：氦氣；檢測方式：多級全掃描質(zhì)譜。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 分別稱取對照品獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸適量，精密稱定，加甲醇制成對照品溶液。分別取各對照品溶液適量，制成獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸的混合對照品溶液，質(zhì)量濃度分別為 36.3、20.2、25.9、21.6、20.7和145.3 μg/ml。

2.3.2 供試品溶液的制備 取藏茵陳粗粉1.0 g，精密稱定，置25 ml 具塞三角瓶中，精密加入80%甲醇20 ml，稱定重量，超聲1.0 h，放冷，用 80%甲醇補足減失的重量，取上清液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關系考查 精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和20.0 ml，分別置25 ml量瓶中，以甲醇定容，搖勻，即得系列質(zhì)量濃度的混合溶液，分別吸取上述溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，并進行線性回歸，得標準曲線方程，見表1。

2.5 LC-UV分析 在上述色譜條件下，采用UV檢測方法獲得混合對照品，印度獐牙菜提取物的HPLC色譜圖見圖1。對照品的色譜結果顯示獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸的保留時間；根據(jù)保留時間，樣品的色譜圖中1、2、3、4、5和6色譜峰初步鑒別為獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸。

2.6 HPLC-ESI-MS/MS分析 在設定的HPLC-ESI(+)-MS/MS條件下，經(jīng)色譜分離后，得到各離子峰的精確分子質(zhì)量數(shù)，質(zhì)譜歸屬結果見表2。基于m/z值，保留時間，進一步鑒定樣品的色譜圖中1、2、3、4、5和6色譜峰為獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸。

2.7 精密度試驗 取藏茵陳粗粉，取約1.0 g，精密稱取 6 份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下記錄 6 種化合物的峰面積，計算 RSD 值，考查日內(nèi)精密度。取上述供試品溶液連續(xù) 3 d 測定計算 RSD 值，考查日間精密度。結果顯示6種成分日內(nèi)精密度的 RSD 值分別為0.88%、0.97%、0.65%、1.34%、1.12%和1.32%；日間精密度的RSD值分別為 1.37%、1.61%、0.99%、1.51%、1.28%和0.85%，表明該方法精密度良好。

表2 6種成分質(zhì)譜歸屬

化合物MS1m/z歸屬MS2m/z歸屬獐牙菜苦苷375[M+H]+212[M+H-C6H11O5]+龍膽苦苷357[M+H]+194[M+H-C6H11O5]+芒果苷423[M+H]+260[M+H-C6H10O5]+swertia275[M+H]+260[M+H-CH3]+svinertia289[M+H]+274[M+H-CH3]+齊墩果酸457[M+H]+412[M+H-COOH]+

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的藏茵陳粗粉0.5 g，分別精密加入高、中、低 3 個水平的對照品溶液，每個水平 3 份，共 9 份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液。按上述的色譜條件測定 6 個化合物的峰面積，計算回收率及 RSD 值。結果 6 種被測成分獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸的平均回收率分別為100.1%、99.7%、98.1%、101.7%、100.1%和100.3%，RSD 值分別為1.41%、1.49%、1.69%、1.69%、1.62%和1.64%。測定結果見表 3-8。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12和24 h 進樣分析測定，記錄峰面積，考查供試品溶液的穩(wěn)定性。結果表明所有被測物峰面積的 RSD分別為0.51%、0.55%、0.59%、0.67%、0.70%和0.78%，說明樣品穩(wěn)定性良好。

表4 龍膽苦苷加樣回收率試驗結果 (n=9)

表5 芒果苷加樣回收率試驗結果 (n=9)

表6 swertia加樣回收率試驗結果 (n=9)

表7 svinertia 加樣回收率試驗結果 (n=9)

表8 齊墩果酸加樣回收率試驗結果 (n=9)

2.10 重復性試驗 取藏茵陳粗粉，取約 1.0 g，精密稱取 6 份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄6 種化合物的峰面積，計算 RSD 值，考查重復性。6 種化合物的 RSD 值分別為0.79%、0.88%、1.74%、1.22%、1.38%和1.66%， 符合規(guī)定， 表明本方法重復性良好。

2.11 樣品測定 按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰面積，將 6 個待測成分的峰面積代入相應的標準曲線方程中，并計算其質(zhì)量分數(shù)。測定結果見表9。

表9 藏茵陳中 6 種成分的測定結果(n=3)

3 討論

本實驗首次建立了一種快速、準確的 HPLC-MS/MS 分析方法，用于同時測定藏茵陳藥材中6種有效成分含量，為藏茵陳藥材的質(zhì)量控制提供了可靠的分析手段。

實驗比較了以甲醇、乙醇為提取媒介，提取供試品，結果表明以甲醇提取效率較高。同時考查了提取時間20 min、30 min、1 h和1.5 h，結果顯示1 h各成分提取較完全，確定提取時間為1 h。流動相的選擇和優(yōu)化是整個色譜條件的關鍵，同時考慮到要用質(zhì)譜進行分析，不揮發(fā)性鹽類不能使用，如磷酸鹽等。為此，我們分別考查了有機相的種類、緩沖鹽的種類、緩沖鹽濃度、流動相比例等。在確定緩沖鹽的種類后，分別考查了2、4和8 mmol/L甲酸銨水溶液為緩沖鹽溶液，隨著緩沖鹽濃度的增加，色譜峰的峰形發(fā)生變化，最終確定4 mmol/L為最佳緩沖鹽溶液濃度。同時進行了色譜柱的篩選，篩選了C18柱、C8柱、氨基柱、苯基柱、氰基柱各種填料的色譜柱，最終確定使用C18柱。

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2015-11-28

R917

A

1006-5687(2016)01-0008-04