烏日娜，　王茜茜，　唐筱揚(yáng)，　張　穎，　鄒婷婷，　武俊瑞*（.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽0866；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫2422）

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植物乳桿菌L. plantarum FS5-5在鹽脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)

烏日娜1，2，王茜茜1，唐筱揚(yáng)1，張穎1，鄒婷婷1，武俊瑞*1
（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

摘要：L. plantarum FS5-5是一株篩選自東北傳統(tǒng)發(fā)酵大醬、具有耐鹽特性的植物乳桿菌。該研究利用蛋白組學(xué)雙向電泳技術(shù)，比較了其在NaCl質(zhì)量濃度分別為0、3 g/dL的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的蛋白組學(xué)表達(dá)差異情況。結(jié)果表明，有16個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生了明顯的變化，經(jīng)過基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定，其中有12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定出來，包括10個(gè)表達(dá)增強(qiáng)的蛋白質(zhì)，分別為UDP-N-乙酰氨基葡萄糖二磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、半胱氨酸氨基肽酶、UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸連接酶、前噬菌體蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（鐵硫聚類組裝蛋白）、膽鹽水解酶、谷氨酰胺合成酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、Xaa-蛋白二肽酶；還有2個(gè)表達(dá)減弱的蛋白質(zhì)，分別為腺苷酸琥珀酸合成酶，丙酮酸激酶。鹽脅迫可誘導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)生復(fù)雜的鹽應(yīng)激反應(yīng)，涉及不同的代謝調(diào)控途徑。

關(guān)鍵詞：L. plantarum FS5-5；蛋白質(zhì)組；鹽脅迫

植物乳桿菌是乳酸桿菌的一種，不產(chǎn)芽孢，兼性厭氧，最適pH 6.5左右，最適溫度為37℃，是一種公認(rèn)的益生菌[1]。它具有諸多生理功能，包括改善胃腸道功能[2]、抗腫瘤[3]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[4]、降低膽固醇[5]、維持泌尿系統(tǒng)菌群平衡[6]等作用，是一種常見的益生菌[7]。L.plantarum WCFS1[8]作為植物乳桿菌的模式菌株被測(cè)定出全基因組序列以來，對(duì)人們?cè)诜肿由飳W(xué)水平上研究植物乳桿菌耐受環(huán)境的性能方面提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

植物乳桿菌在含有鹽的環(huán)境下可以生存，并且可以耐受高的滲透壓，基于植物乳桿菌的這種優(yōu)點(diǎn)，植物乳桿菌在人類的生產(chǎn)活動(dòng)中應(yīng)用廣泛。在食品工業(yè)中，植物乳桿菌主要應(yīng)用于發(fā)酵傳統(tǒng)大醬[9]、腌制酸菜、泡菜、發(fā)酵肉制品、生產(chǎn)果蔬汁飲料[10]等。同時(shí)，植物乳桿菌還可以用于生產(chǎn)生物性防腐劑[11]，作為飼料的添加劑[12]，生產(chǎn)青貯飼料[13]等領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組（proteome）是一個(gè)基因組所表達(dá)的全套的蛋白質(zhì)[14]，是后基因組研究的主要方式，其中雙向電泳技術(shù)（Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）是蛋白組學(xué)研究中的核心技術(shù)[15]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究植物乳桿菌對(duì)鹽環(huán)境的適應(yīng)機(jī)理是一種非常有效的方法。

作者以東北傳統(tǒng)大醬中篩選出的耐鹽的植物乳桿菌L. plantarum FS5-5[16]為研究對(duì)象，利用雙向電泳技術(shù)，構(gòu)建了該菌株在0、3 g/dL的鹽質(zhì)量濃度下，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的菌體總蛋白質(zhì)的差異表達(dá)雙向凝膠電泳圖譜。掃描后，利用軟件Image 6.0對(duì)圖譜進(jìn)行了分析，找出與耐鹽相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，然后通過MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，并利用生物信息學(xué)對(duì)其功能進(jìn)行了分析，確定蛋白質(zhì)的種類及功能。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌種耐鹽植物乳桿菌L. plantarum FS5-5，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院從東北傳統(tǒng)大醬中分離得到。

1.1.2改良的MRS培養(yǎng)基（g/L）牛肉浸膏8；蛋白胨10；酵母粉4；無水乙酸鈉5；葡萄糖20；吐溫1；磷酸氫二鉀2；七水硫酸鎂0.58；檸檬酸鈉2；四水硫酸錳0.25。

1.1.3試劑MES、MOPS：北京Coolaber公司；Urea、Thisurea、DTT、CHAPS、Iodoacetamide、

Ammonium bicarbonate、考馬斯亮藍(lán)G250、R250、IPG（Immobilized pH gradient）干膠條（18 cm、pI 3～10）：美國(guó)Bio-rad公司；Tris、SDS、TEMED、丙烯酸胺、N，N' -亞甲基雙丙烯酰胺、AgNO3、Trichloroacetic acid：美國(guó)Sigma公司；APS、Acetone、EDTA、Na2S2O3、Na2CO3、無水乙酸鈉、正丁醇：上海鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心；低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：美國(guó)Bio-rad公司。

1.2儀器與設(shè)備

等電聚焦儀，Ettan DALT Twelve system灌膠裝置，Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System，Hofer SE 600，UMax Powerlook 2110XL掃描儀，Image Master 6.0圖像分析系統(tǒng)：美國(guó)GE公司；TGL-168低溫高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1植物乳桿菌的培養(yǎng)將活化三代的L. plantarum FS5-5供試菌液以1 %的接種體積分?jǐn)?shù)分別接種到NaCl為0、3 g/dL的新鮮配置的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基用HCl調(diào)節(jié)pH到6.5，同時(shí)添加MOPS、MES緩沖劑。以每管5 mL的量分裝試管，于37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，每隔2小時(shí)進(jìn)行取樣，繪制L. plantarum FS5-5在不同鹽質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)曲線。

1.3.2蛋白質(zhì)樣品的提取與制備取100 μL菌體，加入600 μL 2D裂解液，超聲提取蛋白質(zhì)（80 W超聲10 s，停15 s，50個(gè)循環(huán)）直至液體澄清，15℃、1 4000 g，離心45 min，取上清液至15 mL離心管中，加入13 mL預(yù)冷的丙酮，沉淀過夜，4℃、7 187 g離心45 min，棄去丙酮，加入預(yù)冷的丙酮清洗兩次，棄去丙酮，待剩余丙酮揮發(fā)完全后加入250 μL 2D裂解液。使用Bio-Radford蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒定量，-80℃低溫保存。

1.3.3雙向凝膠電泳將菌體蛋白質(zhì)樣品100 μg加入溶脹液中，使總體積為350 μL。充分混勻后，將其加入到持膠槽中，并將IPG干膠條膠面向下放于樣品之上進(jìn)行溶脹。膠條溶漲后，進(jìn)行第一向等電聚焦。等電聚焦參數(shù)為：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 8 h，500 V 4 h。聚焦結(jié)束后，將膠條分別放入含有1 g/dL DTT的SDS平衡液和含有2.5 %濃度的碘乙酰胺SDS平衡緩沖液中，于搖床上平衡15 min。然后將膠條轉(zhuǎn)移至12.5 g/dL 的SDS聚丙烯酰胺凝膠（26 cm×20 cm）進(jìn)行電泳，至溴酚藍(lán)色帶距離膠下沿0.5 cm時(shí)停止電泳，取下凝膠采用銀染法進(jìn)行染色[17]。

1.3.4圖像分析及質(zhì)譜鑒定將染色后的凝膠置于Image Scanner上進(jìn)行掃描，掃描后，利用軟件Image 6.0圖像分析軟件對(duì)凝膠圖譜進(jìn)行分析。選取在相同條件下的兩塊平行膠構(gòu)建成一個(gè)參考膠，通過參考膠蛋白質(zhì)量的匹配和比較，對(duì)不同條件下的蛋白質(zhì)表達(dá)情況進(jìn)行分析，對(duì)相互之間能夠匹配上的點(diǎn)進(jìn)行位置和量的重復(fù)性分析，對(duì)相互之間不能匹配的點(diǎn)進(jìn)行差異表達(dá)量的分析[18]。

在凝膠上選取差異蛋白點(diǎn)，將差異蛋白點(diǎn)切下，經(jīng)胰酶消化處理后，通過MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)消化后的肽段進(jìn)行鑒定，并利用生物信息學(xué)對(duì)其功能進(jìn)行分析，確定蛋白質(zhì)的種類及功能。

2　結(jié)果與分析

2.1不同鹽質(zhì)量濃度下L. plantarum FS5-5的生長(zhǎng)

L. plantarum FS5-5在NaCl質(zhì)量濃度分別為0 g/dL和3 g/dL的改良的MRS培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)曲線見圖1。L. plantarum FS5-5在0 g/dL時(shí)4 h到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，在3 g/dL條件下6 h到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。緩沖劑的加入使L. plantarum FS5-5在進(jìn)入穩(wěn)定期前可維持初始pH在±0. 1～0. 3的范圍內(nèi)緩慢降低，可基本維持pH 6.5左右，進(jìn)入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)液的pH值才會(huì)顯著下降[18]。

圖1　植物乳桿菌L. plantarum FS5-5在不同NaCl質(zhì)量濃度條件下的生長(zhǎng)Fig. 1 Growth of L. plantarum FS5-5 cultured in MRS medium at different NaCl concentrations

2.2不同NaCl質(zhì)量濃度下L. plantarum FS5-5對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期蛋白組雙向電泳圖像分析

利用雙向電泳技術(shù)，構(gòu)建了L. plantarum FS5-5在不同NaCl質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)的2-DE圖譜，見圖2。通過軟件Image 6.0對(duì)2-DE圖像進(jìn)行分析，結(jié)果表明，3塊平行膠的匹配率均在90以上?？蓹z測(cè)到的斑點(diǎn)分別為1640±139（NaCl質(zhì)量濃度為0 g/dL），1730±140（NaCl質(zhì)量濃度為3 g/dL）。

圖2　L. plantarum FS5-5在不同NaCl質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的蛋白組雙向電泳表達(dá)圖譜Fig. 2　 2 -DE gels of the cytoplasmic proteins of L. plantarum FS5-5 exposed in MRS medium at different NaCl concentrations

2.3不同NaCl質(zhì)量濃度下L. plantarum FS5-5對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期蛋白組雙向電泳差異表達(dá)譜比較

經(jīng)過軟件Image 6.0軟件對(duì)2-DE圖譜的分析，以表達(dá)量增強(qiáng)（或下降）在1.5倍以上為標(biāo)準(zhǔn)，研究發(fā)現(xiàn)有16種蛋白質(zhì)在L. plantarum FS5-5對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的表達(dá)發(fā)生明顯變化，見表1。

表1　L. plantarum FS5-5在NaCl質(zhì)量濃度為0 g/dL和3 g/dL生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期的差異表達(dá)蛋白質(zhì)Table 1 Identification of L. plantarum FS5-5 different expression proteins affected by different NaCl concentrations of 0 g/dL and 3 g/dL

由表1可知，在不同鹽質(zhì)量濃度條件下培養(yǎng)的L. plantarum FS5-5的雙向電泳圖中有16個(gè)表達(dá)情況不同的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中有12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)通過MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定技術(shù)鑒定出對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，有4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)未鑒定出對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)。在這16個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)中，有10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)增強(qiáng)，包括UDP-N-乙酰氨基葡萄糖二磷酸化酶（點(diǎn)250）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（點(diǎn)177）、半胱氨酸氨基肽酶（點(diǎn)277）、UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸連接酶（點(diǎn)289）、前噬菌體蛋白（點(diǎn)1446）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，鐵硫聚類組裝蛋白（點(diǎn)241）、膽鹽水解酶（點(diǎn)617）、谷氨酰胺合成酶（點(diǎn)348）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（點(diǎn)266）、Xaa-蛋白二肽酶（點(diǎn)507）；有6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)減弱，包括已經(jīng)鑒定出的腺苷酸琥珀酸合成酶（點(diǎn)309）、丙酮酸激酶（點(diǎn)711）以及未鑒定出的4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)（點(diǎn)1294、點(diǎn)1608、點(diǎn)1237、點(diǎn)787）。

根據(jù)COG蛋白質(zhì)的功能分類，對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋[19]。其中，鑒定出的蛋白質(zhì)的功能主要包括糖代謝（點(diǎn)250、點(diǎn)177、點(diǎn)266），氨基酸代謝（點(diǎn)289、點(diǎn)348），核苷酸代謝（點(diǎn)309），脂類代謝（點(diǎn)617）和糖酵解（點(diǎn)711）。其中，3個(gè)與糖代謝相關(guān)的蛋白包括UDP-N-乙酰氨基葡萄糖二磷酸化酶（點(diǎn)250）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（點(diǎn)177）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（點(diǎn)266）；2個(gè)與氨基酸代謝相關(guān)的蛋白包括UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸連接酶（點(diǎn)289）、谷氨酰胺合成酶（點(diǎn)348）；1個(gè)與核苷酸代謝相關(guān)的蛋白為腺苷酸琥珀酸合成酶（點(diǎn)309）；1個(gè)與脂類代謝相關(guān)的蛋白為膽鹽水解酶（點(diǎn)617）；1個(gè)與糖酵解相關(guān)的蛋白為丙酮酸激酶（點(diǎn)711）。

3　結(jié)語

植物乳桿菌處于NaCl環(huán)境中，會(huì)誘導(dǎo)植物乳桿菌產(chǎn)生鹽應(yīng)激反應(yīng)來適應(yīng)所處的NaCl環(huán)境。從差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定情況來看，依據(jù)蛋白質(zhì)功能分類，鑒定出的蛋白質(zhì)大多屬于代謝相關(guān)的酶類，這也說明了這類蛋白質(zhì)在植物乳桿菌菌體的生長(zhǎng)過程中起到了非常重要的作用[20]。

在植物乳桿菌生長(zhǎng)過程中，糖代謝途徑的主要功能是提供能量。在NaCl質(zhì)量濃度為3 g/dL的環(huán)境下生長(zhǎng)的植物乳桿菌表達(dá)上調(diào)的10種蛋白質(zhì)中，有3種是與糖代謝相關(guān)的，其中有2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)增強(qiáng)在2.5倍以上。這也說明了乳酸菌在某些不利的環(huán)境下，需要消耗更多的能量來維持自身的生長(zhǎng)和代謝，所以糖代謝途徑中的一些酶類的表達(dá)可能會(huì)發(fā)生變化[20-21]。除了糖代謝途徑外，氨基酸代謝途徑、脂類代謝在植物乳桿菌適應(yīng)NaCl環(huán)境方面也起到了重要作用。其中，半胱氨酸氨基肽酶、谷氨酰胺合成酶、Xaa-蛋白二肽酶表達(dá)的上調(diào)也說明了在NaCl質(zhì)量濃度為3 g/dL的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)乳酸菌代謝中的氧化過程增多，乳酸菌氧化能力增強(qiáng)。

在鑒定出的蛋白質(zhì)中，UDP-N-乙酰氨基葡萄糖二磷酸化酶（點(diǎn)250）和UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸連接酶（點(diǎn)289）是與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖合成相關(guān)的酶。在NaCl質(zhì)量濃度為3 g/dL的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)均上調(diào)。Piuri等人相關(guān)的研究結(jié)果表明，如果在培養(yǎng)乳桿菌的培養(yǎng)基中增加與細(xì)胞膜相連的肽酶，可以增加其耐鹽性[22]。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的基本骨架，是抵抗不利環(huán)境因素的第一道防線，對(duì)植物乳桿菌適應(yīng)NaCl環(huán)境具有重要的生理功能[23]。

在本研究中，鑒定出的差異表達(dá)點(diǎn)還包括前噬菌體蛋白、膽鹽水解酶，它們?cè)谥参锶闂U菌耐受NaCl環(huán)境中所起的具體作用還需在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

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Proteomics Research on Salt Response of L. plantarum FS5-5 Grown at Different NaCl Concentrations Using Two-Dimensional Gel Electrophoresis

WU Rina1，2，WANG Qianqian1，TANG Xiaoyang1，ZHANG Ying1，ZOU Tingting1，WU Junrui*1
（1. College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；2. School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：L. plantarum FS5-5，isolated from traditional home-made fermented soybean in northeast of China，has been considered as a new salt tolerance bacterium. Proteomics research were carried out to identify proteins expression of L. plantarum FS5-5 grown at different NaCl concentrations of 0% and 3% in this study. Cytosolic proteins of mid-exponential phase were resolved and further analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. The results showed that sixteen protein spots were found with statistically significant differences.Twelve of total protein spots were identified asbook=124,ebook=17UDP-N-acetylglucosamine diphosphorylase，glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase，UDP-N-acetylmuramoylalanine-D-glutamate ligase，adenylosuccinate synthetase，cysteine aminopeptidase，prophage protein，pyruvate kinase，ABC transporter（iron-sulfur cluster assembly protein），bile salt hydrolase，glutamine synthetase，6-phosphogluconate dehydrogenase，Xaa-Pro dipeptidase using matrix-assisted laser desorption /ionization timeof-flight mass spectrometry（MALDI-TOF/MS），indicating the complex response of lactic acid bacteria to salt stress．

Keywords：L. plantarum FS5-5，proteomics，salt stress

*通信作者：武俊瑞（1977—），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。E-mail: junruiwu@126.com

作者簡(jiǎn)介：烏日娜（1979—），女，蒙古族，內(nèi)蒙古呼和浩特人，農(nóng)學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。E-mail: wrn6956@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31000805，31471713)；中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014M560395）；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)資助計(jì)劃（2014048）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才計(jì)劃（LJQ 2011071）；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)“天柱山英才支持計(jì)劃”；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目課題（L2012249）。

收稿日期：2014-09-16

中圖分類號(hào)：Q 51

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）02—0123—06