何靜波 張浩楠 田彩云 鄭延澤 武海軍 楊玉梅

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙 包頭 024000))

蒙藥嘎日迪-13對(duì)腦缺血損傷大鼠不同時(shí)相血清及腦組織不同腦區(qū)P-selectin含量及表達(dá)的影響

何靜波 張浩楠 田彩云 鄭延澤 武海軍 楊玉梅*

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙 包頭 024000))

目的：研究蒙藥嘎日迪-13對(duì)腦缺血損傷大鼠不同時(shí)相血清中P-selectin含量及腦中P-selectin表達(dá)量的影響。方法:360只雄性SD大鼠隨機(jī)分為腦缺血模型組、假手術(shù)組、嘎日迪-13大、中、小劑量組，每組又隨機(jī)分為6個(gè)時(shí)相組即1 h、6 h、12 h、24 h、72 h與120 h組，灌胃給藥，1次/d，連續(xù)27天后，線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后取材測(cè)定血清中P-selectin含量，免疫組化法測(cè)定腦組織中P-selectin的表達(dá)。結(jié)果:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、血清中P-selectin含量、腦組織中P-selectin表達(dá)量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，噶日迪-13給藥組可明顯降低腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、血清中P-selectin含量、腦組織中P-selectin表達(dá)量(P<0.01或P<0.05)。結(jié)論:蒙藥嘎日迪-13可明顯降低血清中P-selectin含量、腦組織中P-selectin表達(dá)量，提示蒙藥嘎日迪-13抑制炎癥因子P-selectin表達(dá)可能是其對(duì)腦缺血保護(hù)作用的機(jī)制之一。

蒙藥；嘎日迪-13；腦缺血；大鼠； P-selectin

蒙藥嘎日迪-13由甘草、石菖蒲、沉香、肉豆蔻、磁石(煅)、木香、麝香、草烏(制)、訶子、珊瑚(制)、丁香和禹良土13味藥組成，是蒙醫(yī)常用的治療心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的傳統(tǒng)方劑之一，主治半身不遂、左癱右瘓、口眼歪斜、言語(yǔ)不清、筋骨疼痛、神經(jīng)麻痹、風(fēng)濕、關(guān)節(jié)疼痛、四肢麻木、腰腿不利等癥狀。藥理實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明[1-6]，蒙藥嘎日迪-13對(duì)缺血性腦損傷具有明顯的保護(hù)作用。

腦缺血再灌注損傷與黏附分子介導(dǎo)的白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞黏附關(guān)系密切，選擇素是近年來(lái)新定義的一類細(xì)胞黏附分子。實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)腦缺血再灌注時(shí)P-selectin表達(dá)上調(diào)，白細(xì)胞在P-selectin的介導(dǎo)下從血中遷移至腦組織，釋放有害物質(zhì)，進(jìn)而造成腦組織損傷[7]。

本研究通過(guò)測(cè)定腦缺血后大鼠不同時(shí)相血清中P-selectin的含量、不同腦區(qū)P-selectin表達(dá)量的影響，探討腦缺血后嘎日迪-13的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑：嘎日迪-13，內(nèi)蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司(金山)蒙藥廠，批號(hào)：080905；戊巴比妥鈉，佛山市化工實(shí)驗(yàn)廠進(jìn)口分裝，批號(hào)：860901；青霉素(400萬(wàn)u/瓶)，華北制藥公司；P-selectinELISA試劑盒，上海彩佑試劑公司；P-selectin免疫組化試劑盒，北京博奧森；PV-6000通用型二抗試劑盒，6mL；ZLI-9018 DAB kit 3mL；PBS緩沖液(0.01M;pH=7.2～7.4)；檸檬酸鹽修復(fù)液(pH=6.0；0.01M)。其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器：RT-6000全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)雷杜公司；RT-2600C自動(dòng)洗板機(jī)，美國(guó)雷杜公司；MTS 2/4酶標(biāo)板振蕩器，德國(guó)IKA公司；Leica 2135石蠟病理切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；YB-7B病理組織包埋機(jī)，安徽電子科學(xué)研究所；ZT-12P生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；QP切片漂烘儀，安徽電子科學(xué)研究所；Leica激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica公司； TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，雄性，清潔級(jí)，360只，體重200±50g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，許可證編號(hào)：SCXK(京)2011-0012。環(huán)境溫度為22～26℃，按每籠6只飼養(yǎng)，試驗(yàn)期間各鼠均自由進(jìn)行飲水?dāng)z食。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制備：360只雄性SD大鼠隨機(jī)分為：腦缺血模型組(vehicle control，n=72)，假手術(shù)組(n=72)，嘎日迪-13大劑量組(Garidi13 large dose group，Garidi L,n=72)1.2g/100mL，嘎日迪-13中劑量組(Gridi13 middle dose group，Garidi M,n=72)0.6g/100mL，嘎日迪-13小劑量組(Garidi13 small dose group，Garidi S,n=72)0.3g/100mL，每個(gè)劑量組下分6個(gè)時(shí)相即1h、6h、12h、24h、72h與120h。各組大鼠均進(jìn)行灌胃給藥(2mL/100g，模型組與假手術(shù)組給予等體積生理鹽水)，連續(xù)27d，1次/d，末次給藥后1h開(kāi)始造模。模型制備采用改良Zea Longa[8]等的線栓法加以改良制作大腦中動(dòng)脈缺血模型。

2.2 神經(jīng)功能評(píng)分:采用Zea Longa[8]五級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

2.3 取材:于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)眼眶取血，室溫放置2h，離心(3000r/min)取血清凍存?zhèn)溆茫灰?%戊巴比妥鈉(0.1mL/100g)麻醉大鼠，開(kāi)胸暴露心臟，用室溫生理鹽水通過(guò)左心尖部，沿升主動(dòng)脈灌注沖血，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，可見(jiàn)右心耳流出液體的顏色逐漸由鮮紅色變?yōu)榈t色,至基本無(wú)色為止，換4%甲醛灌流，至大鼠肢體、尾巴僵直，即表明固定成功。開(kāi)顱取腦，缺血側(cè)腦組織樣本放置于4%甲醛內(nèi)固定24h。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 血清中P-selectin含量測(cè)定：嚴(yán)格按照試ELISA劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.4.2 免疫組化檢測(cè)大鼠缺血腦組織不同區(qū)域P-selectin表達(dá)：將固定好的腦組織樣本沖洗脫水后用石蠟包埋，切成3～4μm薄片，65℃烤片1h待用，其余步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，顯微鏡下觀察。 P-selectin陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞漿棕黃色深染，高倍鏡下(×400)隨機(jī)觀察缺血區(qū)域不重疊的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)P-selectin胞漿陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果:與假手術(shù)組比較，各時(shí)相腦缺血模型組神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(*P< 0. 01)，說(shuō)明大鼠局灶性腦缺血模型制作成功；各時(shí)相嘎日迪-13大、中、小劑量組與模型組比較，神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(**P< 0. 01)；各劑量組之間比較，神經(jīng)功能評(píng)分不存在顯著差別(***P>0. 05)。見(jiàn)表1。

表1 嘎日迪-13在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

注：圖示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。與假手術(shù)組比較*P<0.01；與模型組比較**P<0.01。

3.2 嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠血清中不同時(shí)相P-selectin含量變化的影響:與假手術(shù)組比較，各時(shí)相腦缺血模型組大鼠血清中P-selectin含量明顯升高(P< 0. 01)；與腦缺血模型組比較，各時(shí)相扎沖-13味大、中、小劑量劑量組大鼠血清中P-selectin含量明顯降低(P<0. 05)；劑量組各時(shí)相之間比較，大鼠血清中P-selectin含量不存在明顯差別(P>0. 05)。見(jiàn)表2。

表2 扎沖-13味在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠血清中P-selectin含量的影響

注：為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。與假手術(shù)組比較※※P<0.01；與模型組比較##P<0.01。

3.3 嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠不同腦區(qū)P-selectin表達(dá)的影響

3.3.1 嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠大腦海馬中P-selectin表達(dá)的影響:與假手術(shù)組比較，各時(shí)相腦缺血模型組大鼠海馬中P-selectin表達(dá)量明顯升高(P< 0. 01)；與腦缺血模型組比較，12h、24h、72h、120h時(shí)相嘎日迪-13大、中、小劑量劑量組大鼠海馬中P-selectin表達(dá)量明顯降低(P<0. 01)，1h和6h時(shí)相組大、中劑量劑量組大鼠海馬中P-selectin表達(dá)量明顯降低(P<0. 01)；劑量組各時(shí)相之間比較，中劑量組1h時(shí)相組大鼠海馬中P-selectin表達(dá)量不存在明顯差別(P>0. 05)。見(jiàn)表3。

表3 嘎日迪-13在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬中P-selectin表達(dá)量的影響

注：圖示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。與假手術(shù)組比較1)P<0.01；與模型組比較2)P<0.01。

3.3.2 嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠大腦紋狀體中P-selectin表達(dá)的影響：與假手術(shù)組比較，各時(shí)相腦缺血模型組大鼠紋狀體中P-selectin表達(dá)量明顯升高(P< 0. 01)；與腦缺血模型組比較，各時(shí)相嘎日迪-13大、中、小劑量劑量組大鼠紋狀體中P-selectin表達(dá)量明顯降低(P<0. 01)；1h、6h時(shí)相各劑量組各時(shí)相之間比較，大鼠紋狀體中P-selectin表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0. 05)；嘎日迪-13大劑量劑量組與中、小劑量組比較，大鼠紋狀體中P-selectin表達(dá)量明顯降低(P<0. 01)。見(jiàn)表4。

表4 嘎日迪-13在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠紋狀體中P-selectin表達(dá)量的影響

注：圖示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。與假手術(shù)組比較※※P<0.01；與模型組比較##P<0.01。

3.3.3 嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)中P-selectin表達(dá)的影響： 與假手術(shù)組比較，各時(shí)相腦缺血模型組大鼠大腦皮質(zhì)中P-selectin表達(dá)量明顯升高(P< 0. 01)；與腦缺血模型組比較，12h、24h、72h、120h時(shí)相嘎日迪-13大、中、小劑量劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中P-selectin表達(dá)量明顯降低(P<0. 01)，1h和6h時(shí)相組嘎日迪-13大、中劑量劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中P-selectin表達(dá)量明顯降低(P<0. 01)；劑量組各時(shí)相之間比較，中劑量組1h時(shí)相組大鼠大腦皮質(zhì)中P-selectin表達(dá)量不存在明顯差別(P>0. 05)。見(jiàn)表5。

表5 嘎日迪-13在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)中P-selectin表達(dá)量的影響

注：圖示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。與假手術(shù)組比較※※P<0.01；與模型組比較##P<0.01#P<0.05。

4 討論

腦缺血損傷后，炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)可誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)而加重腦組織損傷。炎癥因子可以作用于血管內(nèi)皮，引起腦水腫，并破壞血腦屏障的正常生理結(jié)構(gòu)和功能，而炎癥反應(yīng)可引起局部腦血管痙攣或栓塞，進(jìn)一步加重腦組織缺血缺氧。經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究表明提示炎癥反應(yīng)對(duì)缺血腦組織是一把雙刃劍，早期的炎癥反應(yīng)會(huì)加重神經(jīng)細(xì)胞的損害作用[9]，而晚期炎癥反應(yīng)有益于神經(jīng)細(xì)胞的再生和恢復(fù)[10]。在針對(duì)腦缺血再灌注損傷的研究中已經(jīng)證實(shí)，腦缺血后腦組織出現(xiàn)病理改變，缺血程度較輕的部位大多出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，而缺血程度較重的部位則出現(xiàn)細(xì)胞壞死；目前針對(duì)腦組織病理形態(tài)學(xué)學(xué)研究較多的是腦組織的海馬、紋狀體、大腦皮層等區(qū)域。

P-selectin是存在于血小板和內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜上的跨膜糖蛋白，通常儲(chǔ)存于內(nèi)皮細(xì)胞的分泌顆粒中， 表達(dá)于活化的內(nèi)皮細(xì)胞和，活化的血小板經(jīng)刺激后數(shù)分鐘內(nèi)即遷移到內(nèi)皮細(xì)胞表面,主要參與介導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的起始粘附，在白細(xì)胞黏附的前期起著重要作用。研究表明[11],血小板上的P-selectin在腦缺血時(shí)能通過(guò)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞與血小板相互作用或血小板聚集,使中性粒細(xì)胞移行和黏附,促進(jìn)微血栓在損傷組織的毛細(xì)血管內(nèi)形成。在缺血性腦損傷中，P -selectin介導(dǎo)了起始黏附作用，作用時(shí)間短暫且是可逆的，E-selectin則介導(dǎo)了持續(xù)性的粘附作用。

本實(shí)驗(yàn)中，腦缺血后模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和血清P-selectin含量及腦內(nèi)P-selectin表達(dá)明顯升高，表明腦缺血模型建立成功，嘎日迪-13各給藥組血清P-selectin及其在不同腦區(qū)的表達(dá)顯著降低，表明嘎日迪-13保護(hù)腦缺血作用機(jī)制可能為抑制炎癥因子，而抑制P-selectin表達(dá)是其有效機(jī)制之一。

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2016年9月22日收稿

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)81160560

何靜波，女，碩士研究生;研究方向：心腦血管與中蒙藥藥理研究;E-mail:63403584@qq.com，Tel:13948420925

*通訊作者：楊玉梅, 女，教授，Tel:13847230457,E-mail:yym457@aliyun.com

R291.2

A

1006-6810(2016)12-0034-04