毛　婷，　李江華*，　劉　龍，　堵國(guó)成，　陳　堅(jiān)（1．江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

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信號(hào)肽對(duì)Bacillus subtilis表達(dá)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

毛婷1，2，李江華*1，2，劉龍1，2，堵國(guó)成1，2，陳堅(jiān)1，2
（1．江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

摘要：將來(lái)源于作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存E.coli pET-20b（+）/CGT△E-CBMAmy的CGT△ECBMAmy基因插入6種含有不同信號(hào)肽（estA、bpr、vpr、yncM、yvgO和ywbN）的穿梭質(zhì)粒pMA0911-SPs中，構(gòu)建了6種重組表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主B. subtilis WB600中，獲得了6株重組菌。在相同的發(fā)酵條件下，estA信號(hào)肽介導(dǎo)的分泌效果最好，L-抗壞血酸2-葡萄苷產(chǎn)量達(dá)到0.81 g/L，明顯高于其他5株重組菌。選取WBpMB/CGT△E-CBMAmy作為出發(fā)菌株，進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了CGT△E-CBMAmy酶的高效表達(dá)，最終使AA-2G產(chǎn)量提高了2.16倍，VC轉(zhuǎn)化率達(dá)到21.9%。

關(guān)鍵詞：環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；信號(hào)肽；枯草芽孢桿菌；異源表達(dá)

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（簡(jiǎn)稱CGT）屬于轉(zhuǎn)移酶家族（EC 2.2.1.19），是一種能夠通過(guò)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)轉(zhuǎn)化淀粉及相關(guān)基質(zhì)合成環(huán)糊精的胞外酶[1]。它主要催化3種轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)（歧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)和偶合反應(yīng)）和水解反應(yīng)[2]，CGT酶通過(guò)歧化反應(yīng)，先將淀粉或環(huán)糊精轉(zhuǎn)化為單糖、雙糖或低聚糖，然后將這些糖分子作為供體轉(zhuǎn)移到各種受體分子上，從而改善受體分子的性質(zhì)[3]，成為近幾年研究的熱點(diǎn)。

L-抗壞血酸（VC）是一種人體必需但無(wú)法自身合成的水溶性維生素，穩(wěn)定性差，在光照、金屬離子作用及水溶液中很容易氧化[4]。CGT通過(guò)歧化作用可使VC與低聚糖反應(yīng)合成葡萄糖基-L-抗壞血酸，其產(chǎn)物穩(wěn)定性明顯提高[3]，而L-抗壞血酸2-葡萄苷（AA-2G）就是一種VC的糖基衍生物，在醫(yī)療保健和健康方面具有巨大的應(yīng)用潛力。與其他的VC糖基衍生物相比，AA-2G具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1）AA-2G具有很高的耐熱性和抗氧化性，因此穩(wěn)定性和安全性最佳[5]；2）AA-2G易于被人體吸收，吸收后降解也非常容易，降解后釋放的VC能發(fā)揮其生理作用；3）生物酶法轉(zhuǎn)化是目前報(bào)道合成AA-2G的惟一方法[3]，該方法操作簡(jiǎn)便，污染少，易于控制。

淀粉水解酶具有用于結(jié)合淀粉顆粒的非催化區(qū)域，稱為碳水化合物物結(jié)合域（CBM），該區(qū)域通常能夠特異性結(jié)合多糖[6]。本研究E.coli pET-20b （+）/CGT△E-CBMAmy[7]是將來(lái)自于堿性Alkalimonas amylolytica淀粉酶的CBM與來(lái)自于P. macerans CGTase融合，構(gòu)建了嵌合酶基因CGT△E-CBMAmy，以提高可溶性淀粉作為底物時(shí)的底物特異性，以此來(lái)為糖基供體生產(chǎn)AA-2G。該方法使嵌合酶失去了CGT酶的環(huán)化活力，但歧化活力有所提高（本研究以AA-2G產(chǎn)量的高低表征歧化活力的高低）。

能分泌CGT酶的微生物種類很多，但目前工業(yè)生產(chǎn)中所用的生產(chǎn)菌株一般為芽孢桿菌[8]?？莶菅挎邨U菌是公認(rèn)的符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)的宿主，具有優(yōu)秀的蛋白質(zhì)分泌能力，含有豐富的信號(hào)肽序列且無(wú)明顯的密碼子偏好性，其作為異源蛋白的表達(dá)宿主具有明顯優(yōu)勢(shì)[9]。為提高異源蛋白的表達(dá)，除了選用合適的啟動(dòng)子及表達(dá)載體外，選用匹配度高的信號(hào)肽也是一種非常有效的手段[10]。不同的信號(hào)肽對(duì)不同的異源蛋白的分泌表達(dá)有著一定的影響，成成等[11]將CGT插入含有pelB信號(hào)肽質(zhì)粒中并在大腸中表達(dá)，李斌等[1]將pelB信號(hào)肽換成OmpA信號(hào)肽，CGT酶的表達(dá)量明顯提高。Ismael等[12]利用天冬酰胺酶信號(hào)肽提高CGT表達(dá)，酶活提高了1.7倍。Ong等[13]利用Bacillus sp.的G1信號(hào)肽提高CGT表達(dá)，酶活提高了62.3%。

我們選取枯草作為表達(dá)宿主，將來(lái)源于E.coli pET-20b（+）/CGT△E-CBMAmy的CGT△E-CBMAmy基因插入含有6種不同信號(hào)肽的pMA0911-SPs系列載體中并在B. subtilis WB600表達(dá)，得到了一株AA-2G合成能力高的重組菌，并將其為出發(fā)菌株，考察了初始pH、溫度、碳源、氮源、金屬離子對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響。最終使AA-2G產(chǎn)量達(dá)到1.75 g/L，VC轉(zhuǎn)化率達(dá)到21.9%。

1　材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

E.coli pET-20b（+）/CGT△E-CBMAmy，克隆宿主菌E. coli JM109，表達(dá)宿主菌B. subtilis WB600，表達(dá)質(zhì)粒pMA0911-SPs（含有不同信號(hào)肽的pMA0911衍生質(zhì)粒）：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；克隆質(zhì)粒pMD18-T-simple：TaKaRa（大連）生物工程有限公司；WBpMB/CGT△E -CBMAmy、WBpMCCGT△E -CBMAmy、WBpMG/CGT△E -CBMAmy、WBpMJ/CGT△E -CBMAmy、WBpML/CGT△E -CBMAmy及WBpMM/ CGT△E-CBMAmy：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2試劑、酶、Marker及相關(guān)試劑盒

限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI，PCR用酶PrimerStar Taq、Ex Taq、SolutionI，感受態(tài)制備試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、片段回收和膠回收試劑盒：TaKaRa（大連）生物工程有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素等試劑：上海生工生物工程有限公司；酵母粉和胰蛋白胨：Oxoid公司；麥芽糊精：山東西王食品有限公司；VC：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；AA-2G標(biāo)準(zhǔn)品：和光純藥工業(yè)株式會(huì)社（日本）；標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、緩沖液：碧云天生物技術(shù)研究所；其它各種試劑：國(guó)產(chǎn)分析純；引物合成和測(cè)序：由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1種子培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)基LB+1 g/dL葡萄糖，TB培養(yǎng)基，TSB培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[20]。

1.4 CGTΔE-CBMAmy酶基因的克隆

以E.coli pET-20b（+）/CGT△E-CBMAmy為模板，利用引物P1/P2對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃3 min；98℃30 s；56℃30 s；72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR引物如下：P1：CGGAATTCTCACCCGATACGAGCGTGGACA，P2：CGGGATCCTTAAAAACCGCCATTGAAGGAC。P1/P2分別含EcoRI和BamHI的限制性酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增得到的不含信號(hào)肽的CGT△E-CBMAmy基因片段與pMD18-T-simple連接并轉(zhuǎn)入宿主E. coli JM109。通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證篩選陽(yáng)性菌株，挑選陽(yáng)性菌株在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證及測(cè)序鑒定。

1.5表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將測(cè)序正確的質(zhì)粒pMD18-T-simple/CGT△ECBMAmy經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后回收目的片段，與以同樣的方法獲得含有不同信號(hào)肽的E.coli-B.subtilis穿梭載體pMA0911-SPs采用Solution I連接酶連接。將重組載體采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法[14]轉(zhuǎn)入B. subtilis WB600中，在含有50 μg/mL卡那霉素平板上篩選獲得陽(yáng)性克隆，菌落PCR并酶切驗(yàn)證。

1.6分析方法

1.6.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳按文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行。

1.6.2 AA-2G合成反應(yīng)條件酶液1 mL，25 g/L麥芽糊精0.5 mL，25 g/L VC 0.5 mL，28℃，pH 6.5，200 r/min避光避氧24 h[15]。

1.6.3 AA-2G檢測(cè)高效液相色譜法[16]。色譜柱：Amethyst C18-H（5 μm，4.6 mm×250 mm）；檢測(cè)器：Variable Wavelength Detector（UV）；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：KH2PO4（0.025 mol/L）∶甲醇=99.5∶0.5，用磷酸調(diào)pH至2.0。

1.7培養(yǎng)方法

1.7.1種子培養(yǎng)條件挑取WBpMB/CGT△ECBMAmy接入含有50 μg/mL Kan的LB培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)12 h。

1.7.2發(fā)酵條件按4%接種體積分?jǐn)?shù)接種至TB發(fā)酵培養(yǎng)基中，36 h后離心收集上清液。

2　結(jié)果與討論

2.1重組菌的構(gòu)建與表達(dá)

參照1.4及1.5步驟，構(gòu)建得到了分別攜帶重組載體pMB/CGT△E -CBMAmy、pMC/CGT△E -CBMAmy、pMG/CGT△E -CBMAmy、pMJ/CGT△E -CBMAmy、pML/CGT△E-CBMAmy、pMM/CGT△E-CBMAmy的重組菌WBpMB/CGT△E -CBMAmy、WBpMC/ CGT△E -CBMAmy、WBpMG/CGT△E -CBMAmy、WBpMJ/ CGT△E-CBMAmy、WBpML/CGT△E-CBMAmy、WBpMM/ CGT△E-CBMAmy。分別取提質(zhì)粒，用EcoRI和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒得到20 kb的目的基因CGT△ECBMAmy片段與71 kb的目的基因pMA0911-SPs片段，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組菌構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1 （a）。將6株重組菌按1.7步驟的發(fā)酵條件發(fā)酵，并用12 g/dL SDS-PAGE對(duì)重組菌WBpMB/CGT△ECBMAmy發(fā)酵上清液檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與CGT△E-CBMAmy酶相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)應(yīng)的74 000處有條帶，陰性對(duì)照中沒(méi)有相應(yīng)條帶。證明CGT△E -CBMAmy在B. subtilis WB600中成功表達(dá)。按1.6步驟測(cè)AA-2G產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖1（b）?？梢?jiàn)重組菌WBpMB/CGT△ECBMAmy中CGT△E-CBMAmy酶的表達(dá)效果最佳，因此我們選取重組菌WBpMB/CGT△E-CBMAmy進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

圖1　不同重組菌質(zhì)粒酶切驗(yàn)證及AA-2G產(chǎn)量比較Fig. 1　 Restriction enzyme analysis of recombinants plasmid and comparion of AA-2G production

2.2重組菌WBpMB/CGTΔE-CBMAmy發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1不同初始培養(yǎng)基對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響為了獲得適合重組枯菌的初始培養(yǎng)基，選取了4種枯草芽孢桿菌常用培養(yǎng)基（TSB、LB、LB+1 g/dL葡萄糖、TB）進(jìn)行重組菌發(fā)酵。結(jié)果見(jiàn)圖2（a）所示，TB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，AA-2G產(chǎn)量達(dá)到0.9 g/L，表明在所選的4種培養(yǎng)基中，TB最有利于CGT△E-CBMAmy酶的表達(dá)。

2.2.2不同溫度對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響溫度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶都有著重要的影響，作者考察了4種不同的溫度條件對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響。從圖2（b）中可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，CGT△E-CBMAmy表達(dá)量增高，AA-2G產(chǎn)量增高。37℃時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量最高，但溫度達(dá)到42℃后，AA-2G產(chǎn)量下降，原因可能為溫度過(guò)高，菌體生產(chǎn)合成速率過(guò)快，質(zhì)粒的穩(wěn)定性降低，限制了酶的表達(dá)。

2.2.3初始pH對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響pH對(duì)于菌體的發(fā)酵產(chǎn)酶有重要的作用，pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。作者選擇初始pH值依次為5、6、7、8、9的TB培養(yǎng)基培養(yǎng)重組菌，考察了初始pH對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響。從圖2（c）中可以看出，初始pH 7時(shí)，AA-2G產(chǎn)量最高。

2.2.4種齡對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響種齡對(duì)菌體發(fā)酵合成產(chǎn)物的影響很大，當(dāng)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)活力最強(qiáng)，會(huì)很快適應(yīng)新的環(huán)境，并進(jìn)入生物合成期。作者選擇了處于不同種齡的菌體進(jìn)行發(fā)酵，從圖2（d）中可以看出，種齡為7 h的種子液最有利于CGT△E-CBMAmy的表達(dá)，AA-2G產(chǎn)量也明顯高于其余4組。

圖2　重組菌發(fā)酵條件對(duì)AA-2G產(chǎn)量的影響Fig. 2 Comparison of AA-2G production during process optimization

2.2.5不同碳源對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響以TB為初始培養(yǎng)基，按照碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等原則，選擇了葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、甘油6種碳源，研究了不同碳源對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3（a）。當(dāng)以葡萄糖和甘油為碳源時(shí)，CGT△E-CBMAmy表達(dá)量高，AA-2G產(chǎn)量分別達(dá)到1.41 g和1.43 g左右。但葡萄糖成本較低，因此選擇葡萄糖作為碳源并對(duì)其添加濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖3（b）。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，AA-2G產(chǎn)量達(dá)到1.52 g，可見(jiàn)此質(zhì)量濃度更有利于CGT△E-CBMAmy表達(dá)。隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高反而抑制了CGT△E-CBMAmy的表達(dá)，AA-2G產(chǎn)量降低。

圖3　不同碳源及葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)AA-2G產(chǎn)量的影響Fig. 3　 Effect of difficult carbon source and glucose concentration on AA-2G production

2.2.6不同氮源對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響氮源種類對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶都會(huì)產(chǎn)生很大影響。根據(jù)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等的原則，選取9種不同氮源（魚(yú)粉、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、尿素、玉米漿、酪蛋白、硫酸銨、氯化銨、胰蛋白胨）代替原有培養(yǎng)基中的氮源蛋白胨，酵母粉質(zhì)量濃度不變（24 g/L），考察了不同氮源對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響。結(jié)果見(jiàn)圖4 （a）所示，可以看出以牛肉浸膏為氮源時(shí)，AA-2G產(chǎn)量最高，達(dá)到1.75 g/L。培養(yǎng)基中碳/氮比對(duì)菌體的代謝也會(huì)產(chǎn)生很大的影響，因此進(jìn)一步對(duì)牛肉浸膏的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，確定最優(yōu)質(zhì)量濃度后又對(duì)酵母粉質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化。從圖4（b）中可以看出當(dāng)牛肉浸膏質(zhì)量濃度為10 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度為25 g/L條件下，AA-2G產(chǎn)量可達(dá)到1.62 g/L。

2.2.7金屬離子及濃度對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響金屬離子也是CGT酶生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，Gawande等[17]和Jing-Bong等[18]發(fā)現(xiàn)在CGT酶生產(chǎn)中必須添加鎂離子；Rosso等人[19]發(fā)現(xiàn)鐵離子是提高B. circulans DF 9Rβ-CGT酶產(chǎn)量的最有效金屬離子，鎂離子則對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。在培養(yǎng)基中分別添加Fe3+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+，考察了它們對(duì)CGT△E-CBMAmy表達(dá)的影響。從圖5（a）中可以看出，添加Zn2+和Mg2+時(shí)，AA-2G產(chǎn)量可以達(dá)到1.75 g/L，可見(jiàn)添加Zn2+和Mg2+有利于產(chǎn)酶。隨后考察了不同Zn2+質(zhì)量濃度和不同Mg2+質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響，從圖5（b）中看出Zn2+質(zhì)量濃度為0.1 g/L，Mg2+質(zhì)量濃度為0.6 g/L時(shí)有利于產(chǎn)酶。

圖4　不同氮源及氮源質(zhì)量濃度對(duì)AA-2G產(chǎn)量的影響Fig. 4　 Effect of difficult nitrogen source and nitrogen concentrations on AA-2G production

圖5　不同金屬離子（a）及金屬離子質(zhì)量濃度（b）對(duì)AA-2G產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of difficult metal ions source and metal ions concentration on AA-2G production

3　結(jié)語(yǔ)

將CGT△E-CBMAmy酶基因克隆到含有6種不同信號(hào)肽的穿梭質(zhì)粒pMA0911-SPs上，構(gòu)建得到了能胞外生產(chǎn)CGT△E-CBMAmy的6種重組菌。其中estA信號(hào)肽最有利于CGT△E-CBMAmy胞外表達(dá)，攜帶estA信號(hào)肽的重組菌WBpMB/CGT△E-CBMAmy的AA-2G產(chǎn)量達(dá)到0.81 g/L，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的研究，獲得了重組菌WBpMB/CGT△ECBMAmy的最佳發(fā)酵條件：葡萄糖5 g/L，酵母粉10 g/ L，牛肉浸膏25 g/L，氯化鋅0.1 g/L，硫酸鎂0.6 g/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO4 17 mmol/L，初始pH為7.0，培養(yǎng)溫度為37℃。在該條件下AA-2G產(chǎn)量達(dá)到1.75 g/L，與優(yōu)化前相比提高了1.16倍，使VC轉(zhuǎn)化率達(dá)到21.9%。

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Effects of Signal Peptides on Extracellular Expression of Cyclodextrin Glycosyltransferase in Bacillus subtilis

MAO Ting1，2，LI Jianghua*1，2，LIU Long1，2，DU Guocheng1，2，CHEN Jian1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：CGT△E-CBMAmygene from E. coli pET-20b（+）/CGT△E-CBMAmywas cloned and inserted into the expression plasmid pMA0911-SPs containing six different signal peptides（estA，bpr，vpr，yncM，yvgO and ywbN），which were further transformed into B. subtilis WB600 for overexpression to obtain six recombinant strains. The results showed that estA was the optimal signal peptide among all the signal peptides under the same culture conditions，the yields of AA-2G was up to 0.81 g/L，obvious higher than that of the other five strains. Therefore，WBpMB/CGT△E-CBMAmywas chosen as the starting strain and the optimum conditions for extracellular expression of CGT△E-CBMAmywere investigated in shaking flask. Finally，the high expression of CGT△E-CBMAmyenzyme was achieved，and the yields of AA-2G was about 2.16 times higher than that before optimization and the conversion rate of VC reached 21.9%.

Keywords：cyclodextringlucosetransferase，signalpeptide，Bacillus subtilis，heterologousexpression

*通信作者：李江華（1966—），男，江西九江人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶工程與生物催化方面的研究。E-mail：lijianghua@jiangnan.edu.cn

基金項(xiàng)目：江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（BE2011624）。

收稿日期：2014-08-22

中圖分類號(hào)：Q 555

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）02—0173—07