趙　娟，田　怡，李　凡

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·基礎醫(yī)學·

八聚體結合蛋白-4對胃癌細胞增殖和侵襲能力的影響

趙娟，田怡，李凡

[摘要]目的探討八聚體結合蛋白-4(octamer-bindingprotein-4，Oct 4)在胃癌(gastriccarcinoma)組織及其4株細胞系(MKN-28、SGC-7901、BGC-823和GES-1)中的表達，并分析其對細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。方法收集20例胃癌手術患者的癌變組織和20例正常組織，通過Real time PCR(RT-PCR)和Western blot法檢測Oct 4在胃癌組織及其4株細胞系中的表達水平。在干擾掉Oct 4后，采用MTT的方法檢測BGC-823細胞的增殖活性，通過Transwell小室法檢測BGC-832細胞的侵襲活性，利用Western blot法檢測MMP-2及MMP-9的表達。結果RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Oct 4 mRNA在胃癌組織中高表達，而在正常組織中低表達，Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)Oct 4在BGC-832表達水平最高。下調Oct 4的表達導致BGC-823細胞增殖和侵襲活性被抑制，MMP-2及MMP-9的表達水平均降低。結論Oct 4在胃癌組織和胃癌細胞系中高表達，并且敲除Oct 4會導致胃癌細胞的增殖和侵襲活性明顯減弱，降低MMP-2及MMP-9的表達水平。Oct 4在胃癌組織中的過量表達有助于胃癌的臨床診斷，同時Oct 4在胃癌的惡性腫瘤生物活性中發(fā)揮著重要作用。

[關鍵詞]八聚體結合-4；胃癌；BGC-823細胞；增殖；侵襲

胃癌是威脅人類健康常見的惡性腫瘤之一。盡管胃癌的手術、放療、化療和分子靶向等臨床治療方法較多，但療效均不滿意，患者5年生存率均較低，特別是在化療方面，目前仍無標準的一線化療方案。因此，隨著研究胃癌侵襲及轉移的相關分子機制的深入，尋找抗腫瘤侵襲轉移的關鍵治療靶點目標，從而開發(fā)出新一代抑制腫瘤侵襲轉移的抑制劑，對胃癌的防治具有非常重要的臨床意義。八聚體結合蛋白-4(octamer-bindingprotein-4，Oct4)主要表達于胚胎干細胞、生殖干細胞。對維持胚胎干細胞的多潛能性和自我更新能力具有極其重要的作用[1-2]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，Oct4基因表達于膀胱癌[3]、乳腺癌[4]、胰腺癌[5]、骨和軟骨瘤[6]中，但在正常組織中不表達。也有研究報道，通過慢病毒載體轉染并沉默特定基因在胃癌細胞的表達，可以抑制胃癌細胞的生長[7]。因此，筆者推測Oct4可能在胃癌的發(fā)生、進展、轉移和預后中起著重要作用。本研究檢測Oct4基因在胃癌組織和不同分化程度胃癌細胞株中的表達情況，并采用RNA干擾技術沉默Oct4基因的表達，以研究其表達水平對胃癌細胞增殖和侵襲力的影響。現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1標本收集

收集上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院2014年10月至2015年10月20例胃癌患者手術切除的癌組織及其對應的癌旁正常組織標本。所有患者在手術前均未接受過局部或全身治療。所有標本取下后立刻用液氮-80 ℃凍存。本研究經(jīng)上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準通過，并獲得所有患者的知情同意書。

1.2細胞和主要試劑

MKN-28、SGC-7901、BGC-823分別為高、中、低分化人胃癌細胞系，GES-1為胃黏膜正常細胞。上述細胞均由本實驗室保存。TRIzol試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，RT-PCR試劑盒購自Fermentas，細胞蛋白RIPA裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，Oct siRNA(human)序列及干擾轉染(siRNA)購自Qiagen公司，ECM膠、Oct3/4及GAPDH兔抗人抗體購自Sigma公司，MMP-2和MMP-9多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，侵襲性小室購自Corning公司，熒光定量PCR的引物均由Invitrogen公司提供。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)及轉染上述細胞用RPMI-1640或DMEM(GIBCO-BRL)培養(yǎng)基培養(yǎng)，補充10%胎牛血清、100 U/ml青霉素以及100 mg/ml鏈霉素，置于37 ℃、含5% CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。當胃癌BGC-823細胞生長密度至70%～80%時，按照轉染說明書進行轉染。依據(jù)轉染類型，將BGC-823細胞分為3組：Oct4 siRNA(干擾作用的siRNA轉染BGC-823細胞)組、陰性siRNA組(不具有任何干擾作用的siRNA轉染BGC-823細胞)、對照組(未轉染任何siRNA的BGC-823細胞)。

1.3.2RT-PCR檢測從標本中取100 mg腫瘤組織,剪碎后加入一定量TRIzol(Invitrogen)，按常規(guī)方法提取總RNA，采用逆轉錄系統(tǒng)試劑盒(Fermentas)獲取cDNA，以GAPDH為內參照進行Oct4基因的RT-PCR。根據(jù)GenBank中Oct4 cDNA序列設計引物，上游引物為5′-CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAA￣GCTG-3′，下游引物為5′-CCACATCGGCCTGTGTATATccCAG-3′，產(chǎn)物大小為140 bp。上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3′，下游引物為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，產(chǎn)物大小為138 bp。PCR反應條件為：預變性95 ℃ 15 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，45個循環(huán)。PCR結束后，95 ℃變性1 min，冷卻至55 ℃，使DNA雙鏈充分結合。從55 ℃開始到95 ℃，每次增加0.5 ℃，保持4 s，同時讀取吸光度，制作溶解曲線，以目的基因與GAPDH的比值進行定量分析。每個樣本重復3次。

1.3.3Western blot檢測當細胞生長至接近80%匯合時，用胰酶將細胞消化成單個細胞后再收獲細胞，加入蛋白裂解液RIPA(含終濃度為1 mmol的PMSF及1%的蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30 min，收集細胞，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min(r=3.5 cm)，取上清BCA測蛋白濃度，取40 μg蛋白樣品，進行12% SDS-PAGE電泳，然后用15 V轉印1 h至硝酸纖維素薄膜，轉印結束后將膜放入封閉液中37 ℃封閉2 h；加入一抗4 ℃過夜，PBST洗膜3次后，加入二抗孵育，室溫輕搖1 h，洗膜后用ECL化學發(fā)光。圖像經(jīng)掃描后，用圖像分析軟件Band Scan 5.0進行吸收度積分值分析，計算相對表達率(實驗灰度值/內參灰度值)。實驗重復3次。

1.3.4MTT檢測細胞增殖將對數(shù)生長期的細胞接種到%孔板中，每種細胞每天設3個副孔，每孔2 000個細胞，每孔中加0.1 ml含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。向第1天檢測孔中每孔加20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，將細胞培養(yǎng)液上清棄去，每孔加入100 μl DMSO，搖床混勻約5 min。酶標儀490 nm比色(PBS緩沖液調零)，連續(xù)檢測5 d，繪制腫瘤細胞生長曲線。本實驗獨立重復3次。

1.3.5細胞遷移和侵襲實驗上述細胞在轉染后48 h進行Transwell實驗。遷移實驗中，將5×104個細胞加入上層的無血清培養(yǎng)基中；侵襲實驗中，將1×105個細胞加入上層的無血清培養(yǎng)基中；下層小室為含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育24 h后，用甲醇固定遷移或侵襲至下層的細胞并用0.1%的結晶紫染色，并用IX71倒置顯微鏡計數(shù)。實驗獨立重復3次。

1.4統(tǒng)計學處理RT-PCR、Western-blot均采用不同實驗批次的標本重復3次，RT-PCR產(chǎn)物的量及Western-blot表達量均用內參β-actin校正，相對恢復以均數(shù)±標準差(x±s)表示；根據(jù)3次實驗結果進行ANOVA統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1Oct4在胃癌組織及不同胃癌細胞株中的表達

RT-PCR檢測20例胃癌組織標本結果顯示，癌組織中Oct4的表達水平高于癌旁組織(圖1A)；4株細胞系檢測結果發(fā)現(xiàn)，Oct4在正常胃黏膜細胞膜細胞株GES-1不表達，胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823中均表達，但是各細胞株的表達程度有所不同，分化程度越低的細胞系表達水平越高(圖1B)；通過Westernblot檢測上述4株細胞中Oct4的表達，胃癌細胞株均表達，但是在GES-1中未發(fā)現(xiàn)Oct4蛋白的存在(圖1C、D)。

注：GSE-1、MKN-28、SGC-7901、BGC-823為胃癌細胞株。A為RT-PCR檢測Oct4在腫瘤組織中的表達；B為RT-PCR檢測Oct4在腫瘤細胞系中的表達；C、D為Western blot檢測Oct4在腫瘤細胞系中的表達及灰度分析。與GES-1組比較aP<0.05，bP<0.01圖1　Oct4在胃癌組織及不同胃癌細胞株中的表達

2.2干擾Oct4表達對胃癌細胞增殖的影響

實驗結果顯示， Oct4在BCG-823胃癌細胞中表達水平最高，同時，在預實驗中發(fā)現(xiàn)50 mmol/L siRNA轉染效率最佳，因此在此濃度下利用該細胞作為模型進行功能缺失性研究，RT-PCR結果顯示細胞轉染48 h后Oct4表達水平較對照組下降，尤其以si-Oct4-2干擾效果最為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2A。在此基礎上，采用MTT增殖實驗觀察Oct4對細胞增殖的影響。與對照組相比，在不同觀察時間點24、48、72 h Oct4表達受抑制后其細胞增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2B。以上結果表明，Oct4的表達對胃癌細胞的增殖具有明顯的促進作用。

注：A為RT-PCR檢測BGC-823 siRNA的干擾效率；B為MTT法檢測BGC-823細胞增殖圖2　Oct4表達下調對胃癌細胞增殖的影響

2.3干擾Oct4表達對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響

與GES-1比較，BGC-823胃癌細胞轉移至小室下層的細胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明抑制Oct4表達引起腫瘤侵襲能力降低。見圖3。

圖3　Oct4表達下調對胃癌細胞手術BGC-823侵襲及遷移能力的影響電鏡圖

2.4干擾Oct4表達對MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

從圖4可以看出，Western blot結果顯示干擾后，MMP-2及MMP-9的表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),推測Oct4可能通過影響MMP-2和MMP-9的表達，調控胃癌細胞的遷移和侵襲。

圖4　干擾Oct4表達對胃癌細胞MMP-2及MMP-9表達影響的電泳圖

3討論

腫瘤的生長、轉移、復發(fā)是靠少數(shù)腫瘤干細胞不斷自我更新以及繁衍來維持和促成的。而Oct4又是自我更新的關鍵調節(jié)因子，因此，檢測Oct4在胃癌中的表達有助于理解其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展的關系。近年來，有研究結果顯示，Oct4基因在一些腫瘤細胞內高表達，如非生殖系統(tǒng)腫瘤細胞如胰腺癌pan-1細胞系、肝癌Mahlava細胞系、宮頸癌Hela細胞株、人乳腺癌MCF-7細胞系表達[2，8]。同樣在腫瘤組織中Oct4也有表達，如人乳腺痛及骨肉瘤組織[9]等。這說明Oct4基因在腫瘤的發(fā)生中有著重要促進作用。

從本實驗RT-PCR及Western blot結果顯示，20例胃癌組織標本結果顯示癌組織中Oct4的表達水平高于癌旁組織；4株細胞系檢測結果發(fā)現(xiàn)，Oct4在正常胃黏膜細胞膜細胞株GES-1不表達，胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823中均表達Oct4，但是各細胞株的表達程度有所不同，分化程度越低的細胞系表達水平越高。進一步對Oct4基因表達量高的低分化胃癌細胞BGC-823行siRNA轉染，轉染Oct4 siRNA的BCG-823細胞內Oct4 siRNA相對表達量及Oct4蛋白表達量明顯下降。在細胞增殖和侵襲性實驗中發(fā)現(xiàn)，轉染Oct4 siRNA后BGC-823細胞增殖能力顯著降低和細胞穿膜數(shù)量下降，表明Oct4基因表達下降導致胃癌細胞的增殖和侵襲能力下降，降低了胃癌細胞的惡性度。

同時，本研究通過Western blot技術檢測到MMP-2及MMP-9的表達均明顯下降。不難看出，抑制Oct4的表達對MMP-2及MMP-9的表達有顯著的抑制作用。而MMP-2和MMP-9在腫瘤侵襲和轉移中的作用己經(jīng)被深入研究，尤其在結腸癌、直腸癌、乳腺癌和腎癌等多種腫瘤中的作用己進行了大批量的臨床驗證[10]。Oct4以直接或間接的方式同時下調MMP-2和MMP-9，從多個層面抑制了結腸腫瘤的進展，體現(xiàn)出了極高的效率。盡管這些調控過程仍需進一步探索，但Oct4無疑成了胃癌形成及發(fā)展過程中基因網(wǎng)狀結構中非常重要的樞紐部分。

綜上所述，Oct4在胃癌組織和胃癌細胞系中能高表達，敲除Oct4基因后會導致胃癌細胞的增殖和侵襲活性明顯減弱，同時降低MMP-2及MMP-9的表達水平。Oct4在胃癌組織中的過量表達有助于胃癌的臨床診斷，有望成為早期檢測胃癌及評估患者預后的一個分子生物學指標，乃至成為藥物治療的新靶點。

[參考文獻]

[1]Burdon T, Smith A, Savatier P. Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells[J]. Trends Cell Biol, 2002, 12(9): 432-438.

[2]Looijenga LH, Stoop H, de Leeuw HP, et al. POU5F1 (OCT3/4) identifies cells with pluripotent potential in human germ cell tumors[J]. Cancer Res, 2003, 63(9): 2244-2250.

[3]Atlasi Y, Mowla SJ, Ziaee SA, et al. OCT-4, an embryonic stem cell marker, is highly expressed in bladder cancer[J]. Int J Cancer, 2007, 120(7): 1598-1602. DOI:10.1002/ijc.22508.

[4]Ezeh UI, Turek PJ, Reijo RA, et al. Human embryonic stem cell genes OCT4, NANOG, STELLAR, and GDF3 are expressed in both seminoma and breast carcinoma[J]. Cancer, 2005, 104(10): 2255-2265. DOI:10.1002/cncr.21432.

[5]Iki K, Pour PM. Expression of Oct4, a stem cell marker, in the hamster pancreatic cancer model[J]. Pancreatology, 2006, 6(4): 406-413. DOI:10.1159/000094317.

[6]Gibbs CP, Kukekov VG, Reith JD, et al. Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis[J]. Neoplasia, 2005, 7(11): 967-976.

[7]蔡世榮，王昭，陳創(chuàng)奇，等. 沉默PRL-3基因表達抑制胃癌生長研究[J]. 中華外科雜志, 2008, 46(8):618-621.

[8]Abate-Shen C. Homeobox genes and cancer: new OCTaves for an old tune[J]. Cancer Cell, 2003, 4(5): 329-330.

[9]Gibbs CP, Kukekov VG, Reith JD, et al. Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis[J]. Neoplasia, 2005, 7(11): 967-976.

[10] Park KS, Kim SJ, Kim KH, et al. Clinical characteristics of TIMP2, MMP-2, and MMP-9 gene polymorphisms in colorectal cancer[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2011, 26(2): 391-397. DOI:10.1111/j.1440-1746.2010.06504.

(本文編輯：王映紅)

Effects of Octamer-bindingprotein-4 on the proliferation and invasion of gastric carcinoma cells

Zhao Juan, Tian Yi, Li Fan

(Department of Gastroenterology, Minhang District Central Hospital, Shanghai 201199, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression of octamer-binding protein-4 (Oct 4) in the tissue of gastric carcinoma and 4 strains of cell line (MKN-28, SGC-7901, BGC-823 and GES-1), and to analyze the effects of the substance on the proliferation, migration and invasion of cells.Methods The canceration tissues of gastric carcinoma in 20 surgical patients and the normal tissues of 20 non-carcinoma patients were collected for the study. The expression levels of Oct 4 in the tissues of gastric carcinoma and 4 strains of cell line were detected by real time PCR and Western Blot. Following depletion of Oct 4, the proliferation activity of BGC-823 cells was detected by MTT assay, and the invasion of BGC-832 cells was detected by Transwell assay. Western Blot was further used to determine the expression levels of MMP-2 and MMP-9.ResultsReal time PCR revealed that there was a high expression level of Oct 4 mRNA in the tissue of gastric carcinoma, while low expression level was detected in the normal tissue. Western Blotting indicated that its expression level was the highest in BGC-832 cells. However, the down-regulation of Oct 4 would result in the reduction of proliferation and invasion activity, and the expression levels of MMP-2 and MMP-9 would be decreased.ConclusionThe elevated Oct 4 expression in the gastric carcinoma tissue and cells and Oct 4 gene knock-out would induce significant decrease in the proliferation of gastric carcinoma cells and cell invasion activity, and decrease the expression levels of MMP-2 and MMP-9. The over-expression of Oct 4 in the gastric carcinoma tissue would facilitate clinical diagnosis of the disorder, and it seemed that Oct 4 played an important role in the regulation of gastric carcinoma biological activity.

[Key words]Oct 4; Gastric carcinoma; BGC-823 cell; Proliferation; Invasion

(收稿日期：2015-10-19)

[中圖分類號]R735.2

[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.02.006

[通信作者]李凡，電子信箱：syrile@126.com

·論著·

[作者單位]201199上海，上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院消化內科