高桂玲，　楊雪薇，　成家楊（北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源院，廣東深圳518055）

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氨氮質(zhì)量濃度和溫度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)特性的影響

高桂玲，楊雪薇，成家楊*
（北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源院，廣東深圳518055）

摘要：研究了不同氨氮（氯化銨）濃度（0.05～0.8 g/L）和生長(zhǎng)溫度（22、25、28℃）對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)特性的影響，以及不同脅迫溫度（30、35、38℃）對(duì)蝦青素積累的影響。測(cè)定了不同培養(yǎng)條件下雨生紅球藻的OD值、干重、葉綠素以及蝦青素含量。研究結(jié)果表明：以氯化銨為氮源的條件下，雨生紅球藻更適宜在低氨氮濃度下生長(zhǎng)，適宜的氨氮質(zhì)量濃度是0.1 g/L，最適生長(zhǎng)溫度為22℃，以高溫脅迫時(shí)，最佳脅迫溫度為35℃。

關(guān)鍵詞：氨氮；溫度；雨生紅球藻

蝦青素（Astaxanthin）又稱“蝦黃素”，是一種從蝦蟹外殼、牡蠣、鮭魚(yú)及藻類、真菌中發(fā)現(xiàn)的紅色非維生素A源的酮類胡蘿卜素[1]，具有極強(qiáng)的抗氧化性，在清除自由基、預(yù)防癌癥、調(diào)節(jié)免疫活性等方面有其獨(dú)特的作用與用途，蝦青素還具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可用于水產(chǎn)動(dòng)物及家禽、家畜的養(yǎng)殖，提高產(chǎn)品質(zhì)量。目前蝦青素的銷售額已達(dá)數(shù)億美元，工業(yè)用蝦青素每公斤售價(jià)2 500美元，市場(chǎng)前景十分廣闊。雨生紅球藻是一種淡水的單細(xì)胞綠藻，該藻中蝦青素的含量最高可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的2%～4%，被公認(rèn)為自然界中天然蝦青素含量最高的生物，是用來(lái)獲取天然蝦青素的理想材料[2]。

影響微藻生長(zhǎng)的一個(gè)重要限制因子——氮，是合成藻體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素的基本元素[3]，它的濃度最終會(huì)影響微藻的生物量[4]。研究表明，等還原態(tài)氮是浮游植物優(yōu)先利用的氮形式，因?yàn)槔眠@些形式的氮消耗的能量更少，而等氧化態(tài)氮需要先在酶的作用下轉(zhuǎn)化成還原態(tài)的氮才能被利用。因此在以作為氮源時(shí)，藻有更多的能量用于生長(zhǎng)[5-6]，浮游植物利用無(wú)機(jī)氮的能力是氨氮＞硝態(tài)氮＞亞硝態(tài)氮[7]。不同報(bào)道的適宜的氮質(zhì)量濃度的差異較大。Morosa[8]報(bào)道，24.7 mg/L的氮質(zhì)量濃度適合雨生紅球藻34/7生長(zhǎng)；陸開(kāi)形等[9]報(bào)道，100 mg/L氮濃度適合雨生紅球藻生長(zhǎng)（武漢水生所淡水藻種庫(kù)）；張京浦等[10]研究雨生紅球藻光合放氧速率確定適合其生長(zhǎng)的氮質(zhì)量濃度為70mg/L。

溫度對(duì)雨生紅球藻的生長(zhǎng)和蝦青素的累積有很大影響，Harker等[11]與Borowizka等[12]認(rèn)為雨生紅球藻的最適生長(zhǎng)溫度約為24～28℃；Lu等[13]認(rèn)為雨生紅球藻的最適生長(zhǎng)溫度為24～28℃，當(dāng)環(huán)境溫度高于28℃則其生長(zhǎng)受到抑制。Ding等[14]認(rèn)為H.lacttstris的生長(zhǎng)溫度范圍為21～27℃，最適溫度為25℃；但是，對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行高溫脅迫的溫度卻鮮有報(bào)道。

尋找紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素累積的最適條件，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素合成的有關(guān)調(diào)控，縮短培養(yǎng)時(shí)間和提高產(chǎn)量，仍是當(dāng)今研究的重點(diǎn)，也是技術(shù)的關(guān)鍵.

作者就氨氮質(zhì)量濃度、生長(zhǎng)溫度及脅迫溫度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)及蝦青素產(chǎn)量的影響進(jìn)行研究，旨在探究雨生紅球藻對(duì)氨氮的利用情況，為雨生紅球藻的大規(guī)模商業(yè)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1藻種

實(shí)驗(yàn)所用雨生紅球藻H5Heamatococcus lacustris：藻種由武漢水生所提供。

1.2所用藥品及儀器

硝酸鈉（分析純），氯化銨（分析純），無(wú)水乙醇，二甲基亞砜，鹽酸；紫外分光光度計(jì)UV-1800：北京佳源興業(yè)科技有限公司；離心機(jī)5810R：深圳市萬(wàn)千科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS-12）：上海一恆科學(xué)儀器有限公司；隔膜真空泵GM-0.5B：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；智能型人工氣候箱MGC-450HP-2：上海一恆科學(xué)儀器有限公司；Clever Chem 200全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀GRS-10705-01-B：深圳朗誠(chéng)實(shí)業(yè)有限公司。

1.3微藻培養(yǎng)

培養(yǎng)基選用BG-11，所用試驗(yàn)器皿先經(jīng)浸泡、高壓滅菌、冷卻后使用。試驗(yàn)操作均在超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下進(jìn)行。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的海洋微藻按10%接種于250 mL三角瓶中，置于植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度約1 500 lx、培養(yǎng)溫度分別為25、28℃，每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)平行。另外，每個(gè)溫度下都分別設(shè)0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L氯化銨的質(zhì)量濃度梯度，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)6個(gè)平行。光暗比為12 h光照：12 h黑暗。每天搖動(dòng)三角瓶3次，以防止藻細(xì)胞附壁沉淀。每種海洋微藻重復(fù)培養(yǎng)3次。每個(gè)培養(yǎng)溫度下各個(gè)濃度分別設(shè)脅迫溫度31、35、38℃。

1.4 OD值與生物量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

預(yù)培養(yǎng)微藻3～5 L，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將其離心收獲，用蒸餾水洗滌兩次，把待測(cè)藻液分為6份，每份約300 mL左右，分別加入蒸餾水或者離心濃縮得不同濃度，測(cè)量每份藻液的吸光度OD值（A）。從各濃度梯度中取100～400 mL藻液（v），用玻璃砂芯真空抽濾，濾膜為Whatman玻璃纖維濾膜（GF/C Cat No.1822-47），孔徑1.2 μm。抽濾前對(duì)濾膜進(jìn)行稱質(zhì)量m1，抽濾后將濾膜移至烘箱，65℃烘干12 h至恒質(zhì)量，再次稱質(zhì)量m2。用（m2-m1）/v得到吸光度為A時(shí)每升微藻的干質(zhì)量m。根據(jù)各梯度濃度的A與對(duì)應(yīng)的m值，利用excel軟件繪制OD-干質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5藻液葉綠素a的測(cè)定--超聲輔助熱乙醇提取法測(cè)定葉綠素a

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的銅綠微囊藻藻液10 mL過(guò)0.45 μm的混合纖維素膜，將帶藻細(xì)胞的膜冷凍過(guò)夜，取出后迅速用8 mL熱乙醇（80℃）于熱水?。?0℃）中萃取2 min，將萃取液超聲破碎5～20 min后，于暗處?kù)o置2～6 h，4℃、5 000 r/min離心5 min，取上清液3.5 mL置于比色皿中，于665 nm和750 nm處測(cè)吸光值，然后滴加200 μL的1 mol/L鹽酸酸化，5 min后于波長(zhǎng)665 nm和750 nm處再測(cè)吸光值[15]。

根據(jù)Lorenzen公式計(jì)算單位樣品中葉綠素a質(zhì)量濃度：

其中，A為不同萃取溶劑中葉綠素a的比吸光系數(shù)；K為常數(shù)，為純?nèi)~綠素a酸化前的光密度與酸化前后的光密度變化的比值；υ為提取液體積（mL）；V為樣品的體積（L）；L為比色杯光程長(zhǎng)度（cm）；D665b為加酸前665nm波長(zhǎng)處OD值；D750b為加酸前750 nm波長(zhǎng)處OD值；D665a為加酸后665 nm波長(zhǎng)處OD值；D750a為加酸后750 nm波長(zhǎng)處OD值。

采用熱乙醇為萃取溶劑，A為11.5，K為2.43，比色皿光程為1 cm，則公式（1）可簡(jiǎn)化為：

葉綠素a（μg/L）=27.9（E665b-E665a）υ/V

1.6蝦青素的測(cè)定

移取5 mL孢子態(tài)的藻體，5 000 r/min離心10 min，除上清液，收集藻體。加入1 mL甲醇/KOH溶液（30%甲醇和5%KOH混合液）振蕩，使藻種均勻分散后置65℃恒溫水浴中加熱15 min，4 000 r/min離心15 min，除上清液；沉淀加蒸餾水離心洗滌2次，去除殘留堿液。上述藻體，加入5 mL二甲基亞砜，200 W超聲波破碎10 min，40℃振蕩提取20 min，離心收集上清液，沉渣加入二甲基亞砜重復(fù)提取，直至藻體沉淀變白，取紅色上清液測(cè)OD490[16]。

蝦青素含量：c=4.5×A490×Va/Vb

其中：c為蝦青素質(zhì)量濃度（mg/L）；A490為上清液在490 nm吸光值；Va為提取液體積（mL）；Vb為藻液體積（mL）。

每隔5天取2 mL藻體液于離心管，4 000 r/min離心3 min，取上清液，采用Clever Chem200全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀進(jìn)行測(cè)定，以蒸餾水為標(biāo)準(zhǔn)。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用EXCEL 2000和SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式表示，顯著水平為0.05。

2　結(jié)果與討論

2.1不同溫度、氨氮質(zhì)量濃度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響

通過(guò)研究雨生紅球藻的生長(zhǎng)OD值與干質(zhì)量之間的線性關(guān)系，可為量化評(píng)估生物量提供計(jì)算依據(jù)。如圖1所示，雨生紅球藻生長(zhǎng)OD值與其干質(zhì)量之間的關(guān)系，可用線性方程y=0.996 0x+0.292 7來(lái)表征，其中y表征干重（g/L），x表征藻液在680 nm處吸光度，R2值為0.999 4，線性擬合度較好。以下研究中所涉及的生物量均通過(guò)測(cè)定OD值并進(jìn)行線性擬合所得。

圖1　OD值與細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of OD and dry cell weight

如圖2所示，a、b、c分別表示在22、25、28℃下各氨氮質(zhì)量濃度組的生長(zhǎng)曲線，經(jīng)過(guò)11 d的培養(yǎng)，各組生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05）。22℃下最高生物量在0.65～3.51 g/L范圍內(nèi)，25℃下最高生物量在0.84～2.41 g/L范圍內(nèi)，28℃下最高生物量在0.89～1.13 g/L范圍內(nèi)。雨生紅球藻在低溫下較高溫下生長(zhǎng)要好，表現(xiàn)為生物量較高，且在25℃與28℃下均出現(xiàn)藻體發(fā)白的現(xiàn)象。22℃下最高生物量是28℃時(shí)最高生物量的3.95倍。由此說(shuō)明雨生紅球藻的最適生長(zhǎng)溫度為22℃，這與Ding等[17]的報(bào)道相一致。

氨氮質(zhì)量濃度對(duì)雨生紅球藻生物量的影響也不同。0氮組在培養(yǎng)第3天開(kāi)始變紅，OD值開(kāi)始下降，說(shuō)明缺氮已經(jīng)影響了藻體正常生長(zhǎng)。其他各組變化趨勢(shì)一致，其中，0.1組干質(zhì)量明顯高于其他組（P＜0.05）。另一方面，在0.05～0.1 g/L范圍內(nèi)，藻體干質(zhì)量隨著氨氮質(zhì)量濃度升高而升高，且對(duì)數(shù)期隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高略有提前，而在0.2～0.8 g/L范圍內(nèi)隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高干質(zhì)量反而遞減，并且培養(yǎng)液顏色隨時(shí)間推移開(kāi)始變淡，甚至出現(xiàn)白色，說(shuō)明雨生紅球藻開(kāi)始死亡。這可能是由于高質(zhì)量濃度的氨氮抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)或?qū)ζ洚a(chǎn)生了毒副作用，從而導(dǎo)致雨生紅球藻的死亡。因此，雨生紅球藻對(duì)氯化銨的耐受質(zhì)量濃度為0.4 g/L（氨氮質(zhì)量濃度141 mg/L），當(dāng)氨氮質(zhì)量濃度高于此值時(shí)，雨生紅球藻不能較好地生長(zhǎng)，這與李博等[18]研究氨氮對(duì)鈍頂螺旋藻生長(zhǎng)影響的結(jié)果一致。有研究表明，高質(zhì)量濃度的對(duì)浮游植物有毒害作用，當(dāng)環(huán)境中的質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，浮游植物的生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制[19]。對(duì)照組中，在完全無(wú)氮條件下，藻細(xì)胞仍表現(xiàn)有微弱生長(zhǎng)，表明藻細(xì)胞自身有一定的氮儲(chǔ)備功能，當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境中氮素匱乏時(shí)，細(xì)胞將儲(chǔ)備的氮釋放并利用。

圖2　不同溫度、不同氨氮質(zhì)量濃度下細(xì)胞生長(zhǎng)情況Fig. 2 Cell growth condition under different temperature and-N concentration

2.2不同溫度、氨氮質(zhì)量濃度對(duì)雨生紅球藻葉綠素產(chǎn)生的影響

如圖3，a、b、c分別表示在22、25、28℃下各氮質(zhì)量濃度組葉綠素a的變化圖?？梢钥闯?，在對(duì)數(shù)期（即培養(yǎng)第5天）葉綠素a質(zhì)量濃度均達(dá)到最大值。22℃下各個(gè)質(zhì)量濃度組（除0組）最高值差別不大（P＞0.05），最高葉綠素a質(zhì)量濃度可達(dá)1 059.3 μg/L，25℃下最高葉綠素a質(zhì)量濃度可達(dá)435 μg/L，28℃條件下最高葉綠素a質(zhì)量濃度可達(dá)303 μg/L。

圖3　不同溫度、不同氨氮質(zhì)量濃度下細(xì)胞中葉綠素a質(zhì)量濃度的變化Fig. 3　 Chlorophyll a content change under different temperature and-N concentration

在22℃下，在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.05～0.1g/L），葉綠素a質(zhì)量濃度隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高而增加，在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.1～0.8 g/L），葉綠素a質(zhì)量濃度隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高而減小，對(duì)數(shù)期之后葉綠素a質(zhì)量濃度開(kāi)始減少，在此溫度下較適宜的氨氮質(zhì)量濃度是0.1 g/L，此時(shí)的生物量和葉綠素a質(zhì)量濃度均為最高。在25℃和28℃培養(yǎng)條件下，葉綠素a的變化趨勢(shì)是一致的，即在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.05～0.2 g/L），葉綠素a質(zhì)量濃度隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高而增加，在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.2～0.8 g/L），葉綠素a質(zhì)量濃度隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高而減小。且葉綠素a質(zhì)量濃度最高值均出現(xiàn)在對(duì)數(shù)期，即培養(yǎng)第5天左右，對(duì)數(shù)期之后葉綠素a的質(zhì)量濃度均開(kāi)始下降。對(duì)于氨氮為0.4 g/L和0.8 g/L組，由于藻體出現(xiàn)發(fā)白現(xiàn)象，所以葉綠素a均降至很小甚至是0，而在22℃條件下各組均未出現(xiàn)藻體發(fā)白現(xiàn)象，說(shuō)明在低溫條件下高質(zhì)量濃度氨氮對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的毒害作用不明顯。而且低質(zhì)量濃度氨氮有利于促進(jìn)葉綠素a的合成，而高質(zhì)量濃度氨氮卻抑制了葉綠素a的合成，這是由于高質(zhì)量濃度氨氮對(duì)藻細(xì)胞的毒害作用，使光合作用受到影響所致。

綜合圖3可知，雨生紅球藻較宜在低質(zhì)量濃度氨氮下生長(zhǎng)，高質(zhì)量濃度氨氮不僅會(huì)影響藻體生長(zhǎng)，甚至?xí)a(chǎn)生毒害作用而使藻細(xì)胞死亡，另一方面雨生紅球藻在低溫下生長(zhǎng)較高溫好，且最適宜的生長(zhǎng)溫度為22℃，在此溫度下最適宜的氨氮質(zhì)量濃度為0.1 g/L，比25℃時(shí)最適宜的0.2 g/L所需氨氮少，這為以后定向供給氮源提供依據(jù)。并且在低溫下生長(zhǎng)的最高葉綠素a質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于高溫條件下的最大葉綠素a質(zhì)量濃度，分別為25℃和28℃的2.5倍和3.2倍。說(shuō)明溫度過(guò)高同樣會(huì)抑制藻細(xì)胞的光合作用，從而影響生物量及葉綠素a質(zhì)量濃度。

2.3不同溫度、氨氮質(zhì)量濃度對(duì)蝦青素產(chǎn)生的影響

如圖4所示，a、b、c分別表示在三種（22、25、28℃）生長(zhǎng)溫度下，各個(gè)脅迫溫度對(duì)蝦青素積累產(chǎn)生的影響。在22℃條件下，由a可以看出，3種脅迫溫度（30、35、38℃）下均有蝦青素產(chǎn)生，蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在3.134～25.327 mg/g，35℃脅迫溫度較適宜蝦青素積累，最高蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)2.53%（干質(zhì)量）。在25℃和28℃條件下，由b、c可以看出，30℃脅迫下各組均有蝦青素積累，但蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差別較大（P＜0.05），35℃和38℃脅迫條件下，只有0.2 g/L組有蝦青素產(chǎn)生，其余組藻體均死亡、變白、沉淀，沒(méi)有變紅。另外，25℃培養(yǎng)溫度下各組蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)都明顯高于28℃（P＜0.05）。

圖4　不同生長(zhǎng)溫度、不同氨氮質(zhì)量濃度下蝦青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 4　 Astaxathin content under different growthtemperature and-N concentration

22℃生長(zhǎng)條件下，各組蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)規(guī)律一致，即在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.05～0.1 g/L），蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高而增加。在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.1～0.8 g/L），蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高而減小。0.4和0.8組雖然在22℃條件下生物量較高，但在脅迫階段出現(xiàn)藻體死亡現(xiàn)象，也就是說(shuō)，在低溫生長(zhǎng)條件下，高氨氮對(duì)藻體抑制作用可以得到緩解，但在高溫條件下，這種抑制作用明顯，不僅抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)，即OD值下降，藻體變黃沉淀，還抑制了蝦青素的積累，表現(xiàn)為蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高，說(shuō)明在22℃下，最佳脅迫溫度為35℃。

25℃和28℃生長(zhǎng)溫度下，30℃脅迫時(shí)，在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.05～0.2 g/L），蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高而增加，但差別不大（P＞0.05）。在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.2～0.8 g/L），蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高而減小，差別相對(duì)較大。

22℃生長(zhǎng)條件下35℃脅迫，0.1組最高蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 mg/g，是25℃生長(zhǎng)條件下30℃脅迫0.2組的4倍，是28℃生長(zhǎng)條件下30℃脅迫0.2組的8倍。

2.4雨生紅球藻在不同溫度下對(duì)不同質(zhì)量濃度氨氮的利用情況

如表1所示，A、B、C分別表示在22、25、28℃下各組對(duì)銨根離子的消耗情況。在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.05～0.1 g/L），隨著銨根離子質(zhì)量濃度的升高，指數(shù)末期銨根離子的消耗率隨之升高，在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.1～0.8 g/L），隨著銨根離子質(zhì)量濃度的升高，指數(shù)末期銨根離子的消耗率隨之降低，到最終實(shí)驗(yàn)結(jié)束各脅迫溫度（30、35、38℃）組均變紅，且最終銨根離子消耗率均大于90%。說(shuō)明雨生紅球藻細(xì)胞利用銨根離子主要在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，消耗了大多數(shù)銨根離子（80%～87%），而在高溫脅迫階段，雖然藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制但仍消耗銨根離子，說(shuō)明蝦青素積累階段仍需要氮源。

在指數(shù)期末期，各組銨根離子消耗情況，低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.05～0.2 g/L），隨著銨根離子質(zhì)量濃度的升高，指數(shù)末期銨根離子的消耗率隨之升高，在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.2～0.8 g/L），隨著銨根離子質(zhì)量濃度的升高，指數(shù)末期銨根離子的消耗率隨之降低，但利用率明顯低于同期的22℃，說(shuō)明高溫下細(xì)胞生長(zhǎng)受到影響的同時(shí)吸收銨根離子也受到影響。在脅迫階段，30℃和38℃脅迫溫度下藻體細(xì)胞變白，細(xì)胞死亡，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，離子檢測(cè)結(jié)果顯示銨根離子利用率未有較大變化。而對(duì)于30℃脅迫條件下，藻細(xì)胞最終變紅，積累蝦青素，且銨根離子利用率均在90%以上。

表1　不同培養(yǎng)溫度下雨生紅球藻對(duì)消耗情況Table 1 Consumption of ammonia nitrogen by Heamatococcus lacustris at different temperatures

表1　不同培養(yǎng)溫度下雨生紅球藻對(duì)消耗情況Table 1 Consumption of ammonia nitrogen by Heamatococcus lacustris at different temperatures

注：初始質(zhì)量濃度（mg/L）表示初始時(shí)培養(yǎng)基中氮質(zhì)量濃度（mg/L）；指數(shù)末期（mg/L）表示對(duì)數(shù)末期時(shí)培養(yǎng)基中氮質(zhì)量濃度（mg/L）；消耗率（%）表示到對(duì)數(shù)末期時(shí)微藻消耗初始氮的百分率（%）；變紅-30℃（mg/L）表示在最佳脅迫溫度30℃下微藻變紅時(shí)培養(yǎng)基中剩余的氮質(zhì)量濃度（mg/L）；利用率（%）表示到變紅為止微藻消耗初始氮的百分率（%）。

初始質(zhì)量濃度/（mg/L)　指數(shù)末期/（mg/L)　消耗率/%　變紅-30℃/（mg/L)　　利用率/% 0.945±0.115　0.115±0.011　87.801　0.065±0.002　93.121 0.05　20.727±0.451　3.517±0.125　83.032　0.366±0.015　98.232 0.1　46.454±0.811　6.457±0.112　86.109　1.092±0.112　97.653 0.2　95.908±0.546　13.812±0.534　85.604　1.822±0.091　98.104 0.4　196.816±0.877　 30.281±0.665　84.613　2.871±0.128　98.535 0.8　396.631±0.877　 78.929±1.004　80.102　10.093±0.144　97.466 0 A 1.118±0.098　0.155±0.101　86.121　0.097±0.005　91.302 0.05　21.447±0.182　3.969±0.202　81.523　0.622±0.112　97.117 0.1　45.012±0.334　7.517±0.441　83.331　0.945±0.098　97.901 0.2　92.213±0.119　13.926±0.778　84.908　1.844±0.579　98.071 0.4　187.991±0.998　 37.415±0.587　80.102　4.512±1.001　97.616 0.8　365.584±1.132　 91.395±0.997　75.117　11.395±0.164　96.911 0 B 1.918±0.058　0.456±0.071　76.212　0.148±0.005　92.301 0.05　23.457±0.082　5.184±0.052　77.971　3.026±0.212　87.117 0.1　48.022±0.234　10.133±0.151　78.991　5.816±0.198　87.901 0.2　96.213±0.319　33.770±0.478　64.971　21.167±0.479　78.001 0.4　177.994±0.398　 88.820±0.287　50.102　57.677±0.601　67.621 0.8　345.784±0.132　 189.838±0.197　45.141　149.381±0.264　56.917 0 C

28℃培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，尤其是0.4和0.8組，藻細(xì)胞出現(xiàn)發(fā)黃變白的現(xiàn)象，至第5天，銨根離子利用率只有50%，在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的最高利用率也只有78%，明顯低于22℃和25℃，在35℃和38℃脅迫溫度下藻體最終均變白，沒(méi)有蝦青素積累，說(shuō)明高溫已經(jīng)使藻細(xì)胞死亡。而在30℃脅迫條件下，0.4和0.8組由于受到高氨氮的毒害作用，藻細(xì)胞生長(zhǎng)也受到影響，不能有效利用銨根離子，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，兩組仍有銨根離子剩余。

3　結(jié)語(yǔ)

雨生紅球藻細(xì)胞在環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)由綠色游動(dòng)細(xì)胞變?yōu)榧t色不動(dòng)細(xì)胞，并開(kāi)始積累蝦青素，藻細(xì)胞會(huì)有這些變化由于在逆境脅迫條件下，細(xì)胞的一些基因表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致正常基因表達(dá)受到抑制，加強(qiáng)或者誘導(dǎo)一些特異基因的表達(dá)，表現(xiàn)為對(duì)不利環(huán)境的抗逆反應(yīng)。

作者以氯化銨為氮源，研究了不同氨氮質(zhì)量濃度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：對(duì)于雨生紅球藻H5（Heamatococcus lacustris），最適宜的生長(zhǎng)條件為光照強(qiáng)度1 500 lx、pH 8，溫度22℃，且低氨氮質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)較高氨氮質(zhì)量濃度好，適宜的氨氮質(zhì)量濃度是0.1 g/L，最大干重為3.51 mg/mL。以高溫脅迫時(shí)，溫度過(guò)高（38℃）導(dǎo)致藻體死亡，最佳脅迫溫度為35℃，蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為2.5%（干質(zhì)量）。

雨生紅球藻對(duì)氨氮質(zhì)量濃度有一個(gè)耐受值，本研究結(jié)果顯示耐受質(zhì)量濃度為0.2 g/L，在這個(gè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好，超過(guò)這個(gè)質(zhì)量濃度，藻細(xì)胞積累過(guò)多而產(chǎn)生單鹽毒害作用，生長(zhǎng)受到抑制甚至導(dǎo)致死亡。研究[20]表明，高氯能抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，在高氮條件下，過(guò)氧化物酶POD活性下降，而POD活性與生長(zhǎng)素的含量有關(guān)，從而進(jìn)一步影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)，反映在生物量的下降。對(duì)照組0氮脅迫組結(jié)果說(shuō)明，在完全無(wú)氮條件下，藻細(xì)胞仍表現(xiàn)有微弱生長(zhǎng)，表明藻細(xì)胞自身有一定的氮儲(chǔ)備功能，當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境中氮素匱乏時(shí)，細(xì)胞將儲(chǔ)備的氮釋放并利用。但只能維持很短的時(shí)間，之后藻細(xì)胞便不能正常生長(zhǎng)甚至死亡。

溫度是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的另一個(gè)重要因素。就光合作用來(lái)說(shuō)，高溫抑制卡爾文循環(huán)的活性，阻礙同化產(chǎn)物代謝[21]，更容易影響光合電子傳遞[22]。雨生紅球藻最合適的生長(zhǎng)溫度為22℃，此結(jié)果與Lu等[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。溫度對(duì)蝦青素的積累也有影響，脅迫溫度為30℃時(shí)蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，脅迫溫度為35℃和38℃時(shí)，大部分藻體死亡。說(shuō)明藻細(xì)胞有一定的耐受溫度，雖然蝦青素的積累可以在高溫條件下產(chǎn)生，但是過(guò)高溫度會(huì)破壞藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

這些工作為以后的實(shí)驗(yàn)提供了經(jīng)驗(yàn)，便于后期實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，為實(shí)現(xiàn)雨生紅球藻的大規(guī)模培養(yǎng)及工業(yè)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。作者所在實(shí)驗(yàn)室將繼續(xù)針對(duì)影響雨生紅球藻生長(zhǎng)及蝦青素積累的其他因素及影響機(jī)理進(jìn)行深入的探究。

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Effects of Ammonia Concentrations and Temperatures on Heamatococcus lacustris Growth

GAO Guiling，YANG Xuewei，CHENG Jiayang*
（Institute of Environment and Energy，Peking University Shenzhen Graduate School，Shenzhen 518055，China）

Abstract：The effects on the growth characteristics of Heamatococcus lacustris of different ammonia concentrations（0.05～0.8 g/L）and different growth temperatures（22、25、28℃）and the effects of stress temperatures（30，35，38℃）on the astaxathin accumulation were studied in this paper. The main parameters OD，dry weight，chlorophyll a and astaxathin content were determined. The results show that Heamatococcus lacustris grows relatively better under lower concentration of ammonia nitrogen when using NH4Cl as nitrogen source. Its suitable growth conditions are as follows：temperature：22℃、NH4Cl：0.1 g/L，whereas the suitable stress temperature is 35℃.

Keywords：ammonia nitrogen，temperature，Heamatococcus lacustris

*通信作者：成家楊（1962—），江西都昌人，工學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境工程方面的研究。E-mail：chengjy@pkusz.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(81130070)；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2012M520106）；國(guó)家博士后特別資助項(xiàng)目（2013T60025）；深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CXZZ20120618111150009）。

收稿日期：2014-03-02

中圖分類號(hào)：Q 93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）02—0136—08