林輝　劉雋華　周天恩　楊正飛

510640 廣州，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科(林輝)；510700 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)皮膚科(劉雋華)；510120 廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院急診科(周天恩，楊正飛)

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遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理對失血性休克液體復(fù)蘇大鼠心肌損傷的保護作用研究

林輝劉雋華周天恩楊正飛

510640 廣州，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科(林輝)；510700 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)皮膚科(劉雋華)；510120 廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院急診科(周天恩，楊正飛)

【摘要】目的利用心臟超聲、心電圖以及心肌損傷標(biāo)志物綜合評價遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理對失血性休克液體復(fù)蘇大鼠心肌損傷的保護作用。方法成年健康雄性SD大鼠(300～350 g)36只，隨機分為3組(n=12)：空白對照組(C組)、失血性休克復(fù)蘇組 (SR組)和遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理組 (RIPC組)。經(jīng)股動脈持續(xù)1 h放出全身血容量的50%血液，1 h后由股靜脈30 min回輸全部自體血，建立失血性休克和復(fù)蘇模型。RIPC組于放血前40 min采用止血帶阻斷雙側(cè)后肢血流5 min，松開5 min，反復(fù)4次，行遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理。于基礎(chǔ)狀態(tài)(BL)、放血結(jié)束即刻(S1)、回輸自體血液前(S2)、回輸結(jié)束即刻(R1)、回輸后1 h(PR1h)以及2 h(PR2h)，記錄心電圖以及平均動脈壓(MAP)，采用心臟彩色多普勒超聲測量心輸出量、LVEF、左心室短軸縮短率(FS)以及左心室心肌活動指數(shù)(Tei Index)，利用免疫化學(xué)發(fā)光儀檢測動脈血在BL、S2、PR2h時間點的心肌肌鈣蛋白I(cTnⅠ)濃度，觀察大鼠復(fù)蘇后72 h存活情況。結(jié)果與C組相比，SR組在S1至PR2h時，RIPC組在S1和S2時MAP、心輸出量、LVEF降低，Tei Index升高(P<0.01)；和SR組比較，RIPC組在復(fù)蘇開始后的MAP、心輸出量、LVEF升高，Tei Index降低(P<0.01)；在S1至PR2h，SR組與RIPC組ST段偏移程度以及cTn I濃度比C組增加(P<0.01)；然而，RIPC組的ST段偏移程度較SR組輕(P<0.01)，復(fù)蘇存活率較高(P<0.01)。結(jié)論遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理顯著減輕失血性休克液體復(fù)蘇后大鼠的心肌缺血再灌注損傷，明顯改善了生存預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】休克; 心肌缺血再灌注損傷; 缺血預(yù)處理; 心功能; 肌鈣蛋白I

心胸外科手術(shù)、選擇性血管外科手術(shù)、腫瘤切除術(shù)中均可能并發(fā)大出血，導(dǎo)致失血性休克[1]。盡管及時的液體復(fù)蘇后可以糾正血流動力學(xué)，然而缺血再灌注引起的心肌損傷不利于預(yù)后[2-3]。許多研究證實，遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理可改善缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[4]。然而遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理減輕失血性休克液體復(fù)蘇后誘發(fā)的心肌損傷程度的研究并不多見。心臟超聲、心電圖以及心肌損傷標(biāo)志物的變化綜合反映心肌損傷的嚴(yán)重程度[5-6]。本研究擬從心臟超聲以及心電圖等方面評價遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理對失血性休克液體復(fù)蘇大鼠心肌損傷的保護作用。

材料與方法

一、 動物選擇及隨機分組

成年健康雄性10周齡的SD大鼠36只，體質(zhì)量300～350 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，普通安靜的環(huán)境[溫度(25±1)℃，濕度(50±5)%]適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。應(yīng)用隨機數(shù)字表方法，把動物分為3組：空白對照組(C組，n=12)、失血性休克復(fù)蘇組(SR組，n=12)和遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理組(RIPC組，n=12)。

二、 失血性休克復(fù)蘇動物模型的制備

大鼠麻醉前禁食12 h，自由飲水。利用二氧化碳誘導(dǎo)麻醉后，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，仰臥位固定在實驗臺上。取頸正中切口，置入右頸靜脈插管用于輸血及監(jiān)測中心靜脈壓；分離右側(cè)股動脈以及股靜脈并置入導(dǎo)管用于放血及監(jiān)測平均動脈壓(MAP)。經(jīng)股靜脈注射肝素200 U/kg，10 min后采用抽血輸血雙向全自動注射泵 BYZ-810D (比揚醫(yī)療器械有限公司，中國長沙)經(jīng)股動脈持續(xù)放血1 h，血液收集在20 ml無菌注射器內(nèi)。失血量為總血容量的50%。觀察1 h后，經(jīng)30 min由股靜脈回輸全部自體血，建立失血性休克和復(fù)蘇模型。自體血回輸結(jié)束后觀察2 h，待大鼠清醒后拔除所有導(dǎo)管，縫合傷口，肌肉注射頭孢咪唑預(yù)防感染。實驗過程中采用燈照直射維持直腸溫度(38.0±0.5)℃。等待動物翻身反射恢復(fù)且清醒后回籠飼養(yǎng)觀察。C組不放血，手術(shù)操作同SR組。RIPC組于放血前40 min采用止血帶阻斷雙側(cè)后肢血流5 min，松開5 min，反復(fù)4次，行遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理，其余操作同SR組。阻斷血流的標(biāo)準(zhǔn)：雙后肢皮膚顏色改變，皮膚溫度下降，止血帶捆綁以下部位超聲監(jiān)測不到動脈搏動。本實驗方案遵循的程序經(jīng)過中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查討論后批準(zhǔn)實行。

三、 心臟彩色多普勒超聲(彩超)

于基礎(chǔ)狀態(tài)(BL)、放血結(jié)束即刻(S1)、回輸自體血液前(S2)、回輸結(jié)束即刻(R1)、回輸后1 h(PR1h)以及2 h(PR2h)，采用HD15彩色超聲儀(飛利浦公司，荷蘭)測量5個心動周期左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)，計算心輸出量、LVEF以及左心室短軸縮短率(FS)，F(xiàn)S=(LVEDD-LVESD)/ LVEDD×100%；測量5個心動周期等容舒張時間(IVRT)、等容收縮時間(IVCT)和射血時間(ET)，計算左心室心肌活動指數(shù)(Tei Index)，Tei Index=(IVCT+IVRT)/ET。

四、 心電圖ST變化

采用邁瑞B(yǎng)eneViewT5監(jiān)護儀監(jiān)測心電圖和MAP，并利用Windaq生理記錄儀連續(xù)記錄大鼠的心電圖、MAP等生理參數(shù)。以BL的ST段為基線標(biāo)準(zhǔn)，計算S1，S2，R1，PR1h以及PR2h的ST變化值。

五、 心肌損傷標(biāo)志物

在BL，S2，PR2h時間點分別抽取動脈血0.5 ml，低溫離心后提取上清液，利用ACCESS 2免疫化學(xué)發(fā)光儀檢測心肌肌鈣蛋白I(cTnⅠ)濃度。

六、 生存結(jié)局

記錄大鼠失血性休克復(fù)蘇后72 h的生存結(jié)局情況(每組存活率=每組存活大鼠數(shù)量/每組實驗大鼠總數(shù))。

七、 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、3組大鼠各個時刻血流動力學(xué)以及心功能指標(biāo)的比較

在BL時刻3組大鼠的生理學(xué)指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與對照大鼠C組比較，在S1，S2，R1時刻SR組與RIPC組MAP明顯下降；在S1至PR2h時刻，SR組與RIPC組大鼠的心輸出量、LVEF降低，Tei Index升高(P<0.01)；而FS在S1至R1時明顯升高，在回輸血液復(fù)蘇后逐漸下降(P<0.01)。與SR組大鼠比較，RIPC組在S1至PR2h時，MAP、心輸出量和LVEF，F(xiàn)S升高，Tei Index降低(P<0.01)，見表1。

表1

3組大鼠各個時刻血流動力學(xué)以及心功能指標(biāo)的比較±s)

注：與C組比較，aP<0.01，與SR組比較，bP<0.01，與前一時間點比較，cP<0.05/5；1 mm Hg=0.133 kPa

二、3組大鼠各個時刻心電圖ST段變化的比較

與對照大鼠C組比較，在S1至PR2h時SR組與RIPC組ST段較BL明顯偏移(P<0.01)。在S1和S2時，SR組與RIPC組大鼠的ST段明顯下移；在R1至PR2h時，SR組與RIPC組大鼠的ST段明顯上抬； 然而，對比RIPC組大鼠，SR組偏移程度顯著增大(P<0.01)，見表2。

表2

3組大鼠各個時刻心電圖ST段變化的比較±s)

注：與C組比較，aP<0.01;與SR組比較，bP<0.01;與前一時間點比較，cP<0.05/5

三、3組大鼠cTn I濃度的變化結(jié)果

C組大鼠的cTn I濃度在BL、S2、PR2h時間點變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異。SR組以及RIPC組大鼠的cTn I濃度在S2、PR2h明顯高于BL(P<0.01)。然而，cTn I濃度在RIPC組在S2、PR2h低于SR組(P<0.01)，見圖1。

圖1　三組動物不同時間cTnⅠ濃度變化的比較

注：與C組比較，*P<0.01；與SR組比較，#P<0.01；與前一時間點比較，+P<0.05/2

四、72 h生存結(jié)局

SR組和RIPC組動物液體復(fù)蘇后72 h內(nèi)存活率分別為2/12和10/12，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

討論

失血性休克進行液體復(fù)蘇后引起的缺血再灌注心肌損傷嚴(yán)重程度與出血量和休克時間密切相關(guān)[7]。根據(jù)既往的研究，利用出血量為總血容量50%，休克時間為1 h的方法制備嚴(yán)重的失血性休克模型，并在休克后回輸自體血進行復(fù)蘇[8]。而在本實驗中，休克時間延長至2 h。結(jié)果表明，動物放血后MAP明顯降低至60 mm Hg以下，提示大鼠失血性休克模型制備成功；回輸自體血后MAP回升至60 mm Hg，提示復(fù)蘇成功。

既往研究表明，遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理可以有效保護離體心肌的缺血再灌注損傷，包括改善心肌最大收縮速率，減少心肌的凋亡。參考既往實驗，我們在研究中利用放血前40 min采用止血帶阻斷雙側(cè)后肢血流5 min，松開5 min，反復(fù)4次的方法進行肢體缺血預(yù)處理。我們的結(jié)果和既往研究一致表明，遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理有效保護了失血性休克液體復(fù)蘇后動物的心功能，提高了復(fù)蘇后的心輸出量以及射血分?jǐn)?shù)，并改善了Tei Index以及FS，從而改善了生存預(yù)后[5]。

心肌缺血再灌注時，心肌中的氧張力降低或無氧代謝會加強，出現(xiàn)了電位差，即可出現(xiàn)ST段的偏移。在本研究中，大鼠經(jīng)歷失血性休克后的缺血損傷以后，心電圖首先是在缺血階段出現(xiàn)ST段下移；在液體復(fù)蘇再灌注后，出現(xiàn)明顯的心肌損傷，ST段繼而上抬。缺血預(yù)處理后，休克后復(fù)蘇大鼠的心電圖ST段在缺血階段以及再灌注后ST段的偏移明顯減少。這些結(jié)果表明，預(yù)處理改善了缺血再灌注的心肌損傷。

cTnⅠ被認(rèn)為是臨床上診斷心肌損傷和壞死特異性最強、敏感度最高的“ 金指標(biāo)”，當(dāng)心肌細(xì)胞通透性增加時，cTnⅠ即會從心肌細(xì)胞中滲出到血液中，從而使血清cTnⅠ水平明顯升高。本研究顯示，缺血和再灌注損傷后，休克大鼠血清cTnⅠ明顯升高；然而，經(jīng)過缺血預(yù)處理的大鼠cTnⅠ僅輕度增高。因此，經(jīng)過遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理后，缺血再灌注引起的心肌損傷程度明顯減輕。

綜上所述，遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理可顯著減輕失血性休克液體復(fù)蘇后大鼠的心肌缺血再灌注損傷，從而明顯改善了生存預(yù)后。

參考文獻

[1]Copeland GR, Jones D, Walters M. POSSUM: a scoring system for surgical audit. Br J Surg，1991，78(3):355-360.

[2]Reynolds PS, Barbee RW, Skaflen MD, Ward KR. Low-volume resuscitation cocktail extends survival after severe hemorrhagic shock. Shock，2007，28(1):45-52.

[3]Barbee RW, Reynolds PS, Ward KR.Assessing shock resuscitation strategies by oxygen debt repayment. Shock，2010,33(2):113-122.

[4]Lang SC, Els?sser A, Scheler C, Vetter S, Tiefenbacher CP, Kübler W, Katus HA, Vogt AM.Myocardial preconditioning and remote renal preconditioning-identifying a protective factor using proteomic methods? Basic Res Cardiol，2006,101(2):149-158.

[5]Hu X, Yang Z, Yang M, Qian J, Cahoon J, Xu J, Sun S, Tang W. Remote ischemic preconditioning mitigates myocardial and neurological dysfunction via K(ATP)channel activation in a rat model of hemorrhagic shock. Shock，2014，42(3):228-233.

[6]Wallace KB, Hausner E, Herman E, et al. Serum troponinsas biomarkers of drug-induced cardiac toxicity. Toxicol Pathol，2004，32(1): 106-121.

[7]Wallace KB, Hausner E, Herman E, Holt GD, MacGregor JT, Metz AL, Murphy E, Rosenblum IY, Sistare FD, York MJ. Remote ischemia preconditioning for renal and cardiac protection during endovascular aneurysm repair: a randomized controlled trial. J Endovasc Tber，2009,16(6)：680-689.

[8]Fang X, Tang W, Sun S, Huang L, Chang YT, Castillo C, Weil MH. Comparison of buccal microcirculation between septic and hemorrhagic shock. Crit Care Med，2006,34(12 Suppl)：S447-S453.

Effect of remote ischemic pre-conditioning on myocardial ischemic injury in a hemorrhagic shock-reperfusion rat model

LinHui,LiuJuanhua,ZhouTianen,YangZhengfei.

DepartmentofInternalMedicine,HospitalofSouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510640,China

【Abstract】ObjectiveCardiac ultrasound, electrocardiogram and measurement of myocardial injury markers were performed to comprehensively investigate the effect of remote ischemic pre-conditioning (RIPC) upon myocardial ischemic injury in a hemorrhagic shock-reperfusion rat model. MethodsThirty six male adult Sprague-Dawley rats, weighing 300-350 g, were randomly divided into the sham control (C), hemorrhagic shock-reperfusion (SR) and RIPC groups (n=12 for each group). Hemorrhagic shock-reperfusion rat models were established by 60-min bleeding (50% of total blood volume) via femoral artery followed by 30-min reperfusion via femoral vein at 1 h later. In the RIPC group, bilateral hind limbs were clamped at 40 min before hemorrhage. The procedure involved four cycles of 5 min of ischemia followed by 5 min of reperfusion. Electrocardiographic tracing and mean arterial pressure (MAP) were continuously recorded for at baseline (BL), immediately after bleeding (S1), before reperfusion (S2) and after reperfusion (R1) and 1 h after reperfusion (PR1h) and 2 h after reperfusion (PR2h, respectively. Cardiac output (CO), left ventricular ejection fraction (LVEF), fractional shortening (FS) and Tei Index were measured by electrocardiogram. The concentration of cardiac troponin I (cTnI) in the arterial blood was measured at BL, S2 and PR2h. The survival of animals was observed at 72 after resuscitation. ResultsCompared with the C group, the MAP, CO and FS in the SR group at S1-PR2h, and in the RIPC group at S1-S2 were significantly decreased whereas Tei Index was considerably elevated (all P<0.01). Compared with the SR group, the MAP, CO and FS were significantly decreased whereas Tei Index was considerably increased in the RIPC group after resuscitation (all P<0.01). From S1 to PR2h, ST-segment depression and cTn I concentration in the SR and RIPC groups were significantly higher than those in the C group (all P<0.01), whereas the degree of increase in the RIPC group was significantly less than that in the SR group (P<0.01). The survival rate after resuscitation in the RIPC group was also significantly higher compared with that in the SR group (P<0.01). ConclusionRIPC effectively alleviates myocardial ischemic injury and significantly enhances prognosis outcomes in a hemorrhagic shock-reperfusion rat model.

【Key words】Shock; Myocardial reperfusion injury; Ischemic pre-conditioning; Cardiac function; Troponin I

(收稿日期：2015-12-06)(本文編輯：楊江瑜)

Corresponding author， Yang Zhengfei, E-mail: yangzhengfei@vip.163.com

通訊作者，楊正飛，E-mail:yangzhengfei@vip.163.com

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.04.006

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