邢德明，　李新華，　袁慎亮，　王曉輝*，　遲乃玉，　張慶芳（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連1166；.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866；3.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連1166）

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SOD乳酸菌高產(chǎn)菌株篩選鑒定及SOD分離純化

邢德明2，3，李新華2，袁慎亮1，3，王曉輝*1，3，遲乃玉1，3，張慶芳1，3
（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866；3.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

摘要：篩選出一株產(chǎn)SOD乳酸菌，并對(duì)SOD進(jìn)行分離純化。采用平板富集、革蘭氏染色等方法進(jìn)行初篩。再通過鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)SOD酶活進(jìn)行復(fù)篩。并經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)、16S-rDNA基因序列分析進(jìn)行菌種鑒定。通過硫酸銨沉淀、超濾、Sephadex-G100、DEAE-Sepharose FF等方法進(jìn)行純化。篩選得到一株產(chǎn)SOD相對(duì)較高菌株SD006，經(jīng)鑒定為L(zhǎng)actobacillus plantarum，純化后酶活達(dá)37 959.2 U/g。細(xì)菌SD006是一株產(chǎn)SOD的植物乳酸菌，乳酸菌是一種人體益生菌，乳酸菌SOD可作為食用SOD添加到食品中，具有潛在開發(fā)價(jià)值和廣闊應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；超氧化物歧化酶；鑒定；分離純化

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，ECl. 15.1.1，簡(jiǎn)稱SOD），是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的酸性金屬酶。1938年由Mann和Keilin從牛紅細(xì)胞中分離得到。1969年Mccord和Fridovich發(fā)現(xiàn)該酶生物催化活性并命名為超氧化物歧化酶[1-2]。SOD是生物體內(nèi)最佳的自由基清除劑，其應(yīng)用廣泛，可應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[3-6]。目前SOD主要是從動(dòng)物血液及植物中提取。從動(dòng)物血液或植物中提取SOD存在成本高、易污染、易受季節(jié)影響等缺點(diǎn)；而微生物SOD則具有成本低、不易被污染、不受季節(jié)影響、工藝簡(jiǎn)單、易形成規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。目前產(chǎn)SOD菌株研究多集中在酵母菌，對(duì)產(chǎn)SOD乳酸菌研究較少。乳酸菌是一類重要的工業(yè)微生物，其不僅可以提高食品營養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味，且乳酸菌是人體益生菌，有增強(qiáng)人體免疫力、降血壓等作用[9-14]，因此產(chǎn)SOD乳酸菌選育具有潛在開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。

通過鄰苯三酚自氧化法從酸菜、牛奶、大醬等食品中篩選出一株產(chǎn)SOD酶活較高的菌株，并對(duì)其SOD進(jìn)行初步純化。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源采自遼中地區(qū)農(nóng)村鮮牛奶、農(nóng)家酸菜汁、農(nóng)家黃豆醬樣品共計(jì)50份。

1.1.2主要儀器雷磁PHS-3C型pH計(jì)：上海精科制造；JY98-3D超聲波細(xì)胞破碎機(jī)；寧波新芝生物科技有限公司；HD-4電腦核酸蛋白檢測(cè)儀：上海滬西分析儀器有限公司；CBS-B程控多功能自動(dòng)部份收集器：上海滬西分析儀器有限公司；UV-1200型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.1.3主要試劑鄰苯三酚AR（滬試）；磷酸氫二鈉AR（滬試）；磷酸二氫鈉AR（滬試）；EDTA（Sigma公司）。

1.1.4富集培養(yǎng)基蛋白胨1 g/dL、酵母膏0.5 g/dL、NaCl 1 g/dL、瓊脂2 g/dL；pH 7.0（0.1 MPa滅菌20 min）。

1.1.5初篩培養(yǎng)基葡萄糖2.5 g/dL、蛋白胨2.5 g/dL、酵母膏1 g/dL、溴甲酚紫0.02 g/dL、瓊脂2 g/dL；pH 7.0（0.1 MPa滅菌20 min）。

1.1.6發(fā)酵培養(yǎng)基牛肉膏0.5 g/dL、酵母粉0.5 g/dL、蛋白胨1 g/dL、磷酸氫二鉀0.2 g/dL、檸檬酸鐵銨0.15 g/dL、乙酸鈉0.5 g/dL、葡萄糖2 g/dL、吐溫-80 0.1 g/dL、MgSO4·7H2O 0.05 g/dL、MnSO4·4H2O 0.02 g/dL；pH 7.0（0.1 MPa滅菌20 min）。

1.2方法

1.2.1產(chǎn)SOD乳酸菌初篩將樣品接種于10 mL LB發(fā)酵液中做種子液，于25℃培養(yǎng)12 h，將種子液分別稀釋10-7、10-10、10-13、10-16四個(gè)梯度，涂布于富集培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)36 h，將不同菌落分別劃線在初篩培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)36 h。把使初篩平板變色的菌株進(jìn)行革蘭氏染色。將革蘭氏陽性且無芽孢的菌株送寶生物工程（大連）有限公司鑒定。將鑒定為乳酸菌的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min搖床培養(yǎng)36 h。

1.2.2產(chǎn)SOD乳酸菌復(fù)篩將初篩菌株發(fā)酵液于4℃、5 000 r/min離心15 min得到濕菌體，用無菌水洗2次，4℃、5 000 r/min離心15 min，將濕菌體用pH 7.8磷酸緩沖液按1∶5比例稀釋，于300 W超聲波、冰浴下破碎20 min（破碎5 s間隔5 s），6 000 r/min離心20 min，收集上清即粗酶液。采用鄰苯三酚自氧化法[15-16]分別測(cè)定各菌株粗酶液SOD酶活。

酶活定義：以1 mL反應(yīng)液每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速度50%的酶量為一個(gè)超氧化物歧化酶酶活力單位。

1.2.3菌株的鑒定

1）形態(tài)學(xué)觀察：在平板培養(yǎng)基上觀察菌落形狀、顏色、大小等形態(tài)學(xué)特征，通過不同染色方法在光學(xué)顯微鏡（10×100）下觀察菌落形態(tài)。

2）生理生化研究：根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》設(shè)計(jì)生理生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)葡萄糖、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、山梨醇、甘油、明膠液化、H2O2、吲哚、甲基紅等指標(biāo)進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

3）16S rDNA序列分析：采用酚氯仿抽提法提取菌株DNA。使用細(xì)菌16S rDNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物序列為Forward primer P1（5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT -3’）和Revese primer P2 （5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）。擴(kuò)增反應(yīng)體系Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，Buffer 5.0 μL，dNTP mixture 5.0 μL，P1 primer 1.0 μL，P2 primer 1.0 μL，加ddH2O至50 μL。PCR循環(huán)條件：98℃預(yù)變性4 min，一次循環(huán)；98℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，30次循環(huán)；修復(fù)延伸，72℃5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測(cè)序。

提交菌株SD006的16SrDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，選取相似性最高的20株菌的16SrDNA序列，進(jìn)行ClustalX比對(duì)，利用MEGA5.05軟件分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 SOD純化

1）硫酸銨沉淀：粗酶液中加入硫酸銨，4℃鹽析12 h，蛋白質(zhì)沉淀用pH 7.8的磷酸緩沖液（含EDTA 0.2 mmol/L）溶解。分別測(cè)不同濃度下得到的沉淀酶活，最后收集含酶活的蛋白沉淀，溶解得鹽析酶液。

2）透析超濾：將鹽析酶液轉(zhuǎn)入預(yù)先處理好的透析袋中，4℃透析24 h，用于除去小分子物質(zhì)及金屬離子。將透析后的酶液轉(zhuǎn)入10 000超濾管，4℃、5 000 r/min離心30 min?；厥諠饪s酶液，4℃保藏。

3）葡聚糖（G-100）凝膠柱：取5 mL濃縮酶液，加入經(jīng)pH 6.8磷酸緩沖液預(yù)平衡的Sephadex G100柱（Ф1.6 cm×50 cm），調(diào)節(jié)恒流泵洗脫速度0.3 mL/min。調(diào)節(jié)自動(dòng)收集器每管3 mL，根據(jù)洗脫峰記錄試管編號(hào)，分別測(cè)定每管酶活。

4）DEAE-Sepharose FF：取5 mL酶液，加入經(jīng)pH 7.8磷酸緩沖液預(yù)平衡的DEAE-Sepharose FF柱（Ф1.6 cm×30 cm），依次用含0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl的pH 7.8磷酸緩沖液洗脫。調(diào)節(jié)恒流泵洗脫速度0.3 mL/min。調(diào)節(jié)自動(dòng)收集器每管3 mL，根據(jù)洗脫峰記錄試管編號(hào)，分別測(cè)定每管酶活。

5）SDS-PAGE：采用SDS-PAGE鑒定酶液純化程度，用考馬斯亮藍(lán)染色法確定電泳條帶位置。電泳規(guī)格：分離膠12 g/dL，濃縮膠5 g/dL，電壓150 V，1.5 mm梳，時(shí)間2 h，考馬斯亮藍(lán)R250染色。

2　結(jié)果與討論

2.1菌種篩選及鑒定

2.1.1菌種篩選

1）產(chǎn)SOD乳酸菌菌株初篩：從所采集的樣品中共分離得到57株菌株，其中使BCP平板變色的產(chǎn)酸菌32株，鏡檢革蘭氏染色陽性無芽孢菌株21株，經(jīng)鑒定，其中17株為乳酸菌。

2）產(chǎn)SOD乳酸菌菌株復(fù)篩：在初篩基礎(chǔ)上，利用鄰苯三酚自氧化法測(cè)出初篩分離得到的乳酸菌SOD粗酶液酶活和菌體濕重，見表1。其中菌株SD006菌體濕重為31.7 g/L，酶活2 957.63 U/g。其酶活相對(duì)較高，因此選用SD006為本實(shí)驗(yàn)出發(fā)菌株。

表1　菌株SOD酶活及菌體濕重Table 1 SOD activity and bacterial wet weight of strains

2.1.2菌株SD006鑒定

1）形態(tài)學(xué)觀察：由圖1-2可知，菌株SD006為圓形菌落，菌落突起，表面光滑。鏡檢為革蘭氏陽性，桿狀，無芽孢。

圖1　菌株SD006平板劃線圖Fig. 1 Streak plate of strain SD006

圖2　菌株SD006顯微形態(tài)特征Fig. 2 Micro-morphology of strain SD006

2）生理生化試驗(yàn)：菌株SD006的生理生化特征測(cè)定結(jié)果見表2。菌株SD006可分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖、乳糖。甲基紅試驗(yàn)、甘露醇試驗(yàn)、山梨醇試驗(yàn)為陽性。明膠水解試驗(yàn)、H2O2試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、鼠李糖試驗(yàn)、甘油試驗(yàn)呈陰性。

表2　菌SD006生理生化特征Table 2　 Physiological and biochemical characteristics of strains SD006

3）菌株16sRNA序列分析：通過16sRNA序列分析菌株SD006含1 417 bp，將基因序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，基于與SD006同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。其與Lactobacillus plantarum（NR 042394.1）同源性最高。SD006與Lactobacillus plantarum相似性達(dá)99%，結(jié)合生理生化特征，可確定SD006屬于Lactobacillus plantarum。

圖3　植物乳酸桿菌SD006系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree showing the relationships of SD006 with the sequence of relating type

2.2 SOD純化

經(jīng)鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)，粗酶液硫酸銨40% ～70%梯度鹽析沉淀含有SOD酶活，其它梯度未檢測(cè)出SOD酶活，因此選用40%～70%梯度鹽析，見表3。將沉淀用pH 7.8磷酸緩沖液溶解，進(jìn)行透析袋透析，超濾膜超濾除雜濃縮，濃縮液經(jīng)Sephadex -G100凝膠柱層析，結(jié)果見圖4。在整個(gè)洗脫過程出現(xiàn)4個(gè)蛋白質(zhì)峰，分別測(cè)定各試管酶活，SOD酶活存在于第二個(gè)蛋白質(zhì)峰（13～37管）內(nèi)，收集第二個(gè)蛋白質(zhì)峰內(nèi)酶液。20℃預(yù)冷5 h，冷凍干燥濃縮。

將濃縮酶液用DEAE-Sepharose FF柱洗脫，結(jié)果見圖5。在整個(gè)洗脫過程中出現(xiàn)3個(gè)蛋白質(zhì)峰，分別測(cè)定各管酶活，SOD酶活主要存在于第三個(gè)蛋白質(zhì)峰內(nèi)，說明DEAE瓊脂糖除去了一部分雜蛋白質(zhì)。將第三個(gè)峰（31～56管）收集到的酶液，20℃預(yù)冷5 h，冷凍干燥濃縮。

2.3 SDS-PAGE結(jié)果

將分離純化處理的酶液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖6。粗酶液經(jīng)過硫酸銨沉淀、透析袋透析、超濾膜超濾、Sephadex- G100凝膠柱和DEAE-Sepharose FF柱分離后的電泳得到了單一條帶，說明純化效果較好，根據(jù)相對(duì)遷移率相對(duì)分子質(zhì)量關(guān)系，可以計(jì)算出該SOD的相對(duì)分子質(zhì)量為39 290。

圖4　葡聚糖凝膠G-100洗脫結(jié)果Fig. 4　 Eluting result of Sephadex G -100 column chromatography

圖5　DEAE-瓊脂糖凝膠FF洗脫結(jié)果Fig. 5 Eluting result of DEAE -Sepharose FF column chromatography

表3　SOD純化結(jié)果Table 3 Result of isolation and purification

圖6　不同純化階段酶液SDS-PAGE結(jié)果Fig. 6 SDS-PAGE of SOD solution at different stages of purification

3　結(jié)語

通過富集培養(yǎng)的方法從牛奶等分離得到57株菌，其中乳酸菌17株，從中篩選得到一株產(chǎn)SOD酶活相對(duì)較高的乳酸菌SD006，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和16SrDNA基因序列分析，鑒定為L(zhǎng)actobacillus plantarum。培養(yǎng)液經(jīng)過硫酸銨沉淀、透析超濾、Sephadex-G100層析、DEAE-Sepharose FF離交柱色譜等步驟分離純化，經(jīng)SDS-PAGE得到單一條帶，說明純化效果較好，其純化后酶活達(dá)到37 959.2 U/g。

目前世界各國對(duì)SOD應(yīng)用的開發(fā)主要集中在醫(yī)藥領(lǐng)域，但隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)健康的觀念從傳統(tǒng)的藥物治療向食品保健方面轉(zhuǎn)化，SOD在食品上的應(yīng)用將越來越受人們的關(guān)注。但目前SOD食品種類還相對(duì)較少，尚不能滿足人們對(duì)SOD食品的需求。因此應(yīng)加強(qiáng)SOD在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究。近年微生物SOD成為研究熱點(diǎn)，但對(duì)產(chǎn)SOD乳酸菌的菌種選育研究相對(duì)較少，乳酸菌是一種人體益生菌，同時(shí)是一種重要的工業(yè)微生物，其用途廣泛，尤其是在食品領(lǐng)域，因此乳酸菌SOD菌種選育有利于SOD在食品領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)。

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Isolation，Identification and Enzyme Purification of a SOD High Producing Strain of Lactic Acid Bacteria

XING Deming2，3，LI Xinhua2，YUAN Shenliang1，3，WANG Xiaohui*1，3，CHI Naiyu1，3，ZHANG Qingfang1，3
（1. College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622，China；2. College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；3. Liaoning Technology of Marine Microbiological Engineering Research Center，Dalian 116622，China）

Abstract：One SOD high-producing strain was screened and identified from lactic acid bacteria. The SOD enzyme was purified. The microbial enrichment，Gram staining and Pyrogallol autoxidation determination method were used in the screening. Morphological characteristics，physiology and biochemistry experiments，16S-rDNA sequencing were used for the strain identification. The SOD enzyme was purified by ammonium sulfate precipitation，ultrafiltration，sephadex-G100，DEAE-Sepharose FF etc. A SOD high-producing strain（SD006）was obtained and identified as Lactobacillus plantrum. The activity of purified enzyme reached 37 959.2 U/g SD006 is a SOD high-producing probiotics strain of Lactobacillus plantrum. The SOD purified from Lactobacillus is valuable and can be developed and applied in the food industry.

Keywords：Lactobacillus，SOD，identification，purification

*通信作者：王曉輝（1981—），女，遼寧大連人，工學(xué)博士，講師，主要從事微生物與酶工程方面的研究。E-mail：wangxiaohui@dlu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA021306）。

收稿日期：2014-05-05

中圖分類號(hào)：Q 939.99

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）02—0156—06