孫薏　席潔琳　蘇毅　鐘國成　張明慧　岳倫莉　王奎

(1.解放軍第452醫(yī)院 血液腫瘤科，四川 成都 610021；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院 血液科，四川 成都 610083)

?

·論著·

DC-CIK聯(lián)合氟達拉濱治療老年慢性淋巴細胞白血病的臨床研究*

孫薏1席潔琳1蘇毅2鐘國成1張明慧1岳倫莉1王奎1

(1.解放軍第452醫(yī)院 血液腫瘤科，四川 成都 610021；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院 血液科，四川 成都 610083)

【摘要】目的分析樹突狀細胞(DC)與細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(CIK)為效應(yīng)細胞的過繼免疫療法(DC-CIK免疫治療)聯(lián)合氟達拉濱治療老年慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者的免疫效應(yīng)和臨床療效。方法將48例老年CLL患者分為化療組21例，行氟達拉濱單藥化療和聯(lián)合組27例，除接受氟達拉濱化療外，還給予DC-CIK免疫治療。并檢測兩組患者治療前后的免疫學(xué)指標(biāo)，比較治療后兩組患者的臨床療效、骨髓抑制及感染發(fā)生情況。結(jié)果治療前，兩組患者的免疫學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后，聯(lián)合組患者血清Hsp70、Thl/Th2水平均較化療組顯著增加(P<0.05)；TGF-β、CD4+CD25+Treg陽性率較化療組顯著降低(P<0.05)。治療后，聯(lián)合組患者的PS評分、LDH等指標(biāo)均優(yōu)于化療組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后，化療組Ⅲ°及Ⅳ°骨髓抑制發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，感染發(fā)生率明顯高于聯(lián)合組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。總反應(yīng)率聯(lián)合組OR為77.78%，化療組OR為66.67%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論DC-CIK免疫治療與氟達拉濱聯(lián)合應(yīng)用于老年CLL患者具有良好的協(xié)同療效，是治療老年CLL患者的可選方法之一。

【關(guān)鍵詞】慢性淋巴細胞白血病(CLL)； 免疫療法； 樹突細胞； 殺傷細胞；化療

慢性淋巴細胞白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL) 是一種惡性的淋巴細胞克隆增殖性疾病，其發(fā)病呈逐漸上升趨勢，以老年患者居多，中位發(fā)病年齡為72歲[1-3]。近年來，嘌呤類似物氟達拉濱用于老年CLL的治療，取得了較高的緩解率[4]。但由于老年CLL患者生理及免疫功能退化，骨髓抑制等因素，常導(dǎo)致化療后骨髓抑制更加明顯，病人感染嚴(yán)重，危及生命。研究發(fā)現(xiàn)過繼免疫治療聯(lián)合化療具有協(xié)同抗腫瘤作用，同時，可增強化療后患者的免疫功能。過繼免疫很可能成為CLL未來的突破方向之一。DC細胞在機體特異性抗瘤應(yīng)答過程中起到了重要的作用，同時也是已知功能最強的抗原遞呈細胞。CIK細胞是在體外培養(yǎng)獲得的一群異質(zhì)細胞，具有強大的腫瘤殺傷活性。本研究旨在探討DC-CIK聯(lián)合氟達拉濱治療老年慢性淋巴細胞白血病的臨床療效，現(xiàn)報告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料2009年3月～2013年6月在我院和成都軍區(qū)總醫(yī)院治療的老年CLL患者共48例納入研究，根據(jù)患者就診的順序，采用數(shù)字表法隨機分為化療組21例和聯(lián)合組27例。所有患者按Binet分期均為B～C期，其中B期28例，C期20例，初治患者33例，復(fù)發(fā)或難治性患者15例。兩組患者的年齡、性別、分期等，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>60歲。②按照張之南“血液學(xué)診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)”(第3 版)確診為慢性淋巴細胞白血病[5]。③體力狀態(tài)(performance status，PS)評分為0～2分。④滿足化療和免疫治療適應(yīng)證并愿意接受治療。⑤預(yù)測生存期>3個月。⑥簽署知情同意書。⑦能配合研究及隨訪觀察者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患精神障礙疾病者。②有嚴(yán)重的心、肝、腎及胃腸等功能異常者。③有活動性重復(fù)癌者。④合并活動性結(jié)核及其他嚴(yán)重的感染性疾病者。⑤3周內(nèi)接受過大手術(shù)和(或)放療。⑥過敏體質(zhì)或?qū)Χ喾N藥物過敏者。本研究通過了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

表1　治療前兩組患者一般資料比較(n)

1.2方法

1.2.1DC和CIK的體外誘導(dǎo)參考相關(guān)文獻[6，7]將聯(lián)合組患者的外周血單個核細胞(PBMNC)分離出來，分離個數(shù)約(1.0～5.0)×1010/L，然后將分離出的這些細胞貼壁2小時，再將其中的懸浮細胞去除，并加入GM-CSF和IL-4(Peprotech公司產(chǎn)品)以誘導(dǎo)DC；將去除的懸浮細胞加入到含有IFN-γ、抗CD-3單克隆抗體、IL-2、IL-1的RPMI 1640培養(yǎng)液(Hyclone公司產(chǎn)品) 中以誘導(dǎo)CIK。

1.2.2治療方案化療組患者接受氟達拉濱單藥化療，氟達拉濱25 mg/(m2·d)，靜脈輸注，連用5天，28天為1個周期。聯(lián)合組除接受氟達拉濱單藥化療外，同時接受DC-CIK過繼免疫治療。為避免化療對PBMNC的抑制，聯(lián)合組患者于第1天化療前2 h采集PBMNC，然后開始化療周期。將分離的PBMNC在體外進行細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)第7天，將DC與CIK按1∶10的比例混合培養(yǎng)，在化療的第9～14天(分6次，1次/日)回輸給患者，每次回輸細胞(2.5～5.0)×109/L (內(nèi)毒素和無菌檢測依據(jù)“中華人民共和國藥典”2005版)。回輸時將細胞離心洗滌，于100ml生理鹽水重懸后2h內(nèi)靜脈滴注完畢 。聯(lián)合組患者均接受了3個周期以上的免疫治療。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1免疫指標(biāo)比較分別于治療前1天和治療后3個月，用定量ELISA試劑盒(Pharmingen公司產(chǎn)品)測定兩組患者的血清熱休克蛋白(Hsp)70、Thl/Th2比值、TGF-β水平；用流式細胞術(shù)檢測患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞表面標(biāo)志CD4+CD25+陽性率。

1.3.2臨床指標(biāo)比較 分別于治療前和治療后3個月記錄兩組患者的PS評分、檢測LDH水平。

1.3.3治療后骨髓抑制及感染發(fā)生情況比較 記錄治療后兩組患者骨髓抑制及感染的發(fā)生情況。

1.3.4兩組患者臨床療效比較 臨床療效參照張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)標(biāo)準(zhǔn)評判：分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial remission，PR)，總反應(yīng)(overall remission，OR) 率為CR+PR。

1.3.5不良反應(yīng)監(jiān)測 治療期間監(jiān)測患者體溫、脈搏、呼吸和血壓變化。不良事件依據(jù)CTCAE(Corn-non Terminology Criteria for Adverse Events)3.0版標(biāo)準(zhǔn)進行記錄。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。生存期分析采用Kaplan-Meier方法，Log-Rank檢驗；計數(shù)資料采用2檢驗；正態(tài)計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1免疫指標(biāo)比較治療前，兩組患者的外周血Hsp70、Thl/Th2、TGF-β、CD4+CD25+陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，治療后，聯(lián)合組患者血清Hsp70、Thl/Th2水平均比化療組增加(P<0.05)；TGF-β、CD4+CD25+陽性率比化療組降低(P<0.05)，見表2。

2.2臨床指標(biāo)比較治療后3個月，聯(lián)合組患者的體力狀態(tài)(PS)評分、乳酸脫氫酶(LDH)等指標(biāo)均優(yōu)于化療組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2　治療前后兩組患者免疫學(xué)指標(biāo)比較

表3　兩組患者PS評分和實驗室指標(biāo)比較±s)

注：與化療組比較，①P<0.05。

2.3治療后兩組患者骨髓抑制及感染發(fā)生情況比較化療組Ⅲ°及Ⅳ°骨髓抑制發(fā)生率與聯(lián)合組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但化療組感染發(fā)生率明顯高于聯(lián)合組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4　兩組患者骨髓抑制及感染發(fā)生情況比較[n(×10-2)]

注：與化療組比較，①P<0.05

2.4兩組患者療效比較治療3個月后聯(lián)合組27例患者中CR8例(29.63%)，PR13例(48.15%)，OR21例(77.78%)；化療組21例患者中CR6例(28.57%)，PR8例(38.10%)，OR14例(66.67%)；兩組患者OR差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5不良反應(yīng)聯(lián)合組有4例患者在細胞回輸后出現(xiàn)短暫的畏寒、低熱，對癥處理后癥狀消失，且再未發(fā)生。

3討論

慢性淋巴細胞白血病是一種B淋巴細胞克隆性增殖惡性血液系統(tǒng)疾病，在西方國家較為常見，近年來，隨著我國人口老齡化，其在我國的發(fā)病率有上升趨勢。CLL傳統(tǒng)的一線治療方案為苯丁酸氮芥、COP方案、CHOP方案，近年來以氟達拉濱為代表的核苷類似物在治療CLL上較以往有了很大進步。但老年CLL患者生理及免疫機能均退化，常常合并一種或多種慢性基礎(chǔ)疾病，且進展期CLL患者的骨髓造血和免疫功能均受到不同程度地抑制，導(dǎo)致患者對化療的耐受性明顯降低。故探索化療之外的新的治療方案( 如生物治療、免疫治療和靶向治療等) 對于改善老年CLL患者的預(yù)后具有重要意義。

DC細胞是主動和特異性免疫的關(guān)鍵，而CIK細胞是目前腫瘤殺傷活性最強的效應(yīng)細胞。理論上，以DC-CIK過繼免疫治療CLL具有以下優(yōu)勢[8]：①體內(nèi)瘤抗原被DC攝取后呈遞給CIK，可使CIK活化并主動殺傷瘤細胞。②CIK同時表達CD3和CD56，既有T淋巴細胞的抗瘤活性，又具備NK細胞的非MHC限制性殺瘤特性。③DC-CIK具有強大的免疫支持作用，可以在一定程度上修復(fù)患者的免疫缺陷。④降低化療副反應(yīng)發(fā)生率(CIK具有保肝和升白細胞作用)；⑤DC-CIK來源于PBMNC，無異體排斥，安全性好。

然而，這種治療方案受到多種因素的限制[9]：由于體內(nèi)腫瘤環(huán)境的免疫抑制，回輸?shù)腄C-CIK細胞無法保持相應(yīng)的抗腫瘤活性；此外，由于體內(nèi)瘤負荷太重導(dǎo)致效靶比低下，無法清除成塊的瘤灶。故有機整合不同治療方法的優(yōu)勢，才可能不斷提高CLL的臨床療效。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，化療可誘發(fā)骨髓抑制，損傷免疫系統(tǒng)，削弱免疫應(yīng)答。我們分別檢測了兩組患者化療前后Hsp70、Thl/Th2比值、CD4+CD25+細胞率、TGF-β水平，其中Hsp70能夠反映抗原激發(fā)免疫應(yīng)答的能力；Thl/Th2比值反映體內(nèi)抗腫瘤免疫狀態(tài)；CD4+CD25+細胞率反映了血液中調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory cell ，Treg )的比例；而TGF-β是由腫瘤細胞產(chǎn)生的一種免疫抑制因子。我們發(fā)現(xiàn)化療后患者的Hsp70、Th1/Th2升高，而Treg比例和TGF-β含量減低；與化療組相比，聯(lián)合治療組的Hsp70、Th1/Th2升高，CD4+CD25+細胞陽性率，TGF-β水平降低。提示化療可降低腫瘤細胞分泌的免疫抑制因子，減少調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)目，進而打破免疫耐受，促進免疫細胞及回輸?shù)腄C-CIK在體內(nèi)的快速增殖并活化；化療促使腫瘤細胞裂解釋放腫瘤抗原，進一步增強免疫細胞對腫瘤的識別和殺傷作用[10-13]。這充分說明DC-CIK過繼免疫治療聯(lián)合化療協(xié)同作用，可提高機體的免疫狀態(tài)。

LDH、PS評分、OR等指標(biāo)與CLL的病情發(fā)展及療效判斷密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在LDH和PS評分上，對照組：PS評分(2.61±0.42)、LDH(236±23.88)mmol/L；聯(lián)合組：PS評分(2.19±0.33)、LDH(176±24.18)mmol/L，聯(lián)合組與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異，進一步證實聯(lián)合組較對照組療效有所提高，且能改善患者臨床癥狀。聯(lián)合組Ⅲ°及Ⅳ°骨髓抑制發(fā)生率低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；感染發(fā)生率明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在骨髓抑制無明顯差異的情況下患者感染率明顯下降，這說明DC-CIK可通過打破機體免疫抑制狀態(tài)來提升患者免疫潛能。在化療療效上比較，聯(lián)合組OR為77.78%，化療組OR為66.67%，聯(lián)合組較對照組療效有所提升，然而考慮納入病例數(shù)有限的原因，我們沒有得出統(tǒng)計學(xué)差異。本研究結(jié)果提示：化療可以減輕體內(nèi)腫瘤負荷，DC-CIK可以在此基礎(chǔ)上進一步殺滅隱匿潛在的癌細胞，增強患者的免疫功能，減輕毒副損傷[14]，從而提高生活質(zhì)量和臨床療效。二者的結(jié)合具有良好的協(xié)同效果。

4結(jié)論

氟達拉濱聯(lián)合DC-CIK治療老年CLL能下調(diào)老年CLL患者腫瘤細胞的免疫抑制，二者具有良好的協(xié)同作用，這為老年CLL患者提供了新的治療途徑，具有良好的臨床應(yīng)用前景。但本研究病例數(shù)較少，其確切的作用機制及聯(lián)合治療方案優(yōu)化等問題還需要深入地研究和論證，同時二者聯(lián)合運用可能存在的風(fēng)險與不確定性仍需長期的臨床觀察與探索。

【參考文獻】

[1]Ferlay J，Bray F，Pisani P，etal. GLOBOCAN 2002: Cancer Incidence，Mortality and Prevalence Worldwide[M].IARC Cancer Base No.5 Version 2.0. Lyon，F(xiàn)rance：IARCPress，2004.

[2]Horner M，Ries L，Krapcho M，etal.SEER Cancer Statistics Review，1975 -2006[M].Bethesda，MD：National Cancer Institute，2009.

[3] Rozman C，Montserrat E. Chronic lymphocytic leukemia[J]. N Engl J Med，1995，333( 16) ：1052 -1057.

[4]王欣，劉林，陳建斌，等. 氟達拉濱聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療慢性淋巴細胞白血病的臨床研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2009，38( 10) : 1211-1212.

[5]張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第3 版. 北京: 科學(xué)出版社，2007：139.

[6]孫薏，張聰，陳健，等．自體樹突細胞聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞過繼治療復(fù)發(fā)難治性骨髓瘤26例[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011，36(11)：1245-1246.

[7]Zhong G，Wang J，Xu M，etal．Enhanced maturation and functional capacity of dendritic cells induced by mannosylated L2 domain of ErbB2 receptor[J].Scand J Immanol，2005，62(2)：108-116.

[8]Rosenblatt J，Avigan D．Cellular immunotherapy for multiple mye-loma[J].Best Pract Res Clin Haematol,2008，21(3)：559-577.

[9]Huang X，Huang G，Song H，etal. Preconditioning chemotherapy with paclitaxel and cisplatin enhances the antitumor activity of cytokine induced-killer cells in a murine lung carcinoma model[J]. Int J Cancer，2011，129(3)：648-652.

[10] 龔非力. 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第3版.北京: 科學(xué)出版社, 2009: 122-123.

[11] Beyer M， Kochanek M，Darabi K，etal． Reduced frequencies and suppressive function of CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine[J]. Blood，2005，106(6)：2018-2025.

[12] Wang X，Zheng J，Liu J，etal. Increased population of CD4(+)CD25(+)，regulatory T cells with their higher apoptotic and proliferating status in peripheral blood of acute myeloid leukemia patients[J]. Eur J Haematol，2005，75(6)： 468-476.

[13] 黃建霞, 張連生, 易良才, 等. 急性白血病患者外周血Treg細胞與Th17 細胞的相關(guān)性[J]. 中國腫瘤生物治療雜志，2011，17(4):430-433.

[14] 呂章春，陳海祥，李可，等. 經(jīng)誘導(dǎo)健康人與腫瘤患者CIK 和DC-CIK對肺癌細胞殺傷作用的比較研究[J]. 腫瘤學(xué)雜志，2009，15(6): 530-533.

The clinical study of DC-CIK combined with fludarabine in treatment of elderly chronic lymphocytic leukemia

SUN Yi1,XI Jielin1,Zhong Guocheng1,et al

(1.DepartmentofHematologyandOncology,PLA452Hospital,Chengdu610021,China；2.DepartmentofHematology，GeneralHospitalofChengduMilitaryRegion，Chengdu610083,China)

【Abstract】ObjectiveThis study was aimed to evaluate the immunological effect and clinical effect of immunotherapy which consist of dendritic cells (DC) and cytokine-induced killer cell(CIK) combined with fludarabine on senile patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL). Methods48 senile patients with CLL were assigned to chemotherapy group and joint group. 21 patients of chemotherapy group were treated by fludarabine only. 27 patients of joint group were treated by adoptive immunotherapy (DC-CIK) combined with fludarabine. At the same time, a variety of immunological indexes of all patients before and after treatment were recorded. After treatment, the clinical effect, myelosuppression and infection between two groups was compared. ResultsAfter treatment, the immunological indexes of all patients were better than that before treatment (P<0.05). After treatment, the incidence of III°and IV°of myelosuppression in chemotherapy was higher than that of the joint group, but there was no significant difference(P>0.05). The infection incidence of chemotherapy group was significantly higher than that of joint group (P<0.05). After treatment, the quality of life and clinical index in joint group were better than that of chemotherapy group (P<0.05). The overall response (OR) rate of the joint group and chemotherapy group were 77.78% and 66.67%, respectively (P>0.05). ConclusionFludarabine and DC-CIK have good synergistic therapeutic effect for elderly CLL.

【Key words】Chronic lymphocytic leukemia； Immunotherapy； Dendritic cells； Cytokine-induced killer cell； Chemotherapy

(收稿日期：2015-07-07； 編輯： 陳舟貴)

【中圖分類號】R 733.7

【文獻標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.04.015

通訊作者：蘇毅,E-mail:suhang1234@hotmail.com;鐘國成,E-mail:18716354367@163.com

基金項目：四川省衛(wèi)生廳科研課題(110490)