阿布都艾尼·熱吾提，孫俊剛，瓦熱斯江·尼亞孜，王浩，袁宏

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關(guān)節(jié)外科，新疆 烏魯木齊　830001)

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MicroRNA-134在骨肉瘤中的表達(dá)及生物學(xué)作用研究

阿布都艾尼·熱吾提，孫俊剛，瓦熱斯江·尼亞孜，王浩，袁宏*

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關(guān)節(jié)外科，新疆 烏魯木齊830001)

摘要：目的檢測(cè)微小RNA-134(microRNA-134)在骨肉瘤的表達(dá)，并探究其在骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用。方法收集40 例骨肉瘤及癌旁正常骨組織標(biāo)本，利用熒光定量PCR(Quantitative RT-PCR)檢測(cè)microRNA-134的表達(dá)情況。進(jìn)一步分析microRNA-134在骨肉瘤細(xì)胞系(HOS和Saos-2)及正常成骨細(xì)胞系(NHOst)的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)轉(zhuǎn)染microRNA-134 mimics至HOS和Saos-2細(xì)胞，并應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法、細(xì)胞劃痕以及凋亡試驗(yàn)探究其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用。結(jié)果MicroRNA-134在骨肉瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)量明顯低于配對(duì)的癌旁組織(P<0.01)，同樣microRNA-134在HOS和Saos-2細(xì)胞系中的表達(dá)亦低于NHOst細(xì)胞系(P<0.05)。細(xì)胞生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)microRNA-134可顯著抑制HOS和Saos-2細(xì)胞的增殖及遷移能力，并增加凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(CASPASE-3)表達(dá)。結(jié)論MicroRNA-134在骨肉瘤組織及細(xì)胞系中明顯低表達(dá)，并具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及增加凋亡的功能，高度提示其作為抑癌因子參與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。

關(guān)鍵詞：microRNA-134；骨肉瘤；Quantitative RT-PCR；低表達(dá)；抑癌因子

骨肉瘤是惡性度高的實(shí)體腫瘤，常好發(fā)于脛骨近端和股骨遠(yuǎn)端等長(zhǎng)管狀骨的干骺端[1]。骨肉瘤的發(fā)病率占人類惡性實(shí)體腫瘤的0.2%左右，在所有原發(fā)性的惡性骨腫瘤中，其發(fā)病率占第一位[2]。近年來(lái)，由于新型輔助化療技術(shù)的不斷發(fā)展和各類手術(shù)方式的不斷創(chuàng)新，對(duì)于沒(méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者，其5年生存率能夠達(dá)到70%左右，但總體而言，骨肉瘤的病死率及轉(zhuǎn)移率仍非常高[3]。雖然臨床研究發(fā)現(xiàn)某些致癌因子或抑癌因子在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但到目前為止，骨肉瘤發(fā)生的具體機(jī)制仍不明確[4-5]。所以，針對(duì)加強(qiáng)骨肉瘤發(fā)病分子機(jī)制的研究顯得尤為重要。

微小RNA分子(microRNA，miRNA)是一段長(zhǎng)度約為21-25核苷酸的小型非編碼RNA家族分子，其廣泛參與到細(xì)胞分化、生物發(fā)育及腫瘤形成等各種生物學(xué)過(guò)程中[6]。目前研究表明，miRNA分子對(duì)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后具有重要的作用。例如，microRNA-124可通過(guò)下調(diào)酪氨酸激酶樣孤兒受體(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2，ROR2)介導(dǎo)的Wnt信號(hào)通路抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[7]。MicroRNA-214通過(guò)作用于下游分子人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)進(jìn)而調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及惡性轉(zhuǎn)移[8]。在骨肉瘤中，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證明microRNA-140可顯著抑制細(xì)胞的增殖及遷移[9]。

MicroRNA-134屬于miRNA家族的成員之一，研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-134低表達(dá)于膠質(zhì)瘤中，并與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。MicroRNA-134通過(guò)下調(diào)蛋白O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶1(Protein O-glucosyltransferase 1，POGLUT 1)基因和Notch信號(hào)通路抑制子宮內(nèi)膜癌的生長(zhǎng)及腫瘤形成[11]。MicroRNA-134調(diào)控肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡，通過(guò)作用于WWOX基因(WW domain containing oxidoreductase，WWOX)和ERK1/2信號(hào)通路[12]。目前關(guān)于microRNA-134在骨肉瘤的研究尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究旨在分析microRNA-134在骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，并探究microRNA-134在骨肉瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能。

1資料與方法

1.1病例及組織標(biāo)本的收集2012年1月至2014年12月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院收集40 例骨肉瘤及癌旁正常骨組織標(biāo)本，每一例標(biāo)本均經(jīng)本院病理科進(jìn)行病理確診。其中男20 例，女20 例，平均年齡(52±3.4) 歲(28～63 歲)，中位年齡(48±4.6) 歲。標(biāo)本的收集均經(jīng)本醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可并獲得患者知情同意。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和相關(guān)儀器總RNA提取試劑Trizol，細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM，胎牛血清FBS，蛋白裂解液RIPA及Lipofetamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit，熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix EX TaqTM ⅡPCR Kit及PCR擴(kuò)增引物均購(gòu)自日本Takara公司。MicroRNA-134模擬物(mimics)及模擬物陰性對(duì)照(mimics control)合成于上海吉瑪基因公司。骨肉瘤細(xì)胞系(HOS 和Saos-2)及正常成骨細(xì)胞系(NHOst)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。普通PCR儀來(lái)源于美國(guó)BIO-RAD公司。LightCycler480熒光定量PCR儀購(gòu)自德國(guó)Roche公司。

1.3標(biāo)本總RNA的提取及cDNA的合成選取液氮保存的40 例配對(duì)骨肉瘤及癌旁組織，依照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取組織中的總RNA。遵照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒說(shuō)明將lμg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。合成的cDNA放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4Quantitative RT-PCR按照SYBR?Premix EX TaqTMⅡPCR Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)，以合成的cDNA作為模版在LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀上進(jìn)行Quantitative RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體系為：模版cDNA 1 μL，microRNA-134特異性引物0.2 μL，2×SYBR?Premix Mix 10 μL，microRNA-134上游引物為5′-GACTGGTTGACCAGAGGGGC-3′，下游引物為Takara公司試劑盒提供的通用引物；以U6為內(nèi)參，U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，最后加RNase-free water至反應(yīng)總體積為20 μL。Quantitative RT-PCR反應(yīng)條件為：95℃ 20 min，隨后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)。最后采用 ΔΔCT法計(jì)算 Quantitative RT-PCR所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[13]。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)所用HOS，Saos-2及NHOst細(xì)胞均采用DMEM培養(yǎng)基+10% FBS進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。實(shí)驗(yàn)均分為2組，其中試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染microRNA-134 mimics，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染mimics control。細(xì)胞鋪板后，按照上述分組采用Lipofetamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，之后按照相應(yīng)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行處理。

1.6Western blot按照蛋白裂解液RIPA說(shuō)明書(shū)，提取處理后的HOS和Saos-2細(xì)胞的總蛋白。將提取好的總蛋白使用BCA定量試劑盒定量到2 μg/μL，按比例加入5倍SDS上樣緩沖液，105℃加熱15 min使其完全變性。常規(guī)制備10% SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量25 μL，隨后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入抗BAX(ab32503，1︰1 000稀釋)及CASPASE-3抗體(ab2171，1︰1 000稀釋)，4℃過(guò)夜并室溫孵育相應(yīng)的二抗1h，隨后使用TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片。

1.7細(xì)胞增殖試驗(yàn)將HOS和Saos-2細(xì)胞培養(yǎng)后，按照96孔板進(jìn)行鋪板，并使每孔細(xì)胞數(shù)達(dá)到5 000～6 000個(gè)。之后按照上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并連續(xù)4 d每天每孔加入16 μL四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(5 g/L，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)與細(xì)胞共孵育4 h后棄上清，最后使用150 μL二甲亞砜溶解，并測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)的吸光度，計(jì)算各組平均值并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.8細(xì)胞劃痕試驗(yàn)將培養(yǎng)好的HOS和Saos-2細(xì)胞消化后，按照6 孔板進(jìn)行鋪板，并使每孔細(xì)胞數(shù)約為2×105個(gè)，當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后，用消毒過(guò)的100 μL槍頭均勻劃出4條橫線，隨后以PBS洗細(xì)胞3次去除雜質(zhì)。之后按照同樣的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后0 h及24 h進(jìn)行拍照，觀察和測(cè)定各組劃痕閉合寬度。

1.9數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量數(shù)據(jù)，表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件，兩組均數(shù)比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的Student′s檢驗(yàn)，MTT實(shí)驗(yàn)采用ANOVA檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1MicroRNA-134在骨肉瘤組織及細(xì)胞系中低表達(dá)經(jīng)Quantitative RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，40 例骨肉瘤組織中microRNA-134的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織(P<0.01)。同樣骨肉瘤細(xì)胞系(HOS和Saos-2)中microRNA-134的表達(dá)量亦低于正常成骨細(xì)胞系(NHOst，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2MicroRNA-134 mimics促進(jìn)HOS和Saos-2細(xì)胞中microRNA-134表達(dá)采用microRNA-134 mimics和mimics control轉(zhuǎn)染HOS和Saos-2細(xì)胞。48 h后，經(jīng)Quantitative RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，microRNA-134 mimics可顯著促進(jìn)HOS和Saos-2細(xì)胞中microRNA-134的表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖2。兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.3MicroRNA-134抑制HOS和Saos-2細(xì)胞的增殖細(xì)胞增殖曲線顯示結(jié)果見(jiàn)圖 3。MicroRNA-134 mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度明顯降低，轉(zhuǎn)染后1、2、3 d HOS細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

注：*P<0.05

圖1MicroRNA-134在骨肉瘤組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況

注：*P<0.01

圖2MicroRNA-134 mimics促進(jìn)HOS和Saos-2細(xì)胞中microRNA-134表達(dá)

[1-(microRNA-134 mimics/mimics control)×100%]分別為4.36%、7.29%和14.25%，以轉(zhuǎn)染后3d 最高(見(jiàn)圖3a)。Saos-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后1、2、3d細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為6.27%、8.92%和17.18%(見(jiàn)圖3b)。

注：*P<0.05

圖3MicroRNA-134對(duì)HOS和Saos-2細(xì)胞增殖的影響

2.4MicroRNA-134抑制HOS和Saos-2細(xì)胞的遷移HOS和Saos-2細(xì)胞鋪板后，采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)microRNA-134對(duì)其遷移的影響。結(jié)果見(jiàn)圖4。24 h后，mimics control組HOS細(xì)胞劃痕閉合約54%，microRNA-134 mimics組HOS細(xì)胞劃痕閉合約38%；microRNA-134 mimics組Saos-2細(xì)胞劃痕閉合約43%，mimics control組Saos-2細(xì)胞劃痕閉合約67%。HOS和Saos-2細(xì)胞中microRNA-134 mimics組與mimics control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：*P<0.05

圖4MicroRNA-134對(duì)HOS和Saos-2細(xì)胞遷移的影響

2.5MicroRNA-134促進(jìn)HOS和Saos-2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白BAX及CASPASE-3的表達(dá)為進(jìn)一步驗(yàn)證microRNA-134對(duì)HOS和Saos-2細(xì)胞凋亡的影響，我們采用Western blot檢查其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白BAX及CASPASE-3表達(dá)的影響。結(jié)果見(jiàn)圖 5所示。轉(zhuǎn)染microRNA-134 mimics后HOS細(xì)胞中BAX及CASPASE-3蛋白的表達(dá)水平分別增加3.67和3.04倍；Saos-2細(xì)胞中BAX及CASPASE-3蛋白的表達(dá)水平分別增加2.25和4.03倍。

圖5　MicroRNA-134對(duì)HOS和Saos-2細(xì)胞調(diào)亡的影響

3討論

動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程與細(xì)胞增殖、分化及凋亡行為密切相關(guān)，而異常的細(xì)胞增殖分化往往導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。研究發(fā)現(xiàn)，成熟miRNA分子通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控目的基因的表達(dá)。其主要通過(guò)與目的基因mRNA的3′UTR區(qū)域完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而降解目的基因mRNA或阻礙其蛋白的表達(dá)[15]。最近研究顯示，miRNA可以作為抑癌和/或促癌因子在各種腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮抑癌和/或促癌功能。例如microRNA-34a能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、阻滯細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16-19]，Let-7主要通過(guò)下調(diào)肺癌組織中的Ras基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，Ras)的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)及腫瘤的遷移[20]。MicroRNA-372與microRNA-373可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其主要通過(guò)激活細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK2(Cyclin-dependent kinase 2)來(lái)直接抑制抑癌基因LATS2(Large tumor suppressor kinase 2)的活性[21]。毫無(wú)疑問(wèn)，探討miRNA與腫瘤的關(guān)系，對(duì)于系統(tǒng)的掌握miRNA分子在腫瘤細(xì)胞中的功能及分子機(jī)制將起重要作用[22]。

MicroRNA-134定位于人染色體14q32位置，已有研究發(fā)現(xiàn)microRNA-134在多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)，并發(fā)揮抑癌基因的作用。本研究通過(guò)對(duì)已經(jīng)發(fā)表的骨肉瘤miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果進(jìn)行分析[23]，初步確定microRNA-134為本實(shí)驗(yàn)的主要研究對(duì)象。通過(guò)對(duì)骨肉瘤組織和相應(yīng)癌旁組織以及骨肉瘤與正常成骨細(xì)胞系中差異表達(dá)的microRNA-134進(jìn)行定時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證和比較，發(fā)現(xiàn)microRNA-134確實(shí)低表達(dá)于骨肉瘤組織及細(xì)胞系中。因此我們猜測(cè)microRNA-134在骨肉瘤中亦發(fā)揮抑癌基因的作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述設(shè)想，我們應(yīng)用MTT、細(xì)胞劃痕以及凋亡試驗(yàn)探究microRNA-134對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的影響。非常有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)microRNA-134，可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖及遷移并誘導(dǎo)其凋亡。上述結(jié)果提示microRNA-134可能作為抑癌基因參與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本試驗(yàn)觀察到microRNA-134低表達(dá)于骨肉瘤組織及細(xì)胞系，并初步揭示了microRNA-134具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及遷移并誘導(dǎo)其凋亡的作用。MicroRNA-134有望成為骨肉瘤診斷和治療的腫瘤分子標(biāo)志物，也可能作為骨肉瘤基因治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)。然而，關(guān)于microRNA-134在骨肉瘤中精確的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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The Expression and Biological Function Studies of MicroRNA-134 in Osteosarcoma

Abuduaini·Rewuti，Sun Jungang，Waresijiang·Niyazi，etal

(Department of Orthopaedics，People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China)

Abstract：ObjectiveTo detect the expression of microRNA-134 in osteosarcoma and explore its biological function in osteosarcoma cell lines.Methods40 cases of paired osteosarcoma tissues and adjacent matched normal osteosarcoma tissues were collected in our hospital and microRNA-134 expression was detected by using Quantitative RT-PCR analysis.The expression levels of microRNA-134 was also analyzed in osteosarcoma cell lines (HOS and Saos-2)and a normal osteoblast cell (NHOst).The cells biological function was assessed by using MTT，wound-healing and Western blot assays，after transfected with microRNA-134 mimics into HOS and Saos-2 cells.ResultsThe microRNA-134 expression in osteosarcoma tissues was significantly lower than paired normal tissues (P<0.01)，and its expression was also down-regulated in HOS and Saos-2 cell lines than NHOst cell (P<0.05).Over-expression of microRNA-134 could markedly inhibit cell proliferation and migration，and promote BAX and CASPASE-3 expression.ConclusionMicroRNA-134 was significantly down-regulated in osteosarcoma tissues and cell lines.MicroRNA-134 can inhibit osteosarcoma cells proliferation and migration，and induce osteosarcoma cells apoptosis，which suggest that microRNA-134 function as a tumor suppressor gene involved in osteosarcoma development.

Key words：microRNA-134；osteosarcoma；Quantitative RT-PCR；low expression；tumor suppressor gene

作者簡(jiǎn)介：阿布都艾尼·熱吾提(1982- )，男，主治醫(yī)師，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關(guān)節(jié)外科，830001。

收稿日期：2015-09-06

中圖分類號(hào)：R738.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-5572(2016)04-0331-05

*本文通訊作者：袁宏