陳浩宇　王茜　陳潔

200433　上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內(nèi)科

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·論著·

IL-18及趨化因子CX3CL1在慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化中的表達及其意義

陳浩宇王茜陳潔

200433上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內(nèi)科

【摘要】目的觀察IL-18及趨化因子CX3CL1在慢性胰腺炎(CP)大鼠胰腺組織中的表達及其意義。方法雄性Wistar大鼠按分層隨機法分為對照組和CP組。采取尾靜脈單次注射8 mg/kg體重二丁基二氯化錫(DBTC)造模，對照組注射等容積生理鹽水。4周后處死大鼠，取胰腺組織行病理檢查并評分，采用免疫組化染色法檢測胰腺組織IL-18及CX3CL1蛋白表達。結果造模4周后CP組大鼠死亡2只，存活8只，經(jīng)病理學檢查證實6只大鼠CP造模成功，成功率為60%。CP組大鼠胰腺組織結構異常、腺泡萎縮、纖維化、水腫、炎癥細胞浸潤評分分別為(2.5±0.4)、(1.9±0.8)、(2.2±0.6)、(0.6±0.4)、(1.8±0.6)分；對照組分別為0、0、0、(0.3±0.4)、0分。CP組大鼠胰腺各項評分均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。CP組胰腺組織IL-18表達量為35 670±11 878，較對照組的187±134顯著升高；CX3CL1表達量為27 416±7 563，亦較對照組的112±598顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。結論CP時胰腺組織高表達IL-18及CX3CL1，兩者可能參與CP纖維化的病理過程。

【關鍵詞】胰腺炎，慢性；纖維化；白細胞介素18；趨化因子CX3CL1

慢性胰腺炎(CP)纖維化的過程是機體分泌多種生物因子激活胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells, PSC)，進而生成大量細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積在胰腺間質中，最終導致無法逆轉的病理性纖維化的過程。IL-18和趨化因子CX3CL1作為重要的炎癥因子，參與肝臟、腎臟等重要臟器的病理纖維化過程。胰腺纖維化和肝臟纖維化雖然病因不盡相同，但都以激活PSC為重要病理環(huán)節(jié)，然而目前關于胰腺纖維化組織IL-18和CX3CL1的表達鮮有研究報道。本研究檢測CP大鼠胰腺組織中IL-18與CX3CL1的表達，探討其與CP纖維化的關系。

材料與方法

一、動物模型制備及分組

雄性Wistar大鼠20只，體重160 g左右，購自第二軍醫(yī)大學動物實驗中心，清潔環(huán)境飼養(yǎng)2周，體重增至210 g左右。按分層隨機法將大鼠分為對照組、CP組，每組10只。二丁基二氯化錫(DBTC)購自Sigma公司，先用無水乙醇溶解DBTC，再與甘油以2∶3比例混合，采用經(jīng)大鼠尾靜脈注射DBTC 8 mg/kg體重方法制備大鼠CP模型[1]；對照組注射等容積生理鹽水。注射后禁食、水24 h，然后開放飲食，飼養(yǎng)4周。造模后1、2、3、4周測體重。

二、胰腺組織病理檢查

造模4周后斷頸處死大鼠，取0.3 cm×1 cm的胰腺組織條置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)行組織病理學檢查。由2位病理學醫(yī)師讀片，并參考van Westerloo等[2]標準從胰腺結構異常、腺泡萎縮、纖維化、水腫、炎細胞浸潤5個方面進行病理評分。

三、IL-18、CX3CL1蛋白表達檢測

采用免疫組織化學染色法檢測IL-18、CX3CL1蛋白表達，以PBS代替一抗作為陰性對照。兔抗鼠IL-18、CX3CL1多抗均購自Abnova公司，工作濃度均為1∶400；通用型IgG購自DAKO公司，最后DAB顯色、蘇木素襯染、鹽酸乙醇分化、烘片、封片。每張切片分別觀察3個高倍視野(×400倍)。胞核或胞質內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，依據(jù)不同細胞類型分別進行評分。無染色為0分；淺黃色為1分；淺褐色為2分；深褐色為3分。同時隨機選取10個高倍鏡視野，通過圖像分析軟件(Image-proplus-6，美國)測量視野中淺褐色、深褐色細胞的總吸光度的平均值(AOD)。

四、統(tǒng)計學處理

結果

一、CP大鼠生存率、成功率

造模4周后CP組大鼠死亡2只，存活8只，經(jīng)病理學檢查證實6只大鼠CP造模成功，成功率為60%。對照組存活率為100%。

二、大鼠體重變化

對照組大鼠1、2、3、4周的體重分別為(218.0±6.1)、(227.3±5.0)、(243.0±8.5)、(265.1±6.0)g；CP組大鼠分別為(190.0±9.0)、(198.1±6.3)、(209.1±8.7)、(218.1±9.9)g。CP組大鼠體重較同時點對照組大鼠顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。

三、胰腺組織病理變化

CP組大鼠胰腺呈暗黃色，萎縮纖薄，有硬結形成，未見出血壞死灶，肝臟表面可見彌漫性結節(jié)，脾大，內(nèi)臟黃染；鏡下見胰腺小葉間及小葉內(nèi)大量纖維組織增生，腺泡壞死、萎縮并呈空泡樣變，大量炎性細胞浸潤。對照組大鼠胰腺呈白色，質軟，肝臟呈暗紅色，質軟；鏡下未見異常(圖1)。

圖1　CP組(1A))、對照組(/1B)大鼠胰腺病理變化(HE　×400)

CP組大鼠胰腺組織結構異常、腺泡萎縮、纖維化、水腫、炎癥細胞浸潤評分分別為(2.5±0.4)、(1.9±0.8)、(2.2±0.6)、(0.6±0.4)、(1.8±0.6)分；對照組胰腺病理評分分別為0、0、0、(0.3±0.4)、0分。CP組大鼠胰腺各項評分顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為16.605、6.028、11.619、9.710、7.945，P值均<0.01)。

四、胰腺組織IL-18和CX3CL1蛋白表達

CP組、對照組大鼠胰腺組織IL-18蛋白表達的AOD值分別為35 670±11 878、187.3±133.6；CX3CL1的AOD值分別為27 416±7 563、112±597.7。CP組均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t值分別為2.987、3.466，P值均<0.05)。

CP組大鼠胰腺的腺泡細胞、胰管上皮細胞、血管上皮細胞、炎癥細胞、胰島細胞IL-18及CX3CL1蛋白表達量均顯著高于對照組胰腺組織，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(表1，圖2、3)。

表1　對照組和CP組胰腺組織各種類型細胞的IL-18、CX3CL1蛋白表達(分，

圖2　對照組胰腺組織IL-18(2A，2B)、CX3CL1(2C，2D)蛋白表達(免疫組化染色　×400)

圖3　CP組胰腺組織IL-18(3A，3B)、CX3CL1(3C，3D)蛋白表達(免疫組化染色　×400)

討論

IL-18是1995年Okamura等[3]在脂多糖誘導的小鼠中毒性休克肝中提取的，結構及信號轉導通路類似于IL-1家族，功能上更類似于IL-2家族，具有更強誘導干擾素IFN-γ生成的能力。IL-18主要由單核細胞和巨噬細胞分泌，也在其他細胞、組織廣泛表達。在生理情況下部分組織，如小腸上皮、肝臟、脾臟、神經(jīng)膠質細胞和星形細胞等也可結構性表達IL-18。IL-18最主要的一個生物學功能是可以誘導Th1細胞和NK細胞產(chǎn)生IFN-γ[4]。以往研究表明，IL-18與IL-18受體結合后直接導致IL-1受體相關激酶(IRAK)磷酸化，進而與腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF-6)形成復合物，激活NF-κB進入核內(nèi)，與IFN基因啟動子中特定的序列結合，激活IFN啟動子，進而促進IFN-γ生成，后者又可促進CX3CL1的高表達[5]。

CX3CL1是化學趨化因子CX3C亞家族中獨特成員，存在膜結合型和分泌型兩種類型，兼有趨化因子和黏附因子功能[6-7]。既往研究認為，介導白細胞遷移的經(jīng)典途徑是整合素依賴性的，即所有趨化因子必須與白細胞表面特定受體通過G-蛋白依賴機制促黏附因子整合素活化才能進一步引起白細胞的黏附和遷移[8]。CX3CL1的趨化因子區(qū)域表達在細胞膜外黏蛋白樣結構頂部，因它本身就是一種黏附因子，不依賴整合素即可發(fā)揮黏附作用。CX3CL1與CX3CR1結合可以增強細胞黏附，促進白細胞透過血管壁向炎癥部位遷移。在炎性部位的CX3CL1能誘導活化NK細胞，導致臨近的內(nèi)皮細胞裂解，并促進被捕獲的血中CX3CR1陽性細胞向組織內(nèi)轉移，發(fā)揮其黏附和遷移作用[9]。 膜結合型CX3CL1在血管內(nèi)皮細胞表面的表達可以被TNF-β、IL-21、IFN-γ等炎性因子上調，且IFN-γ、TNF-β能協(xié)同誘導趨化因子Fractalkine(FKN)的高表達[6-7]。

田軼倫等[10]探討不同濃度IL-18對人臍靜脈內(nèi)皮細胞FKN表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)25 μg/L是IL-18調節(jié)CX3CL1表達的有效起始濃度，并呈濃度依賴性上調內(nèi)皮細胞CX3CL1的表達，隨著IL-18濃度的升高，內(nèi)皮細胞對單核細胞趨化作用亦相應增強，而使用CX3CL1中和抗體后單核細胞遷移的數(shù)量明顯下降，提示IL-18上調CX3CL1表達后能夠通過其介導的趨化作用參與炎癥反應。王麗敏等[11]在研究阿霉素腎病大鼠時發(fā)現(xiàn)，IL-18結合蛋白能特異性結合IL-18，通過降低IFN-γ進而抑制IL-18活性及腎臟纖維化組織中腎血管內(nèi)皮細胞和腎小管上皮細胞CX3CL1的表達水平。Aoyama等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CX3CL1通過抑制肝臟Kupffer細胞和巨噬細胞的活化進而抑制肝臟纖維化，且CX3CL1特異性受體是丙型肝炎纖維化的一個高度易感因素[13]。雖然CP和慢性肝炎病因有別，但兩者纖維化發(fā)生和發(fā)展過程有著眾多相同之處。

本研究結果顯示，CP組胰腺組織IL-18和CX3CL1表達量均顯著高于對照組，CP大鼠胰腺中的腺泡細胞、胰腺導管上皮細胞、炎癥細胞、胰島細胞內(nèi)均有IL-18、CX3CL1的表達，因此可以推測，IL-18和CX3CL1參與了CP纖維化的病理過程。

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(本文編輯：屠振興)

IL-18 and CX3CL1 expression and function in the fibrosis of chronic pancreatitis rat

ChenHaoyu,ShenXiangguo,LiZhaoshen,XuCan.DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai, 200433China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of IL-18 and CX3CL1 in the tissue of chronic pancreatitis (CP) rat and explore its clinical value. MethodsMale Wistar rats were randomly divided into control group and CP group. CP was induced by dibutyltindich loride (8 mg/kg) injecsion into the tail vein and control group was given equal volume saline solution. The rats were sacrificed 4 weeks later. Pancreatic tissue was harvested for histological examination and immunohistochemical method was used to detected the expression of IL-18 and CX3CL. ResultsAt 4 weeks, 2 in CP group died and 8 survived. 6 rats were histological confirmed as CP and the success rate of mice model was 60%. The score for abnormal structure, acinar atrophy, fibrosis, edema, and inflammatory cells infiltration in rats of CP group was(2.5±0.4),(1.9±0.8),(2.2±0.6),(0.6±0.4),(1.8±0.6)in CP group, but 0, 0, 0,(0.3±0.4), 0 in control group. All the scores were greatly increased compared with controls. IL-18 level in pancreatic tissue was 35 670±11 878 in CP group, which was significantly enhanced compared with (187.3±133.6) in control group (P<0.05). CX3CL1 level was (27 416±7 563) in CP group, which was significantly increased compared with (112±598) in control group (P<0.05). ConclusionsIL-18 and CX3CL1 were over-expressed in pancreatic tissue of CP rats, which may participate in the pathogenesis of pancreatic fibrosis.

【Key words】Pancreatitis, chronic;Fibrosis;Interleukin-18;Chemokine CX3CL1

(收稿日期：2016-02-01)

Corresponding author:Chen Jie, Email: jiechen0115@sohu.com

基金項目：國家自然科學基金(81300352)

通信作者：陳潔，Email: jiechen0115@sohu.com

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.02.009

Fund program：National Natural Sceince Foundation of China(81300352)