張夢迪, 路仲達(dá),何 易,苗 戎, 宋春敬

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

Notch信號通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過程中的作用

張夢迪, 路仲達(dá),何 易,苗 戎, 宋春敬

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有多向分化潛能，可以通過細(xì)胞移植治療多種疾病，并且在一定的條件下可以通過誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞(CMs)，為治療心血管疾病帶來了希望。在細(xì)胞的增殖和分化中，Notch信號通路起到了非常重要的作用，本文對在MSCs分化為CMs過程中Notch信號通路的具體作用做一綜述。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；心肌細(xì)胞；Notch信號通路

心血管疾病危害巨大，病死率居高不下。所有的心臟疾患，特別是心肌梗死，常導(dǎo)致心肌細(xì)胞(CMs)的死亡，進(jìn)而導(dǎo)致心力衰竭[1]。心肌細(xì)胞死亡后不可再生，梗死處有成纖維細(xì)胞增殖形成瘢痕組織，造成功能性心肌細(xì)胞的缺失。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種具有多分化潛能的干細(xì)胞，具有自我更新及增殖能力，并可以多向分化為軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[2-4]，將MSCs誘導(dǎo)成為心肌細(xì)胞，為現(xiàn)代臨床治療心臟疾患提供了新思路。Notch信號通路是一種高度保守的信號傳導(dǎo)，具有精確調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的能力。以下就MSCs分化為CMs過程中Notch信號通路所發(fā)揮的作用做一綜述。

1 Notch信號通路

Notch信號通路是一種廣泛存在于脊椎和無脊椎動物中，為生物進(jìn)化中高度保守的信號通路，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡中起到了重要的作用[5]。Notch基因于1919年首次被發(fā)現(xiàn)，摩爾根及同事們發(fā)現(xiàn)在果蠅的翅膀上出現(xiàn)了一些突變的缺口(Notchs)而將其命名為Notch基因[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)，Notch受體(即Notch蛋白)在不同的物種之間以及同種物種的不同個體中具有高度的結(jié)構(gòu)同源性。在果蠅中，只有一個Notch基因編碼的Notch受體；在人類中，有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4四種Notch受體，其中Notch1受體的表達(dá)更為廣泛[7-11]。Notch受體是一種膜蛋白受體，由胞外區(qū)(NFC)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)(NCID)構(gòu)成。Notch信號通路的配體亦為一種膜蛋白，表達(dá)在臨近細(xì)胞的細(xì)胞膜上。Notch配體分為Delta和Serrate (哺乳動物為Jagged)[12]，與其同源的分別為delta-like1、delta-like3、delta-like4(亦稱Delta1、Delta3、Delta4 或Dll1、Dll3、Dll4)及Jagged1，故Notch配體統(tǒng)稱為DSL蛋白。Notch通路就是鄰近細(xì)胞間傳遞通訊的重要信號分子。Notch信號通路的活化有兩條路徑，分別是經(jīng)典信號通路和CSL非依賴信號通路。

1.1 Notch經(jīng)典信號通路 經(jīng)典Notch信號通路又稱為CBF-1/RBP-JK依賴途徑。Notch信號傳導(dǎo)在活化的過程中需要進(jìn)行三次裂解。第一次裂解發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)合成的Notch在成熟過程中，于高爾基體內(nèi)在furin樣轉(zhuǎn)化酶(furin-like covertase)的作用下發(fā)生裂解，裂解后的兩部分亞基由二硫鍵相連接，分別為胞外區(qū)和跨膜片段(NTM)。后兩次裂解均發(fā)生Notch蛋白與配體的結(jié)合過程中，配體和受體的結(jié)合促進(jìn)了溶蛋白酶性裂解。第二次裂解在ADAM家族金屬蛋白酶(ADAM-family metalloproteases)的作用下發(fā)生，ADAM10/腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)換酶TACE(TNF-α-converting enzyme，亦稱ADAM17)將NTM裂解為兩個片段，胞外區(qū)被配體表達(dá)細(xì)胞所吞噬，胞內(nèi)區(qū)完成第三次裂解。第三次裂解在由早老素(presenilin)、nicastrin、PEN2 和 APH1組成的γ-分泌酶(γ-secretase)的介導(dǎo)下發(fā)生，此次裂解產(chǎn)生Notch蛋白的胞內(nèi)區(qū)及活化形式NICD。NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。細(xì)胞核內(nèi)存在DNA結(jié)合蛋白CSL[CBF-1、Su(H)、LAG-1]。其中CBF-1(C-promoter binding factor-1)在哺乳動物體內(nèi)被稱為RBP-JK(recombination signal binding protein-JK)，是轉(zhuǎn)錄抑制因子，其自身能募集沉默因子SMRT以及蛋白去乙?；傅冉M成復(fù)合物，抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。NICD的RAM區(qū)與其相結(jié)合，CSL與抑制物解離，并募集輔激活因子Mam，形成三元絡(luò)合轉(zhuǎn)錄激活物(NICD-CSL-Mam)，進(jìn)而啟動下游Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄[12-15]。

圖1 經(jīng)典Notch信號通路核心概略圖

1.2 CSL非依賴信號通路 目前的研究中對于CSL非依賴信號通路的機制還不甚明確，其信號通路也可能不止一條。但目前有明確的研究可以顯示，Deltex 蛋白介導(dǎo)了一部分CSL非依賴的Notch信號[15]。Deltex作為Notch配體的一種，與其同源的稱為Deltex或Deltex-like。在哺乳動物體內(nèi)，Deltex可以分為Deltex-1、Deltex-2、Deltex-3和Deltex-4。Deltex-1是Notch信號通路的一種下游分子，在一定程度上可增強或抑制Notch信號表達(dá)[16]。Deltex-1在蛋白結(jié)構(gòu)上高度保守，含有DomainⅠ、DomainⅡ和DomainⅢ三個結(jié)構(gòu)域。其中DomainⅠ是Deltex蛋白的最必需成分，可在胞內(nèi)與Notch信號的胞內(nèi)區(qū)上的ANK重復(fù)結(jié)構(gòu)相結(jié)合，來調(diào)節(jié)Notch信號的表達(dá)[17]。Arias 等[18]的實驗證明了在基因突變的果蠅中存在CSL非依賴途徑，后又在哺乳動物的體外實驗中進(jìn)行了驗證，證明該通路的存在。但目前CSL非依賴信號通路的具體機制不明，尚待繼續(xù)研究。

2 Notch信號通路對心肌細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)作用

Notch信號通路干預(yù)了心肌細(xì)胞的分化，Wang等[19]的研究顯示 MicroRNA-375(MIR-375)在心肌細(xì)胞的分化中有重要作用，并且是通過破壞Notch信號通路這一途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，激活Notch信號通路可以加快心肌梗死后心功能的恢復(fù)[20]。Zhou等[21]的實驗可以證實激活Notch信號通路在心肌梗死后缺血處恢復(fù)心功能，起到了心肌保護(hù)的作用。有研究表明[22]，Notch1可增強Nkx2.5的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)心臟祖細(xì)胞(cardiac progenitor cells，CSCs)向心肌細(xì)胞的分化。Notchl可刺激CSCs的增殖，且Notch信號通路的激活也促進(jìn)了CSCs向心肌細(xì)胞分化[23，24]。因此，在心肌細(xì)胞分化早期，Notch信號通路促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化。

同時有實驗表明，Notch1在乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)升高，隨著心肌逐漸發(fā)育，Notch1表達(dá)逐漸降低[25]。Rones等[26]采用NICD在爪蟾的stage22、28(爪蟾心臟中胚葉早期分化階段)時期激活內(nèi)源性Notch信號通路可以導(dǎo)致心肌標(biāo)志物 cTnI、MHC 和心肌α-actin 的下調(diào)，而抑制Notch 信號通路則得到的結(jié)論相反。Chau等[27]在雞心臟的心室中轉(zhuǎn)染NICD持續(xù)性活化Notch信號通路會抑制心肌相關(guān)基因MHC、α-actin的蛋白表達(dá)，反之抑制Notch信號通路后也可以得到相反的結(jié)果。所以，Notch信號通路對心肌細(xì)胞起到了雙向調(diào)節(jié)的作用，早期起到了促進(jìn)作用，而中后期發(fā)揮抑制作用。

3 Notch信號通路在MSCs分化為CMs中的作用

3.1 Notch信號通路與MSCs增殖的關(guān)系 牛萍等[28]在體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用Western blot法檢測體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在增殖、分化過程中Notch信號蛋白PS1的表達(dá)。實驗結(jié)果表明，用免疫印跡檢測可以發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中存在著Notch1 -Jagged1通路，說明了Notch信號系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的MSCs有調(diào)控作用。杜紅陽等[29]為明確Notch1在MSCs增殖過程中的作用，構(gòu)建Notch1(NICD)過表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染MSCs。實驗結(jié)果顯示，NICD過表達(dá)后相比對照組，活細(xì)胞比率下降，而早期凋亡率和晚期凋亡率上升。且觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生存期較短，在排除轉(zhuǎn)染試劑的影響下，考慮過表達(dá)Notch1表型激活了Notch信號通路，抑制了MSCs的增殖。Khatib等[30]的實驗表明通過體內(nèi)P53凋亡途徑Notch信號活化可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。然而最新研究則表明，利用DAPT阻斷Notch信號通路，MSCs的增殖較對照組降低，MSCs的增殖也受到了抑制[31]。杜紅陽和鄭介柏的實驗分別激活和阻斷Notch信號通路均會導(dǎo)致MSCs的增殖受到了抑制，但其實驗中與對照組相比整體的生長曲線變化規(guī)律均很相似，這也說明了在MSCs體外增殖的過程中不僅是Notch信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié),而是多條信號通路的相互配合，從而調(diào)控了MSCs的增殖。

3.2 Notch信號通路與MSCs分化為CMs的關(guān)系 鄧海燕等[32]的實驗中，利用慢病毒miR-1轉(zhuǎn)染MSCs向心肌細(xì)胞分化，觀察此過程中Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。在原代MSCs中，Notch信號通路相關(guān)蛋白Notch1、Jagged1、Hey1和Hey2高度表達(dá)，Dll1、Dll3、Dll4、Notch2、Notch3 和Notch4中等表達(dá)。而在誘導(dǎo)后的心肌樣細(xì)胞中的Jagged1、Notch1、Notch3、Hey2(心臟發(fā)育早期在心室表達(dá)，后期表達(dá)逐漸降低[33-34])的mRNA 水平隨著觀察時間的延長而逐漸下調(diào)。配體中Jagged1的含量下調(diào)最為顯著，受體分子中則以Notch1、Notch3 表達(dá)水平變化最為顯著。根據(jù)此實驗結(jié)果可以推測，Notch1 、Notch3 在 MSCsmiR-1向心肌樣細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。這一實驗結(jié)果，也與Nemir等[35]的關(guān)于胚胎干細(xì)胞的實驗一樣，即Notch1信號的下調(diào)可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的結(jié)論大致相似。表明在MSCs向CMs分化的過程中，Notch1、Notch3發(fā)揮重要的作用，通過其表達(dá)下調(diào)進(jìn)而抑制Notch信號通路誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化。劉昕超[36]的實驗中，體外培養(yǎng)的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞P0～P5中，Notch4的含量逐漸下降。相對應(yīng)誘導(dǎo)不同代數(shù)MSCs可發(fā)現(xiàn)，P1分化比例較低，P2～P4分化比例則相對較高。研究結(jié)果表明，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，MSCs向心肌分化的能力越強，而Notch4的含量卻逐漸下降。證明了豬MSCs在向心肌細(xì)胞分化的過程中Notch4下調(diào)。此實驗也從一個側(cè)面印證了Nemir等[35]的實驗。Notch信號通路中Notch1、Notch3及Notch4等信號下調(diào)，抑制了Notch信號通路，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。

然而Shi等[37]的研究中用5-Aza或血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)MSCs心肌樣分化，RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)組比對照組的DLL1、DLL4、Jagged1的和Notch1的基因更高的水平表達(dá)。因此在不同的背景下Notch信號的作用不盡相同。

4 展望

現(xiàn)今社會，心血管疾病的病死率高居不下，給家庭和社會帶來了重大危害。一直以來，科研人員探尋新思路，通過體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化成心肌細(xì)胞，以解決心肌梗死后心肌細(xì)胞不能再生的難題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便，技術(shù)相對成熟，并且具有多向分化潛能，具有很強的可塑性，為心血管疾病的治療帶來了新的曙光。研究MSCs分化過程中Notch信號通路，為MSCs的分化研究打下了基礎(chǔ)，為臨床試驗提供了基礎(chǔ)支持。

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The role of Notch signaling pathway in the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) to Cardiomyocytes

ZHANG Mengdi1, LU Zhongda2, HE Yi1, MIAO Rong3, SONG Chunjing3

(Tianjin University of Traditional Chinese Medicine 1. Institute of Traditional Chinese Medicine；2. College of Chinese Materia Medica; 3. College of Integrated Chinese and Western Medicine, Tianjin 300193, China)

Bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) has the potential of multi-directional differentiation, making curing various diseases through cell transplantation become possible. In addition, MSCs can also be induced and differentiate into cardiomyocytes (CMS) under certain conditions,which brings hope for the treatment of cardiovascular diseases. In the proliferation and differentiation of cells, Notch signaling pathway plays a key role. In this thesis, we will make a general summarize of the specific role Notch signaling pathway plays in the differentiation of MSCs into CMs.

Bone marrow mesenchymal stem cell; Cardiomyocyte; Notch signaling pathway

2015-11-23

2012年國家自然科學(xué)基金(No.81173413)，2014年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(No.201410063014)

R54

A

1006-5687(2016)01-0066-04