周 軍，張 茉，王 杰

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

藥品質(zhì)量與檢驗

HPLC法測定丹參膠囊中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B的含量

周 軍，張 茉，王 杰

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

目的：建立HPLC法測定丹參膠囊中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B的含量。方法：采用waters Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈為流動相(A)- 0.1%三氟乙酸水溶液為流動相(B)進(jìn)行梯度洗脫，流速0.8 ml/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為286 nm。結(jié)果：丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的線性范圍分別為0.010 827～1.082 7 μg、0.000 424 6～0.042 46 μg、0.006 755～0.675 5 μg和0.109 76～3.292 8 μg；丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B平均回收率分別為102.65%、101.21%、101.13%和102.96%，RSD分別為0.63%、1.56%、0.87%和0.70%。結(jié)論：所建立的HPLC法可準(zhǔn)確測定丹參膠囊丸中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B的含量。

丹參膠囊，丹參素，原兒茶醛，迷迭香酸，丹酚酸B，高效液相色譜法，含量測定

丹參膠囊是由丹參藥材制成的中藥制劑，具有活血化瘀、鎮(zhèn)靜安神的功效，用于冠心病引起的心絞痛、心神不寧。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ04032009，原標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項下僅測定丹參酮ⅡA。丹參酚酸類成分是丹參中活血化瘀的有效成分，為了有效控制藥品的質(zhì)量，現(xiàn)采用HPLC法測定制劑中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B的含量。修訂后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高了藥品的質(zhì)量控制指標(biāo)。

1 儀器與試藥

島津LC-20AD高效液相色譜儀，配有LC-20AD 泵、SIL-20自動進(jìn)樣器、SPD-20A紫外檢測器、CTO-20AC柱溫箱；LC-solution 色譜工作站。丹參素對照品(批號110855-200809，供含量測定用)、原兒茶醛對照品(批號110810-2010007，供含量測定用，純度98.2%)、迷迭香酸對照品(批號111871-201102，供含量測定用，純度99.8%)、丹酚酸B對照品(批號111562-201110，供含量測定用，純度98.0%)，均于中國食品藥品檢定研究院購置。丹參膠囊(海南賽立克藥業(yè)有限公司，批號110904、120306、120905)。甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司)，乙腈(色譜純，默克公司)，三氟乙酸(分析純，默克公司)，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：waters Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%三氟乙酸水溶液為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫(0～7 min，2% A→10% A；7～20 min，10% A→23% A；20～35 min，23% A→27% A；35～45 min，27% A→49% A；45～46 min，49% A→2% A；46～56 min，2% A)；柱溫：25 ℃；流速：0.8 ml/min；檢測波長：286 nm。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計算應(yīng)不低于10 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml中分別含22、0.85、14和220 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取同一批號(120905)樣品10粒，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取0.1 g，精密稱定，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心5 min(3 000 r/min)，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣，測定，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方取除丹參的輔料，按【制法】制得陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制得陰性樣品溶液。分別精密吸取對照品、供試品和陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。見圖1。

1.丹參素 2.原兒茶醛 3.迷迭香酸 4.丹酚酸B

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成單一成分的對照品溶液，其中丹參素濃度分別為2.165 4、4.330 8、21.654 0、43.308 0、64.962 0和216.540 μg/ml；原兒茶醛濃度分別為0.008 492、0.169 84、0.849 2、1.698 4、2.547 6和8.492 μg/ml；迷迭香酸濃度分別為1.351、2.702、13.51、27.02、40.53和135.10 μg/ml；丹酚酸B濃度分別為21.952、43.904、87.808、219.52、439.04和658.56 μg/ml。分別精密吸取上述對照品溶液各5 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件分析，分別測定各自峰面積，以相應(yīng)對照品進(jìn)樣的量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程，見表1。

表1 回歸方程與線性范圍

2.4 精密度試驗 取同一批號樣品(120905)適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，精密加入甲醇25 ml，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“2.1”項下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B峰面積，樣品中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B峰面積平均值分別為86 533、24 007、226 771和2 071 089，RSD分別為1.79%、1.86%、1.85%和1.82%，均符合要求。

2.5 重現(xiàn)性試驗 取同一批號樣品(120905)適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，共6份，分別精密加入甲醇25 ml，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“2.1”項下色譜條件分析，樣品中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B含量平均值分別為5.572 3、0.212 8、3.727 6和59.010 8 mg/g，RSD分別為0.28%、1.14%、0.34%和0.28%，均符合要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品(120905)適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，精密加入甲醇25 ml，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、18和24 h進(jìn)樣，測定，樣品中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B峰面積平均值分別為86 886、23 768、226 771和2 068 765，RSD分別為1.84%、3.62%、1.65%和1.75%；4種成分中，原兒茶醛穩(wěn)定性測定結(jié)果RSD為3.62%，超出2%的規(guī)定，其他均符合要求。因此本品提取后，應(yīng)盡快進(jìn)行分析測定。

2.7 回收率試驗 取同一批號樣品(120905)適量，研細(xì)，取約0.05 g，精密稱定，共6份，分別精密加入丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B濃度為10.827 0、0.424 6、6.756 5和107.163 0 μg/ml的甲醇混合對照品溶液25 ml，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析。計算回收率，結(jié)果丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B平均回收率分別為102.65%、101.21%、101.13%和102.96%，RSD分別為0.63%、1.56%、0.87%和0.70%，結(jié)果均符合規(guī)定。見表2-表5。

表2 丹參素回收率試驗結(jié)果

表3 原兒茶醛回收率試驗結(jié)果

表4 迷迭香酸回收率試驗結(jié)果

表5 丹酚酸B回收率試驗結(jié)果

2.8 樣品測定 取同一廠家3個不同批號的樣品，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“2.1”項下色譜條件分析測定，計算樣品中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B含量。結(jié)果見表6。

表6 樣品含量測定結(jié)果 mg/粒

3 討論

3.1 提取溶劑及提取方法的選擇 分別采用水、乙醇、甲醇、50%甲醇及70%甲醇為提取溶劑，經(jīng)比較加熱回流、超聲提取兩種方法及不同的提取時間，結(jié)果以采用甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min，樣品中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B含量最高。

3.2 流動相的選擇 分別采用乙腈-磷酸、乙腈-甲酸等[1-3]進(jìn)行試驗。結(jié)果，供試品色譜中相關(guān)色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離度均不符合規(guī)定，后采用乙腈(A)和0.1%三氟乙酸(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫，分離效果較好。

3.3 不同色譜柱的比較 不同廠家生產(chǎn)的色譜柱(waters、資生堂、迪馬)采用正文中的流動相進(jìn)行梯度洗脫，樣品分離效果均較好。

3.4 穩(wěn)定性試驗 樣品中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B 4種成分24 h穩(wěn)定性測定結(jié)果顯示原兒茶醛RSD為3.62%，超出2%的規(guī)定，其他均符合要求；因此本品提取后，應(yīng)盡快進(jìn)行分析測定，避免相關(guān)成分分解影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.5 柱溫的影響 比較不同的柱溫25、30、35和40 ℃對樣品色譜中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B 4種色譜峰分離情況的影響，結(jié)果以25 ℃分離效果最好。

3.6 不同成分含量的比例 樣品中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B 4種成分含量的比例約為1.2∶0.04∶1∶17，其中丹酚酸B的含量最高。

1 嚴(yán)紅，高揚，郭偉，等.不同產(chǎn)地丹參藥材中丹參酮ⅡA及丹參素的含量比較[J].天津藥學(xué)，2003,15(3):10-12

2 楊菲，王智民，張啟偉，等.“一測多評”法測定丹參酚酸類成分的含量[J].中國中藥雜志，2011,36(7):2372-2379

3 程月發(fā)，藍(lán)建芳，任新平，等.丹參膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2014,33(6):785-789

啟 事

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2015-06-17

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